Hongo champiñon (3 hongos)

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I
Prof. Javier Isidoro López Cruz
PRÁCTICA No. 8
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS-ENZIMÁTICOS DE LA
ENZIMA LACASA
La actividad de una enzima puede ser medida a través de la velocidad de formación del
producto o del sustrato utilizado durante la reacción catalizada enzimáticamente. Para algunas
enzimas son varios los procedimientos alternativos para medir su actividad. En algunos casos
es necesario utilizar una alta concentración de sustrato, para obtener una sensibilidad mayor.
OBJETIVO
Que el alumno aprenda determinar a partir los resultados experimentales los parámetros
cinéticos VMAX, KM y kcat de una enzima resultado de la actividad de un extracto crudo de
hongos
MATERIALES
1 Embudo de vidrio
24 Tubos
Papel filtro
1 Gradilla para tubos
1 Probeta de 100 mL
REACTIVOS
3 Vasos de precipitados de 100 mL
2,6 Dimetoxifenol (DMP) (PROFESOR)
2 Pipetas de 10, 5, 2 y 1 mL
Fosfato de sodio monobasico
1 Piceta con agua destilada
Fosfato de sodio dibasico
1 Vortex
ABTS
1 Palangana
Alumnos
1 Espectrofotómetro
Por equipo
2 Celdas para espectrofotómetro
Hongo champiñon (3 hongos)
2 Pipeta Pasteur
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES (EQUIPOS 3)
A. Solución amortiguador de fosfatos 50 mM, 1000mL pH 6.
B. Solución de 2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) 0.5mM, 250 mL en amortiguador de fosfatos
pH6.
PROCEDIMIENTO
Ensayo enzimático
C. Colocar los hongos por separado en un mortero, macerarlos con 50 mL de amortiguador
de fosfatos hasta obtener un macerado homogeneo. Filtrar este extracto
D. Programar el espectrofotometro en la opción de “cinética” con la siguientes condiciones:
Para la determinación con 2,6-DMP a =469 nm, tiempo de retardo = 0 minutos,
intervalos de 25 segundos, tiempo total 3 minutos.
E. Disponer 13 tubos de ensaye de la forma siguiente: preparar las diluciones del 2,6-DMP,
añadiendo al primer tubo 0.9 mL del sustrato correspondiente y 0.9 mL de amortiguador,
agitar y retirar de este tubo 0.9 mL adicionarlos al segundo tubo numero y adicionar 0.9 de
amortiguador. El procedimiento es sucesivo para los siguientes tubos, por lo cual la
concentración de cada tubo será de la mitad del anterior.
F. No Adicionar el extracto enzimatico hasta que prepare todas las diluciones y hasta
en el momento de realizar la medición. NOTA: para cada una de las disoluciones
efectuar un blanco espectrofotométrico, tratado en la misma forma, tubos en los
cuales solo se adiciona amortiguador en vez de extracto
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2,6 DMP (mL) Fosfatos (mL) Extracto
o Vol Total(mL) [2,6-DMP]
Amortiguador
(mL)
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
0.9
0.9
0.1
1.0
Desechar
G. Una vez preparados todos los tubos, ajustar el blanco espectrofométrico
correspondiente y adicionar rápidamente al tubo 1 la cantidad correspondiente de
extracto, agitar y empezar a anotar las lecturas cada 25 segundos hasta que se cumplan los
3 minutos.
H. Una vez concluida la cinética para el tubo 1, efectuar procedimiento (G) para el tubo 2 y
los demás tubos. No olvide agregar el extracto solo hasta acabar con el tubo anterior.
Ensayo de Proteina (Bradford)
En otros tubos efectuar 3 diluciones para los extractos de hongo hasta obtener un volumen
final de 800L de extracto. Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200L de Reactivo
de Bradford, agitar y reposar los tubos durante 10 minutos y tomar la lectura de la absorbancia
de cada tubo en la longitud de onda de 595 nm, previamente ajustando el espectrofotómetro
con un blanco de amortiguador de fosfatos tratado en la misma forma
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
o Construir las curvas de progreso (abs vs tiempo), respecto a las concentraciones de 2,6
DMP
o Determinar la velocidad de la enzima (-s) en Unidades internacionales de cada curva de
progreso, utilizando el coeficiente de extinción molar del sustrato oxidado (DMP= 49600
M-1cm-1)
o En base a las graficas anteriores, construir una gráfica (-s vs [s]) y determinar los
parámetros cinéticos, apoyándose en los diferentes modelos de determinación vistos en
teoría (Lineweaver-Burk y Eaddie-Hofstee.)
o Comparar los parámetros obtenidos experimentalmente con los investigados en literatura
para la enzima Lacasa de distintos hongos.
o Incluya en su investigación la eficiencia catalitica (cat) sabiendo que el peso molecular de
la enzima lacasa es de 78500 g/mol.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia de determinar VMAX, KM y kcat para una enzima?
2. ¿Qué nos indica el cociente kcat/KM y entre que valores se encuentra esta razón?
3. ¿Cuál es la diferencia de las constantes al ser calculadas por distintos métodos y cuál
método fue el mejor experimentalmente en su determinación?
4. ¿Los valores obtenidos son cercanos o lejanos de los reportados en la literatura para esta
enzima?
BIBLIOGRAFÍA
1) Aiba S., Humphrey A. E. y Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, Second Edition.
Academic Press Inc. London.
2) Bailey J. E. y Ollis D. (1978) Biochemical Engineering Fundamentals, 2ª Edition, Mc Graw-Hill,
USA.
3) Segel C. (1976) Enzyme Kinetics. Edition, John Wile & Sons. NY, USA.
4) Wang D. I., Cooney C. L., Demain A. L., Dunnill P., Humphrey A. E. and Lilly M. D.
(1979) Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley & Sons. NY. USA.