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Estudio de la respuesta de las variedades de
Sorgo bicolor (L) Monech cultivadas en Uruguay
a la inoculación con bacterias promotoras del
crecimiento vegetal
Dr Federico Battistoni, [email protected]
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas
División de Microbiología
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable
Interacción planta-bacteria
Interacción planta-bacteria
Simbióticas
Endófito
obligatorio
Endófito
facultativo
Epifíticas
Rizosféricas
S. meliloti – alfalfa
G. diazotrophicus – caña de
azúcar
Azospiriullum sp. – sorgo
A. chroococcum - arroz
P. fluorescens - alfalfa
• Coevolución planta – bacteria
• Grado de interacción
Endófitos bacterianos
•Bacterias que colonizan activamente los tejidos internos de las plantas y
establecen asociaciones (endosimbiosis), beneficiando a las mismas (PCV)
•Endófito verdadero: cuando se demuestra mediante técnicas microscópicas su
localización e identidad dentro de los tejidos vegetales
•Cumplir con el postulado de Koch: ser capaz de infectar nuevos hospederos
Endófitos y sus aplicaciones
(Ryan et. al., 2008)
Interacción planta-endófito
I-
I- Colonización del rizoplano
II- Infección de los tejidos
III- Colonización del cortex
II-
Pelo radicular
Zona de raíces laterales
IIIZona de pelos radiculares
Córtex
Zona de elongación celular
Endodermis
Xilema
nifH::gusA
Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal
• Directos: actúan sobre la planta
1. Fijación biológica del nitrógeno (FBN)
2. Producción de sustancias estimulantes del crecimiento
3. Incremento en la capacidad de absorción de minerales (Fe,P)
• Indirectos: actúan sobre otros componentes del ecosistema provocando un efecto
benéfico en la planta
1. Control Biológico
a. Competencia por los nutrientes del nicho
b. Producción de metabolitos secundarios tóxicos
c. Parasitismo
d. Inducción de la resistencia sistémica
Objetivo de la línea de investigación
Aportar a la sustentabilidad de cultivos de interés agronómico mediante el
empleo de bacterias endófitas promotoras del crecimiento vegetal, en
sustitución a la fertilización química
Modelos exitosos
Gluconacetobacer diazotrophicus PAL5- caña de azúcar (Saccharum officinarum)
Herbaspirillum seropedicae SmR1 – arroz (Oryza sativa)
Klebsiella pneumoniae 342-trigo (Triticum spp.)
Modelos de estudio en el laboratorio
 Festuca SFRO var. Don Tomás
 Canola (Brassica napus)

Sorgo dulce var. M81E (Sorghum bicolor)

Caña de azúcar (Saccharum officinarum)
Sorghum bicolor (L) Monech
• Sorghum bicolor (sorgo dulce) pertenecen a la familia de las Poaceae
• Es el quinto cultivo en importancia en el mundo
• A este cultivo se lo define como multipropósito (biocombustible, alimento, energía)
• Variedad utilizada en ALUR M81E, introducida de la Universidad de Kentucky USA
Objetivos
General
Determinar mediante estudios de interacción planta-bacteria si los probables
endófitos bacterianos asociados al sorgo dulce tienen un papel significativo en
promover el crecimiento vegetal de la variedad M81E
Específicos
1. Construir una amplia colección de probables endófitos bacterianos nativos
asociados a plantas adultas de la variedad M81E de interés para ALUR S.A.
2. Caracterizar bioquímica y molecularmente la colección construida e
identificar aislamientos de interés.
3. Estudiar la respuesta en ensayos de invernáculo y de campo de plantas de
sorgo dulce inoculadas con bacterias promotoras del crecimiento vegetal.
4. Determinar si los aislamientos promotores del crecimiento vegetal son
endófitos verdaderos.
5. Determinar el efecto de la fertilización química sobre el microbioma
Estrategia
Semillas, raíces y tallos
Construcción de una colección
Caracterización (PCV y PMI)
PF1
100
47
EU672801.1| Enterobacter arachidis Ah...
AJ853891.1| Enterobacter ludwigii EN-...
57
PC3
94
DQ504305.1|Pantoea dispersa LMG2603
100
PL2
JT26
54
97
U80196.1|Pantoea ananatis
100
AJ233423.1| Pantoea agglomerans DSM 3493
51
EF688009.1| Pantoea eucalypti LMG 24197
43
AJ233426.1| Rahnella aquatica (strain...
100
40
97
LT5
LT8
AF143245.1| Pseudomonas stutzeri
78
X06684.1| Pseudomonas aeruginosa ATCC...
JA5
72
71
100
EU184082.1| Pseudomonas lutea PSB2
D84020.1| Pseudomonas putida ATCC 12633
91
LF13
100
89
DQ095904.1| Pseudomonas fluorescens S16
JF5
37
JF1
87
D84013.1|Pseudomonas fluorescens ATCC...
71
X81665.1|Acinetobacter lwoffii(DSM2403)
JT25
100
X81660.1|Acinetobacter baumannii(DSM3...
91
AB166885.1| Stenotrophomonas koreensis
71
AM403589.2|Stenotrophomonas terrae st...
JF6
100
EU573216.1| Stenotrophomonas chelatip...
61
FJ404810.1| Stenotrophomonas sp. DNPA8
78
FJ748683.2| Stenotrophomonas pavanii ...
93
JL9
89
PL12
JC2
97 X95923.1|Stenotrophomonas maltophilia...
JT9
Identificación y
filogenia
JA15
87
LA2
HQ536002.1| Bacillus subtilis DP14
0.02
Ensayos de PCV
Ensayos de campo
PCV
Caracterización de la colección
Colección: 369 aislamientos
Diazótrofos (N) (nifH+/película de crecimiento)
146
Productores sideróforos (Fe)
22
PMI
Alto potencial biotecnológico
Productores AIA (ácido indol acético)
66
Solubilizadores de fosfatos (P)
25
Productores de proteasas
29
Productores de celulasas y hemicelulasas
5/3
Formadores de biopelículas
41
Mareque et.al., 2014; Heijo 2015
Identificación y filogenia
• Gran diversidad bacteriana
• Géneros nuevos reportados
como asociados a sorgo dulce
Árbol filogenético basado en las secuencias de
gen 16S ARNr de los aislamientos asociados a
sorgo dulce
Mareque et.al., 2014; Heijo 2015
Ensayos de promoción del crecimiento vegetal en invernáculo
Peso seco (g planta-1)
Altura Tallo
Diámetro Tallo
(cm)
(mm)
Raíz
Aéreo
Control Negativoa
13,50 a
4,84 a
0,74 a
0,86 a
Rhizobium sp. UYSB12
14,44 ab
4,90 a
1,05 c
0,95 abc
Rhizobium sp. UYSB13
16,00 b
4,44 a
1,09 c
1,07 cd
Enterobacter sp. UYSB34
14,95 ab
4,73 a
0,93 abc
1,02 bcd
Pantoea sp. UYSB45
16,25 b
4,79 a
1,01 bc
1,15 d
Azospirillum brasilense Sp7
14,30 ab
4,90 a
0,77 ab
0,94 ab
Aislamiento
Variedad de sorgo
dulce M81E
Rhizobium sp. UYSB13 y Pantoea sp. UYSB45 son endófitos verdaderos
Pantoea sp. UYSB45::gfp
A: raíces (630X) y
B: cofa de la raíz principal.
Rhizobium sp. UYSB13
Efecto de la fertilización química nitrogenada sobre la comunidad
endofítica y diazotrófica
+N
+N#(200#KgN/há)#
Raíz%
Tallo%
inferior%
Tallo%
superior%
-N#(0#KgN/há)##
Raíz%
Tallo%
inferior%
Tallo%
superior%
200 kgN/ha
Campo
-N
Extracción
de ADN
endofítico
Análisis por DGGE de la estructura y diversidad
de la comunidad endofítica y diazotrófica
0 kgN/ha
Mareque et.al., enviado
100
80
60
Estructura de la comunidad endofítica (16S ADNr)
Tallo Inferior 3 +N
80.9
Tallo Superior 1 +
76.4
Tallo Inferior 1 +N
81.0
75.7
Tallo
Tallo
+N
71.5
61.3
87.8
Tallo Superior 3 +
Tallo Superior 2 +
Tallo Inferior 1 -N
Tallo Inferior 3 -N
78.5
-N
88.4
71.6
Tallo Inferior 2 +N
Tallo Superior 1 -
Tallo Superior 2 -
Tallo Superior 3 -
50.7
Raíz 1 -N
-N
88.9
Raíz
Raíz
76.1
66.4
+N
85.7
 Dentro de
cada
órgano: las comunidades
se agrupan
según el
 Las
comunidades
se agrupan según
los órganos
tratamiento +/-N
Raíz 2 -N
Raíz 3 -N
Raíz 1 +N
Raíz 2 +N
Raíz 3 +N
100
80
60
40
Estructura de la comunidad endofítica-diazotrófica (nifH)
Tallo Inferior 1 -N
Tallo
inferior
94.1
Tallo Inferior 2 -N
64.1
Tallo
Tallo Inferior 3 -N
-N
-N1 -N
Tallo Superior
47.5
Tallo
superior
83.3
Tallo Superior 2 -N
80.9
37.8
Tallo Superior 3 -N
34.7
Raíz 1 -N
Se debe considerar la fertilización química a la hora
Raíz
3 -N
de modular el microbioma asociado con el fin Raíz
de
Tallo Superior 1 +N
Tallo Superior 2 +N
obtener el efecto benéfico a través de la inoculación
Tallo
Tallo Inferior 3 +N
bacteriana
Tallo Superior 3 +N
95.2
73.5
71.0
66.6
+N
Tallo Inferior+N
1 +N
51.2
94.1
90.8
Raíz 1 +N
Raíz
Raíz 2 +N
Raíz 3 +N
Parcela
acuerdo
al tallosegún
inferior/superior
En cada–N:
tratamiento
(+/-N): se
las
comunidades
seelagrupan
los órganos (51,2
las
Lascomunidades
comunidades
seagrupan
agrupandesegún
tratamiento
+/-N
y 37,8%)
Perspectivas
• Profundizar en los ensayos de promoción del crecimiento vegetal:
• en diferentes sistemas (invernáculo, campo)
• evaluar un amplio número de bacterias (diazótrofas)
• estudiar la estabiliadad del inóculo a lo largo del tiempo
• determinar cual es el mecanismo PCV
• Evaluar el efecto de la fertilización química nitrogenada:
• en la promoción del crecimiento vegetal
• en microbioma asociado a sorgo dulce
• en la expresión de genes específicos (funcionalidad)
Formación de recursos humanos
• 2011-2014: Cintia Mareque. Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas, PEDECIBA. Apoyo ANII.
“Producción sustentable en el cultivo de sorgo dulce: búsqueda de bacterias promotoras del
crecimiento vegetal asociadas a Sorghum bicolor (L) Monech para su futura aplicación biotecnológica”.
• 2013-2014: Gabriela Heijo. Tesina de Grado. Facultad de Ciencias-UdelaR. Apoyo ANII.
“Construcción y caracterización de una colección de probables endófitos diazótrofos nativos asociada
a la variedad M81E de sorgo dulce (Sorghum bicolor)”
Producción científica
• Mareque, C., C. Taulé, M. Beracochea and F. Battistoni. 2014. Isolation, characterization and plant
growth promotion effects of putative bacterial endophytes associated with sweet sorghum (Sorghum
bicolor (L) Moench). Annals of Microbiology. DOI 10.1007/s13213-014-0951-7.
• Mareque,C. Freitas,T., Estebanez Vollú,R., Seldin,L., Beracochea, M. and F. Battistoni. The chemical Nfertilization affects the structure and the composition of the endophytic-bacterial community associated
with sweet sorghum (Sorghum bicolor), under field conditions. En evaluación.
• Congresos nacionales (7)
• Congresos internacionales (3)
Cecilia Taulé: Estudiante de Doctorado
Cintia Mareque: Estudiante de Doctorado
Martín Beracochea: Estudiante de Maestría
Gabriela Heijo: Estudiante de Maestria
María Cecilia de los Santos: Estudiante de Grado
Enzo Ferrari: Estudiante de Grado
Margarita Sicardi (Facultad de Ciencias)
Fernando Hackembruch (ALUR)
Darío Rodriguez (ALUR)
Alicia Castillo (INIA)
Claudia Barlocco (INIA)
Verónica Reis (EMBRAPA-Agrobiología, BR)
Fabio Olivares (UENF-LBCT, BR)
Euan James (The James Hutton Institute. UK)
Lucy Seldin (Instituto de Microbiología, UFRJ, BR)