UNIDAD 2 QUÍMICA DE PROTEÍNAS Propiedades del enlace peptídico.

UNIDAD 2
QUÍMICA DE PROTEÍNAS
Propiedades del enlace peptídico.
La formación del enlace peptídico
Las proteínas son polímeros lineales que surjen de la condensación de veinte aminoácidos
diferentes. Como se mencionó anteriormente, las propiedades de los aminoácidos libres son muy
diferentes de las propiedades de los "residuos" de aminoácido, que es como se llama al resto
aminoacídico una vez incorporado a la cadena.
La reacción formal de condensación es la siguiente1:
H2N-R1CH-CO2H + H2N-R2CH-CO2H  H2N-R1CH-CONH-R2CH-CO2H + H2O 2.1
Notese que en esta reacción de equilibrio el G0 es aproximadamente de 2 kcal/mol dependiendo de
los aminoácidos involucrados; por lo tanto, la formación de una unión peptídica es energéticamente
desfavorable y no va a ocurrir apreciablemente en soluciones acuosas. La reacción de hidrólisis no
catalizada y a temperatura ambiente tiene un t1/2 de 7 años. A partir de este t1/2 es fácil calcular la
constante k-1 de velocidad de hidrólisis:
AB  AB0 e k1t 
2.2
AB0 / 2  AB0 e k1t1 / 2 
2.3
k 1  3  109 sec-1
1El
esquema mostrado no constituye ninguna reacción real. La formación del enlace peptídico in vivo es el resultado de
una serie de reacciones con participación de una compleja maquinaria celular. Solo muy recientemente esas
reacciones pudieron ser reproducidas in vitro usando extractos celulares. Por otra parte, la síntesis de péptidos de
secuencia definida en forma automática y sistematizada como se la conoce actualmente es el resultado de 50 años de
esfuerzos de los más grandes químicos de la época. La diferencia conceptual más importante que distingue la síntesis
in vitro e de lain vivo es la necesidad de protección y desprotección de grupos reactivos en las cadenas laterales. En la
célula esto no es necesario porque la reacción se realiza con sustratos inmobilizados en una orientación específica
que elimina las reacciones colaterales. Por otra parte, tanto in vivo como in vitro es necesario activar el carboxilato para
que la reacción pueda proceder con un G favorable.
2.1
A partir de
G  RT ln K
2.4
Se puede calcular la constante de equilibrio
K
AB  0.032M 1
AB
2.5
Como en el equilibrio la velocidad de formación es igual a la de hidrólisis se puede calcular k1 de
velocidad de formación como:
AB 
 k1 A B 2.6
t
 AB 
 k 1 AB  2.7
t
k1 = k-1 K  3 10-90.032 sec-1 M-1 1 10-10 sec-1M-1
Es evidente que la formación no catalizada del enlace peptídico es extremadamente lenta. Se
requiere de la activación del carboxilato para formar un enlace de alta energía, tanto in vivo como
in vitro, y que esta reacción tenga alguna significancia. La reacción de hidrólisis, si bien es
energéticamente favorable, ocurre también muy lentamente en condiciones fisiológicas2. La energía
de activación para la formación y ruptura del enlace peptídico es muy alta estableciendo una
limitación cinética al proceso. Sin embargo la velocidad de hidrólisis no es cero. Una solución de
proteína abandonada varios días a temperatura ambiente puede ser degradada apreciablemente por
hidrólisis no catalizada de sus enlaces peptídicos. Esto es fácil de entender si se considera que una
proteína tiene normalmente cientos de enlaces peptídicos. La hidrólisis de cualquiera de ellos puede
conducir a la pérdida de la estructura y la función.
Veámos como esto es posible. Utilizando la ecuación 2.2 y asumiendo que el número de residuos es
Ni = 300 y la concentración inicial de proteína = 1 10-3 M:
AB  3 101 ek1t 
Se habrán perdido en concentración molar de enlaces peptídicos:
3  10-1 M2.9992250  10-1 M = 7.77499220  10-5 M
Si cada enlace peptídico inactiva una molécula de proteína la fracción molar de proteína inactivada
es:
2La
vida media de un enlace peptidico a pH 7.0 y temperatura ambiente es de 7 años, pero es de alrededor de un
minuto a 250 ºC.
2.2
7.77499220  10-5 M / 1  10-1 M = 7.77499220 10-4
Lo que equivale a ≈0.1%.
Este pequeño porcentaje puede parecer no significativo. Sin embargo debe ser tenido muy en cuenta
por varias razones. Primero, es una estimación optimista; hay algunos enlaces peptídicos que son
algo más inestables (dependiendo de las cadenas laterales involucradas) y se hidrolizan con más
facilidad. Segundo, si la proteína en cuestión es un producto farmacológico, los productos de
degradación aún a ese bajo nivel, pueden resultar tóxicos o peligrosos. Por lo tanto, este proceso de
hidrólisis es una buena razón para no almacenar proteínas en solución a temperatura ambiente.
Por otra parte, el análisis realizado más arriba demuestra que es necesaria la presencia de enzimas
proteolíticas que bajan la barrera de energía de activación para la degradación intracelular de
proteínas que de otra manera serían muy longevas.
Si analizamos los reactantes en la formación del enlace peptídico vemos que tienen en solución
acuosa y a pH 7.0 un grupo carboxilato cargado negativamente y un grupo amino cargado
positivamente. La condensación elimina estas cargas. Si prescindimos de posibles cargas en las
cadenas laterales, un polipéptido contiene solo un extremo C-terminal cargado negativamente y un
extremo N-terminal cargado positivamente. La desaparición de las cargas hace que el enlace
peptídico tenga propiedades muy diferentes del carboxilato y del grupo amino originales. En
particular, el enlace peptídico es bastante soluble en solventes orgánicos, sobre todo si puede formar
puentes de hidrógeno intramolecular entre el carbonilo y el nitrógeno amídico. Esto contrasta con la
mayoría de los aminoácidos libres que particionan más favorablemente con el agua a pH
fisiológico. Está propiedad es crucial para modular la interacción entre la cadena y el solvente.
Como el agua debe ser excluída para que la cadena se compacte y surja la estructura nativa, no
puede haber una cantidad excesiva de carga en la cadena.
Hay diecinueve aminoácidos diferentes y un iminoácido en la composición de las proteínas
naturales. Todos los aminoácidos forman un único tipo de enlace pepídico. La diferencia está en la
cadena lateral R tal como se muestra en la Figura 2.1.
La estructura química y la geometría del enlace peptídico
Hacia 1930 empezó a quedar claro que la estructura covalente de las proteínas estaba constituída
por subunidades repetitivas que constituían el polímero lineal y que diferían solamente en las
propiedades de las cadenas laterales. Sin embargo no estaba para nada claro cual era la relación
entre la estructura química de esas subunidades y las propiedades de las proteínas como un todo.
Gracias a los extraordinarios trabajos de Linus Pauling y sus colaboradores, en California, en los 50,
se comenzó a desentrañar el misterio. Ellos estudiaron dipéptidos por cristalografía de rayos X y a
partir de estos estudios se dedujeron dos propiedades fundamentales para la formación de la
estructura tridimensional proteica: la planaridad del enlace peptídico y su habilidad para formar
puentes de hidrógeno. Estos dos conocimientos llevaron más tarde al mismo Pauling a postular
teóricamente la existencia de hélices y estructuras periódicas en las proteínas. Hecho que fue
confirmado en los años 60 por los mapas de difracción de rayos X de la mioglobina y de la
hemoglobina obtenidos por Kendrew y Perutz en Cambridge (Inglaterra).
Veamos cuales son las características fundamentales del enlace peptídico deducidas de sus
coordenadas atómicas.
2.3
O
1 .23 Å
1 21 .1Þ
N
1 23 .2Þ
C'
2Å
1.5
C
1 15 .6Þ
1.3
3Å
C
1 21 .9Þ
Å
1.45
R
C'
N
1 19 .5Þ
1 18 .2Þ
R
Fig 2.1. Geometría del enlace peptídico
Es necesario primero acostumbrarse a la terminología en uso para referirse a los átomos que
componen el enlace peptídico. El carbono que une a la cadena lateral se llama C, el carbonilo C' y
el nitrógeno N. Se agrega el subíndice i para referirse a la ubicación secuencial en la cadena. El C
es asimétrico, ya se dijo sólo residuos L intervienen en las proteínas naturales. Se han sintetizado en
el laboratorio péptidos y proteínas pequeñas que estan formadas exclusivamente por residuos en la
configuración D. Cuando se compararon las propiedades de estos polipéptidos con sus análogos
naturales se observó por ejemplo que sus espectros de actividad óptica eran imágenes especulares
de los polipéptidos naturales.
Si se observan los valores numéricos dados para ángulos y longitudes de enlaces en la Figura 2.1 se
pueden extraer interesantes conclusiones. La longitud del enlace C'-N es más corta de lo esperado
para un enlace C-N normal. Esto se puede ver en la misma figura comparando con el enlace C-N.
Esto ocurre así porque ese enlace tiene un caracter parcial (alrededor del 40%) de doble enlace. Los
átomos mostrados en la figura 2.2 tienden a ser coplanares y parte del tiempo existe una separación
de densidad de carga opuesta centradas en el oxígeno y el nitrógeno.
Resulta muy útil para conocer las propiedades químicas y conformacionales del enlace peptídico
analizar con algún detalle su estructura covalente y sus propiedades de resonancia. En la Fig. 2.2a se
muestran en un esquema los orbitales atómicos p que interaccionan para formar los orbitales
moleculares  del enlace amida. Hay tres átomos aportando los orbitales atómicos p. Estos deben
ser paralelos para poder solapar eficientemente, condición que sólo se da en el caso en que los tres
átomos (O, C y N unidos mediante enlaces  entre orbitales sp2) se mantengan en el mismo plano.
A partir de tres orbitales atómicos p se pueden formar tres orbitales moleculares : ligante, no
ligante y antiligante, con menor, igual y mayor energía que los originales respectivamente. Hay
cuatro electrones para distribuir entre los dos primeros orbitales moleculares creados. Las
estructuras resonantes involucran solamente el movimiento de estos electrones ; por eso se
2.4
acostumbra a distinguirlos de los pares de electrones solitarios en orbitales  (dos pares en el
oxígeno) enmarcando estos últimos con un círculo.
Fig. 2.2. Organización electrónica del enlace peptídico y sus propiedades acido-base. (a) Orbitales moleculares y
electrones deslocalizados en orbitales . (b) Representación esquemática del enlace peptídico indicando la resonancia,
los electrones solitarios sobre el nitrógeno y, en ciculos, los electrones solitarios reactivos en la molécula neutra. (c)
Reacciones ácido-base del grupo peptídico. Las flechas horizontales y diágonales indican reacciones de protonación en
el sentido en que se desplaza el equilibrio. Las flechas verticales indican tautomería. algunas de las formas resonantes
más importantes se muestran entre corchetes. Los números indican el valor de la constante de equilibrio para la reacción
en el sentido que indica la flecha. Si se cierra un ciclo completo se pueden calcular cada una de las constantes
(conociendo el valor de las restantes que componen el ciclo) sumando los exponentes y asegurándose que el resultado
para un ciclo completo sea igual a cero. así se puede determinar aproximadamente la constante para transformaciones
que no se indican explicitamente.
2.5
La Fig. 2.2b muestra una representación sencilla pero suficientemente informativa de la estructura
amida. Los pares de electrones solitarios en enlaces  son los que determinan las propiedades
químicas de la molécula como base.
La estructura 1 de la Fig. 2.2c es la forma neutra y absolutamente mayoritaria del enlace peptídico
en solución. La protonación de 1 en uno de los pares solitarios del oxígeno produce las estructuras
resonantes 4 . Si se observa la Ka para esta reacción se comprende que es importante pero sólo
habrá una concentración significativa de 4 a pH=0 o más bajo, a pH 7.0 la concentración de forma
protonada es insignificante. Supongamos una concentración milimolar de péptido:
PH   0.1
P H  
PH   0.1
10-3 10-7 
PH   0.1
10-3 100 
A pH = 7.0, [PH+] = 10-11 M. Es decir 10-6% del péptido se encuentra protonado. Mientras que a
pH = 0, [PH+] = 10-4 M. Es decir 10 % de protonación.
No es muy usual que tengamos que ocuparnos de soluciones muy ácidas cuando tratamos con
proteínas. Sin embargo es importante conocer esta tendencia a protonarse del oxígeno carbonilo
para comprender la avidez con que el enlace peptídico tiende a compartir protones con el agua en
los puentes de hidrógeno y también cierta tendencia a coordinar metales cuando existe la
posibilidad de formar anillos quelantes (veremos estos temas con detalle más adelante).
Las formas 2 y 3, que se obtienen por tautomería son mucho menos significativas en el equilibrio.
La forma 3 es la única forma con un nitrógeno trigonal, presumiblemente es muy reactiva y el paso
obligatorio para la isomerización del enlace peptídico de cis a trans. Afortunadamente está en
concentraciones despreciables, porque de otra manera la estabilidad de las proteínas se vería
seriamente amenazada.
En presencia de bases muy fuertes es posible obtener el anión 5. La Ka es más que elocuente acerca
del desplazamiento de la reacción hacia la forma neutra. Esta reacción por lo tanto no es relevante
para la estabilidad química de la cadena polipeptídica en condiciones fisiológicas.
El intercambio del hidrógeno amídico por hidrógenos del agua, tanto catalizado por ácidos
(1421 o 131)como por bases (151), es extremadamente importante como
herramienta para estudiar la conformación proteica. La velocidad de este intercambio depende de
las propiedades ácido base que acabamos de mencionar, de la naturaleza de los residuos
involucrados y de la estructura tridimensional de la molécula. Este tema también será tratado en
detalle más adelante.
2.6