Ensayo inmuno enzimométrico:

PRINCIPIO
Ensayo inmuno enzimométrico:
B
Los reactivos esenciales requeridos para realizar un ensayo
inmuno enzimométrico incluyen anticuerpos de alta afinidad y
especificidad (enzimáticos e inmovilizados), que tienen un
reconocimiento de epítopes claramente diferenciado, en
exceso, y antígeno nativo. De acuerdo con este procedimiento,
la inmovilización ocurre durante el ensayo en la superficie de un
pozo de micro placas a través de la interacción del pozo
recubierta con streptavidina y el anticuerpo anti AFP monoclonal
marcado con biotina que se agrega al ensayo.
Al mezclar el anticuerpo monoclonal marcado con biotina, el
anticuerpo marcado con enzima y el suero que contenga el
antígeno nativo, se presenta una reacción entre el anfígeno
nativo y los anticuerpos, sin competencia ni obstáculos
estéricos, para formar así un complejo soluble en sándwich. La
interacción se ilustra mediante la siguiente ecuación:
Ka
Enz
Enz
Ac + Ag AFP. + BtnAc(m).
Ac.- AgAFP –Btn Ac(m)
K-a
Alfa-Fetoproteína (AFP) ELISA
Código de producto: 1975-300
Uso: Determinación cuantitativa de la concentración de AlfaFetoproteína (AFP) en suero humano mediante ensayo de
quimioluminiscencia en microplacas.
RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO
La Alfa- Feto proteína (AFP) es una glicoproteína que tiene un
peso moléculas de 70 kDA. La AFP comparte una considerable
homología secuencial con la albúmina y es producida
normalmente durante el desarrollo fetal por los hepatocitos, el
saco vitelino y en menor grado por el tracto gastrointestinal. La
AFP aparece como una gran proteína sérica en el feto, pero su
concentración desciende rápidamente hacia el momento del
nacimiento. Las concentraciones de suero alcanzan un nivel
pico hasta de 10mg/ml al cabo de 12 semanas de gestación (1).
Este nivel pico gradualmente se disminuye a menos de 25ng/ml
después de un año del post-parto. De allí en adelante, los
niveles se reducen hasta alcanzar un valor inferior de 10ng/ml.
Desde cuando se reporto por primera vez su asociación con,
tumores por parte de Tatarinov en 1964, con base en sus
trabajos en carcinoma hepático, la AFP ha sido tema de
discusión en relación con diversos tumores. Los niveles
anormales de AFP se han asociado con Carcinoma
hepatocelular, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal y cáncer
pulmonar y mas recientemente con cáncer testicular no
seminomatoso. Los niveles elevados de AFP se encuentran en
pacientes con hepatoma primario y tumores de germinales
derivados del saco vitelino. El AFP es el marcador mas útil para
el diagnostico y manejo del carcinoma hepátocelular (2).
La AFP también se eleva en mujeres embarazadas. La
presencia de concentraciones anormalmente altas de AFP en
mujeres embarazadas proporciona un marcador de riesgo para
el síndrome de Down (3).
En este método, el calibrador AFP, la muestra o control del
paciente se adicionará en primer término a un pozo recubierto
con streptavidina. Los anticuerpos monoclonales marcados con
biotina y marcados con enzimas (dirigidos contra epítopes
claramente diferenciados AFP) son adicionados y mezclados
los reactantes. La reacción entre los distintos anti-cuerpos AFP
y el AFP nativo forma un complejo en sándwich que se une con
el pozo recubierta con estreptadivina.
Después de completar el periodo requerido de incubación, el
conjugado enlazado con el anticuerpo enzima- AFP se separa
del conjugado no enlazado enzima -AFP mediante aspiración o
decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie
del pozo se cuantifica mediante reacción con un sustrato
adecuado para producir luz medible con un luminómetro.
El empleo de varias referencias de suero de niveles conocidos
de antígenos alfa- fetoproteínas (AFP) permite la construcción
de una curva de dosis respuesta con respecto de su actividad y
concentración. A partir de la comparación con la curva de
dosis respuesta, se puede correlacionar la actividad de una
muestra desconocida con la concentración AFP.
Btn
Ac (m)=Anticuerpo monoclonal marcado con biotina (cantidad
en exceso)
Ag AFP=Antígeno nativo (cantidad variable)
Enz
Ac= Anticuerpo marcado de enzima (cantidad en exceso)
Enz
Ac–AgAFP-BtnAc(m)=Complejo
en
sándwich
antígenoanticuerpos
Ka =Tasa constante de asociación
K-a =Tasa constante de disociación
Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a
través de la reacción de alta afinidad de la streptavidina y el
anticuerpo marcado con biotina. Esta interacción se ilustra a
continuación:
Enz
Ac - Ag
inmovilizado
Btn
AFP-
-
Ac(m) + estreptavidinaCW
=complejo
Streptavidina CW = streptavidina inmovilizado en pozo
Complejo inmovilizado= complejo en sándwich enlazado a la
pozo.
Después de que se logre el equilibrio, la fracción enlazada al
anticuerpo se separa del antígeno no enlazado por decantación
o aspiración. La actividad enzimática, determinada por reacción
con un sustrato que genere luz, en la fracción enlazada al
anticuerpo, será directamente proporcional a la concentración
de antígeno nativo. Al utilizar diversas referencias de suero de
valores conocidos de antígeno, se podrá generar una curva de
dosis respuesta a partir de la cual se evalúa la concentración de
antígeno de una muestra desconocida.
REACTIVOS
Materiales suministrados:
A. Antígeno Alfa feto proteína (AFP) – 1ml/vial- Iconos A-F
Seis (6) viales de antígeno AFP de referencia a los niveles de
0 (A), 5 (B), 25 (C), 50 (D) 250 (E) y 500(F) ng/ml. Almacenar de
2-8ºC. Un preservante ha sido adicionado.
Nota: los estándares, basados en suero humano, se calibraron
utilizando una preparación de referencia, la cual se ensayo
contra la primera preparación internacional de referencia WHO
1st IS #AFP
F. reactivo B de señal - 7ml/vial – Icono C
Una (1) botella que contiene peroxido de hidrogeno (H2O2.) en
solución amortiguante de PH. Almacenar de 2-8ºC.
G. Instrucciones del Producto
Nota 1: No utilizar los reactivos después de la fecha de
vencimiento del Kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables durante sesenta
(60) días si se almacenan a una temperatura de 2-8º C.
Nota 3: Los reactivos anteriores son para una sola microplaca
de 96 pozos.
1. pipetas de 50ul con una precisión superior a 1.5%.
2. dispensadores para administrar volúmenes repetitivos de
0.100ml y 0.350ml a una precisión superior a 1.5 %.
3. lavadores de micro placas o botellas lavadoras (opcional)
4. Luminómetro de microplacas
5. papel absorbente para el secado de los pozos de la
microplaca.
6. envoltura plástica o tapa de micro placa para realizar el
procedimiento de incubación.
7. aspiradora al vació (opcional) para el proceso de lavado.
8. cronometro.
9. materiales de control de calidad.
Marcar las pozos de la microplaca para cada una de las
referencias de suero, controles y muestras del paciente
que van a someterse a ensayo por duplicado. Colocar
nuevamente las tiras de micro pozos sin utilizar dentro de
la bolsa de aluminio, sellar y almacenar a 2-8ºC.
2.
Pipetear 0.025 ml (25µl) de la referencia adecuada del
suero, control o muestra dentro del pozo asignada.
3.
Adicionar 0.100ml (100µl) del reactivo trazador de AFP a
cada pozo. Es muy importante dispensar todos los
reactivos cerca de la base del pozo recubierto.
4.
Agitar suavemente la microplaca durante 20-30 segundos
para mezclar y cubrir.
5.
Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
6.
Eliminar el contenido de la microplaca por decantación o
aspiración. Si se hace por decantación, golpear
suavemente y secar la placa con papel absorbente.
7.
Adicionar 350µl de solución de lavado (consultar Sección
sobre
Preparación de Reactivos), decantar, golpear
suavemente y secar o aspirar. Repetir el procedimiento 4
veces mas para un total de 5 lavados. Se podrá utilizar
un lavador de placas automático o manual. Seguir las
instrucciones del fabricante para establecer el uso
apropiado. Si se utiliza un recipiente oprimible, llenar
cada pozo oprimiendo el recipiente (evitando la
formación de burbujas) para dispensar el lavado.
Decantar el lavado y repetir el procedimiento 4 veces
más.
8.
Adicionar 0.100 ml (100µl) de la solución del sustrato de
trabajo a todas la pozos (consultar la Sección sobre
Preparación del Reactivos). Agregar siempre reactivos
en el mismo orden para minimizar las diferencias en
tiempo de reacción entre los pozos.
9.
Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en
oscuridad.
PRECAUCIONES
Para uso Diagnóstico in Vitro
No esta diseñado para uso interno o externo en humanos o
animales.
Los productos que contienen suero humano han demostrado
ser no reactivos para el antígeno de superficie de hepatitis B,
anticuerpos VIH 1 y 2 y HCV por parte de reactivos licenciados
por la FDA. Debido a que ningún ensayo puede ofrecer una
garantía total de que los agentes infecciosos no estén
presentes, todos los sueros humanos deben ser manipulados
como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir
enfermedades. Los buenos procedimientos de laboratorio para
la manipulación de productos de sangre se encuentran el
centro para control de enfermedades/ instituto nacional de
salud, “bioseguridad en laboratorios micro biológicos y
biomédicos” segunda edición 1988 HHS Nº (CDC) 88-8395.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Se deben emplear las precauciones en la recolección de
muestras por punción venosa para las muestras de suero o
sangre. Para establecer una comparación precisa con los
valores normales establecidos, se obtendrá una muestra de
suero en ayunas. La sangre se recolecta en un tubo corriente
tapa roja, sin aditivos ni anticoagulantes. Se permitirá que la
sangre se coagule. Centrifugar la muestra para separar el
suero de las células.
Las muestras se pueden refrigerar de 2-8ºC por un período
máximo de cinco (5) días. Si las muestras no se pueden
ensayar dentro de este periodo, las muestras podrán
almacenarse a temperaturas de -20ºC hasta por un periodo de
30 días. Evitar la congelación y descongelación repetitivas.
Cuando el ensayo se hace en duplicado, se requiere 0.050ml de
muestra.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
1. Solución de lavado.
Diluir el contenido del concentrado de lavado en 1000 ml de
agua destilada o desionizada en un recipiente adecuado para
almacenamiento. Almacenar a temperatura ambiente (20-27ºC).
C. Pozos de reacción luminosa- 96 pozos icono
Una microplaca de 96 pozos con estreptavidina y empacada en
bolsa de aluminio con agente secante. Almacenar de 2-8 ºC.
2. Reactivo de señal - Solución de trabajo- Almacenar a 28ºC
Determinar la cantidad de reactivo y preparar mezclando
porciones iguales del reactivo A y del reactivo B en un
recipiente limpio. Por ejemplo, adicionar 1ml de A y 1 ml de B
por cada 2 tiras de 8 pozos (se logra un ligero exceso del la
solución). Eliminar la porción no utilizada dentro de las 36 horas
siguientes al mezclado. Si se piensa utilizar completamente los
reactivos, dentro de la limitación anterior del tiempo, verter el
contenido del reactivo B de señal dentro del reactivo A de señal
y marcar según corresponda.
E. Reactivo A de señal –7 ml/vial CA
Una botella que contiene luminol en amortiguador de pH.
Almacenar de 2 a 8ºC (Ver sección sobre preparación de
reactivos)
1.
Materiales Requeridos que no se suministran:
B. reactivo trazador AFP -13ml/vial – icono E
Un (1) vial que contiene anticuerpo monoclonal marcado con
enzima, IgG de rata y marcado con biotina, en amortiguador de
PH, colorante y preservantes. Almacenar a 2-8º C.
D. Concentrado de solución de lavado -20 ml - Icono
Un (1) vial que contiene un surfactante en solución salina
amortiguada. Se agrego preservante. Almacenar de 2-30 º C.
(ver sección sobre preparación de reactivos)
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Antes de seguir adelante con el ensayo, permita que todos los
reactivos, calibradores y controles alcancen la temperatura
ambiente (20-27ºC).
10. Tomar lectura de las unidades relativas de luz en cada
pozo durante 0.2-1.0 segundos. Los resultados deben
leerse dentro de los 30 minutos a partir de la adición
de la solución de sustrato.
CONTROL DE CALIDAD
Todos los laboratorios deberán ensayar los controles a niveles
dentro de los rangos bajo, medio y alto para monitorear el
desempeño del ensayo. Estos controles deben tratarse como
muestras desconocidas y determinarse los valores en cada uno
de los procedimientos de prueba que se lleven a cabo. Se
mantendrán curvas de control de calidad para hacerle un
seguimiento al desempeño de los reactivos suministrados. Se
utilizaran métodos estadísticos pertinentes para evaluar las
tendencias. Una desviación significativa con respecto de los
datos previamente establecidos de desempeño serán un indicio
de cambio no detectado en las condiciones experimentales o
degradación de los reactivos del kit. Se utilizaran reactivos
frescos para determinar el motivo de las variaciones
CALCULO DE RESULTADOS
Se utiliza una curva de dosis respuesta para evaluar la
concentración del AFP en muestras desconocidas.
1. Registrar RLU`s (Unidades Relativas
Luminiscentes)
obtenida de la impresión del lector de micro placas según se
señala en el Ejemplo 1.
2. Graficar los RLU`s para cada referencia en duplicado del
suero vs la concentración correspondiente AFP en ng/ml
en papel para gráficos. (No promediar los duplicados de
referencias de suero antes de hacer el grafico)
3.
Trazar la curva de mejor ajuste a través de los puntos
señalados en la grafica.
4. Para determinar la concentración de AFP para muestras
desconocidas, ubicar la absorbancia promedio de los
duplicados para cada una de las muestras desconocidas en
el eje vertical del grafico, luego encontrar el punto de
intersección en la curva y tomar la lectura de la
concentración (ng/ml) a partir del eje horizontal del grafico
(entendiéndose que los duplicados de la muestra
desconocida pueden promediarse según se indica). En el
siguiente ejemplo, los RLU`s (23210) de la muestra
desconocida se intercepta con la curva de calibración en
(88ng/ml) de concentración AFP (ver Figura 1)
1. La curva de dosis respuesta debe ubicarse dentro de
parámetros establecidos.
2. 4 de 6 pools de control de calidad deberán estar ubicados
dentro de los rangos establecidos.
ANALISIS DE RIESGOS
concentraciones sobre 350ng/ml por lo general son un indicativo
de la enfermedad.
TABLA I
Valores Esperados para el sistema de ensayo AFP
AccuLiteTM CLIA
A. Desempeño del análisis
Nota 1: El software de reducción de datos por Computador
diseñado para ensayos por quimiluminiscencia se puede utilizar
también para reducción de datos. Los duplicados de la muestra
desconocida pueden promediarse según se indique. (Ver Figura
1).
Nota 2: Monobind puede suministrar al laboratorio equipos y
software para medir e
interpretar los datos
de
quimiluminiscencia.
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea
mantenido en forma constante para obtener resultados
reproducibles.
2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10
minutos para evitar derivar el análisis.
3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas,
bemolizadas o contaminadas.
4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva
de respuesta a la dosis.
FIGURA 1
5. La adición del reactivo de señal inicia una reacción cinética
por lo tanto el reactivo de señal debe ser adicionado en la
misma frecuencia para eliminar cualquier derivación de
tiempo durante la reacción.
Valores APF en ng/ml
*Los datos presentados en el ejemplo 1, figura1, son para
ilustración únicamente y no deben ser utilizados en lugar de una
curva de dosis respuesta que se prepare con cada ensayo.
Adicionalmente, los RLU`s
de los calibradores han sido
normalizados A 100.000 RLU`s para el calibrador F (mayor
producción de luz). Esta conversión minimiza las diferencias
causadas por la eficiencia de los diversos instrumentos que
pueden ser utilizados para medir la producción de luz.
EJEMPLO 1
C1
281
D1
1172
E1
6219
Cal B
Cal C
F1
6136
G1
12717
H1
12979
Cal D
A2
61923
B2
61434
C2
99061
D2
100939
A3
5342
B3
5117
C3
27884
D3
29577
E3
23210
F3
23892
Cal F
Ctrl 1
5
6178
25
12848
50
500
5229
22.3
23551
Paciente
250
100000
28731
Ctrl 2
0
1227
61679
Cal E
Valor
79
(ng/ml)
89
RLU
(B)
RLU
(A)
69
B1
Media
Numer
o Pozo
I.D.
Muestr
a
A1
Cal A
103.6
88.0
PARÁMETROS DE CONTROL DE CALIDAD
Para que los resultados del ensayo puedan ser considerados
como válidos deberán satisfacerse los siguientes criterios:
6.
La falla al remover solución adherida en los pasos de
aspiración o decantación puede resultar en replicación
baja y resultados incorrectos.
7.
Usar los componentes del mismo grupo no mezclar los
reactivos de diferentes conjuntos.
8. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como seguir el
tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier
desviación de las instrucciones de uso puede arrojar
resultados inexactos.
9. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos los
estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de
manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso
adecuado del dispositivo.
10. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo:
pipetas,
lectores,
lavadores
y/o
instrumentos
automatizados con este reactivo y realizar un
mantenimiento preventivo rutinario
11. El análisis de riesgo – como la requiere la directiva IVD
98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos
elaborados por Monobind, pueden ser solicitados vía
Email: [email protected]
B. interpretación
1. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un
aspecto para determinar el cuidado del paciente y no
deben ser la única base para una terapia, particularmente
si los resultados están en conflicto con otros
determinantes.
2. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados
y otros parámetros deben estar dentro de los rangos
listados y requerimientos del ensayo.
3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de
partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados
de prueba falsos o si los resultados son interpretados
incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad.
4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por
Computador para interpretar los resultados del ensayo, es
necesario que los valores de predicción para los
calibradores se ubiquen dentro del 10% de las
concentraciones asignadas.
5. AFP presenta un bajo nivel de sensibilidad y especificidad
clínicas como marcador de tumores. Clínicamente un valor
elevado AFP por si solo no es diagnostico de un ensayo
para cáncer y por lo tanto debe utilizarse conjuntamente
con otras manifestaciones clínicas (observaciones) o
parámetro de diagnostico. Los niveles AFP son elevados
en una serie de enfermedades benignas y condiciones
como el embarazo y enfermedades hepáticas no malignas
como la hepatitis y la cirrosis.
RANGOS ESPERADOS DE VALORES
Aproximadamente el 97-98% de la población normal sana
presenta niveles AFP inferiores a 8.5ng/ml (4). Para el caso de
pacientes en altas condiciones de riesgo, los valores AFP entre
100-350ng/ml sugieren un carcinoma hepatocelular.
Las
Hombres y mujeres
<8.5ng/ml(97-98%)
Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un
rango de valores que se pueda esperar aplicando un
determinado método para una población de personas
“normales “sea dependiente de una serie de factores como son:
Especificidad del método, población estudiada y precisión del
método que manejen los analistas. Por estas razones cada
laboratorio deberá utilizar el rango de valores esperados
establecido por el fabricante únicamente, hasta cuando se
pueda determinar un rango dentro del laboratorio por parte de
los analistas que utilicen el método con una población propia del
área en la cual se encuentre ubicado el laboratorio.
Método
Media (x)
Este Método
(y)
Referencia
(x)
7.87
Análisis de
regresión de
mínimos
cuadrados
y=0.012
+
1.012 (x)
Coeficiente
de
correlación
0.993
8.15
Solo un ligero sesgo entre el procedimiento de microplacas
TM
MonoBind AccuLite CLIA y el método de referencia quedan
indicados por la cercanía de los valores medios. La ecuación de
regresión de mínimos cuadrados y el coeficiente de correlación
indica que hay una excelente concordancia entre los métodos.
REFERENCIAS
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
A. Precisión
TM
La precisión intra e inter ensayo del método AFP AccuLite
CLIA se determino mediante análisis de 3 niveles distintos de
sueros de control. El número (N), valor medio (X), desviación
estándar (σ) y el coeficiente de variación (C.V) para cada uno
de estos sueros de control se presentan en las Tablas 2 y 3.
TABLA 2
Precisión intra ensayo (valores en ng/ml)
Muestra
Nivel1
Nivel 2
Nivel 3
Muestra
Nivel1
Nivel 2
Nivel 3
N
20
20
20
X
σ
C.V.
11.9
0.6
5.0%
101.4
4.7
4.6%
203.5
8.5
4.2%
TABLA 3
Precisión inter ensayo (valores en ng/ml)
N
10
10
10
X
11.6
98.9
209.3
σ
0.7
5.3
10.6
C.V.
6.0%
5.4%
5.1%
Revisión: 2
Date: 112210
Cat #: 1975-300
* De acuerdo con la medición en 10 experimentos por
duplicado.
B. Sensibilidad.
Este procedimiento presenta una sensibilidad de 0.0125 ng, lo
cual es equivalente a una muestra que contenga una
concentración de 0.5 ng/ml de concentración de AFP.
C. Especificidad
La reactividad cruzada del procedimiento AFP AccuLiteTM CLIA
con respecto de sustancias seleccionadas se evaluó mediante
la adición de la sustancia interferente a una matriz de suero en
diversas concentraciones. La reactividad cruzada se calculo
derivando una proporción entre la dosis de sustancia
interferente con la dosis de AFP necesaria para producir la
misma intensidad luminosa.
Relatividad
Sustancia
Concentración
Alfa- Fetoproteína (AFP)
Folitropina (hFSH)
Hormona Lutropina (hLH)
Gonadotropina Coríonica (hGH)
Antígeno Carcinoembriónico (CEA)
Antígeno prostático especifico (PSA)
Fosfatasa acida prostática
Antígeno de Cáncer (CA-125)
Antígeno Cáncer (CA19-9)
Cruzada
1.0000
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
1000ng/ml
1000ng/ml
1000ng/ml
1000ng/ml
1000ng/ml
<0.0001
1000U/ml
1000ng/ml
D. Exactitud
TM
El estudio AFP AccuLite CLIA se comparó con un método de
inmuno-ensayo enzimático de micro-placas de referencia
(ELISA). Se estudiaron muestras biológicas provenientes de
concentraciones baja, normal y elevada. El número total de
estas muestras fue de 235. Se calcularon los valores para la
ecuación de regresión de mínimos cuadrados y el coeficiente de
correlación para este ensayo en comparación con el método de
referencia. Los datos obtenidos se observan en la tabla 4.
Instrumentos y aplicaciones
Los productos de inmunoensayo de Monobind están diseñados
para que funcionen en ambientes de laboratorios manuales y
automatizados. AccuBind y Acculite son compatibles cualquier
instrumentación de extremo abierto incluyendo analizadores
químicos, lectores de microplacas y lavadores de microplacas.
Es posible que exista o no un desarrollo de aplicación para su
instrumento en particular, para estos casos, se recomienda
visitar la sección de instrumentos de nuestro sitio en la web o
comunicarse con [email protected]
Monobind ofrece diversos instrumentos, incluyendo el lector de
placa Impulse 2, el luminómetro CLIA diseñado para ser
utilizado simultáneamente con nuestros productos y capaz de
una calibración de dos puntos. Visitar nuestro sitio en la web
para obtener mayor información.