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nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico
(25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínas
recuperadas es baja.
5RWXUDFRQ75,5HDJHQW6LJPD/DH¿FLHQFLDGH
rotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteínas recuperadas tras seguir el protocolo es baja.
Para aumentar la resolución y el enfoque de
las proteínas en 2-DE se están ensayando, en los
extractos totales potencialmente más idóneos para
nuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreak
y el método de cargado de las tiras de IPG mediante
“cup loading”.
Agradecimientos
(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR
SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación, Gobierno de España.
3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
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Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior
análisis y caracterización mediante espectrometría de masas
Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-Ortega
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba
Resumen
8QDGHODVIRUPDVPiVFRPXQHVGHPRGL¿FDFLRnes postraduccionales de proteínas es la glicosilación.
Se estima que más del 50% de las proteínas conocidas, así como el 80% de las proteínas de membrana,
están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se ha
demostrado que los procariotas también poseen glicoproteínas. Las glicoproteínas bacterianas parecen
HVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFURRUJDQLVPR
Este hecho sugiere por tanto que están implicadas
en la interacción de la bacteria con el hospedador y
por tanto puede existir una relación directa con la capacidad patógena del microorganismo. El objeto de
este estudio consiste en desarrollar una metodología,
PHGLDQWHGLYHUVDVFURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGSDUDHO
HQULTXHFLPLHQWR\SXUL¿FDFLyQGHJOLFRSURWHtQDVGH
bacterias del género Streptococcus.
En contra de lo que estaba establecido hasta
hace unos años, recientemente se ha demostrado que
los procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas
SDUHFHQ HVWDU DVRFLDGDV D OD VXSHU¿FLH GHO PLFURorganismo, lo que sugiere que están implicadas en
la interacción con el hospedador y por tanto, con la
capacidad patógena del microorganismo. Hay dos tipos de glicosilación en procariotas: N-glicosilación,
en la cual los glicanos están unidos a un residuo de
asparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido a
un residuo de serina, treonina o tirosina [1,2].
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Para el enriquecimiento de glicoproteínas, los
métodos que hemos utilizado se basan en cromaWRJUDItDV GH D¿QLGDG XVDQGR OHFWLQDV DVt FRPR OD
química de la hidrazida y del ácido aminofenilborónico [1,3].
/DVOHFWLQDVVRQSURWHtQDVTXHVHXQHQHVSHFt¿camente a motivos oligosacarídicos, reconociendo
cada una a un subgrupo de especies de glicanos.
Para asegurar el reconocimiento del mayor número de glicoproteínas, se está poniendo a punto
una batería de lectinas: Canavalia ensiformis lectin (ConA), que reconoce principalmente residuos
deĮPDQRVD\ĮJOXFRVDUlex europaeus lectin
8($ UHFRQRFH UHVLGXRV GH Į/IXFRVD Triticum vulgaris lectin :*$ UHFRQRFH grupos Nacetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Arachis hypogaea lectin $+ UHFRQRFH ȕJDO!
galNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1)
UHFRQRFHĮJDODFWRVD\ĮJDO1$F
Los extractos proteicos se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y posWHULRUPHQWHVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGHQLWURFHlulosa, las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, se
hibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incubaron con estreptavidina-HRP y se revelaron mediante
quimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminares
han indicado hasta ahora que tanto la ConA como la
AH son las lectinas que reconocen un mayor número
de glicoproteínas ya que revelan un mayor número de
bandas a partir de extractos totales (Figura 1).
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zona. Para ello se está poniendo a punto una cromatografía con una resina de hidrazida (Bio-Rad). En
primer lugar las muestras se oxidan con peryodato
sódico, y después la muestra se hace pasar por la
resina para permitir la formación de los enlaces
hidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas se
eliminan mediante lavados. Posteriormente las glicoproteínas se digieren con tripsina y se recogen
mediante lavados los péptidos generados, que corresponden a las proteínas glicosiladas, quedando
los glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopéptidos pueden recuperarse de la resina digiriendo con
la glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima corta
el sitio de unión del glicano a la asparagina. Para
OLEHUDUORV2JOLFRSpSWLGRVVHUHDOL]DȕHOLPLQDFLyQ
con dimetilamina al 26%, que convierte las serinas y
treoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobutírico respectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar la
tripsina por la resina para digerir las proteínas retenidas y analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/
06 VH LGHQWL¿FDURQ PXFKDV SURWHtQDV FLWRSODVPiWLFDV
en principio no esperadas.
Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidas
WUDVSXUL¿FDUFRQiF$PLQRIHQLOERUyQLFRH[WUDFWRVWRWDOHV
de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dereFKDHOXLGRÀRZWKURXJKH[WUDFWRWRWDO
Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA,
A.H., WGA, UEA-I, BC-I.
El segundo método de enriquecimiento está basado en la química de la hidrazida [6], mediante la
cual dicho grupo funcional reacciona con los grupos
cis-diol de los residuos de azúcares, previamente
oxidados a aldehídos, para formar un enlace hidra-
El tercer método consistió en la cromatografía
GH D¿QLGDG XVDQGR OD TXtPLFD GHO iFLGR DPLQRIHnilborónico, que forma enlaces covalentes con los
grupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa y
galactosa en condiciones de alcalinidad, dando lugar a diésteres, siendo estos enlaces reversibles en
condiciones ácidas. Se usó como tampón de unión
a la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mM
MgCl2, y de elución igual al anterior pero con 50
mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separó
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
al 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron por
0$/',72)06LGHQWL¿FiQGRVH~QLFDPHQWHSURteínas citoplasmáticas. Además, el eluido se digirió
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3527(Ï0,&$‡1Ò0(52‡)(%5(52
en solución con tripsina y se analizó mediante ESIMS/MS, dando también como resultado principalmente
proteínas citoplasmáticas.
Agradecimientos
[3]
Greis K. et al. Selective Detection and Site$QDO\VLVRI2*OF1DF0RGL¿HG*O\FRSHSWLGHV
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mas.20187.
Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionización
mediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría de
PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR0$/',72)
Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina
Legal. Facultad de Farmacia. Universitat de València
Resumen
Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos de amplia distribución, causantes
de numerosas intoxicaciones alimentarias debido,
en gran medida, a su capacidad de producir enterotoxinas. La enterotoxina del serotipo A es la que con
más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria. En el presente trabajo se desarrolla
una técnica de análisis de muestras de leche por
MALDI-TOF para la detección de la enterotoxina
$HVWD¿ORFyFLFD(VWHPpWRGRSUHVHQWDFRPRYHQtajas sobre las técnicas actualmente utilizadas su
JUDQHVSHFL¿FLGDG\HOHYDGDUDSLGH]/RVUHVXOWDGRV
obtenidos mostraron la efectividad de la extracción
utilizada demostrando la utilidad del método de
análisis utilizado.
Staphylococcus aureus es una bacteria patógena,
de amplia distribución en la naturaleza, asociada a
infecciones generalizadas y brotes alimentarios [1].
$OJXQDVHVSHFLHVGHHVWD¿ORFRFRVVRQSURGXFWRUDV
de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo
peso molecular (Mr 22-31.000) conocidas como enterotoxinasHVWD¿ORFyFLFDV6(V Estas enterotoxinas son causa de intoxicaciones alimentarias por la
ingesta de productos contaminados, principalmente
de origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la enterotoxina A [4], que es la que con mayor frecuencia
se asocia a brotes de intoxicación alimentaria y que
es extremadamente potente.