DNA (Deoxyribonucleic Acid) Fingerprint o huella genética

Caso 8: DNA FINGERPRINT.
INDICE
• Caso 4
• Terminología 5
• Identificación del problema 5
• Jerarquización del problema 5
• Hipótesis 6
• Objetivos 6
• Estudio 6−17
• Organización cromosómica y DNA no codificador 6−8
• Southern Blot 8−9
• Northern Blot 9−10
• Electroforesis convencional 10−11
• Electroforesis capilar 11−15
• PCR 15−17
• Conclusión 18
• Referencias 19
• Anexo
Introducción
En este caso vimos como podemos usar las técnicas de PCR o de Southern Blot en el campo de la
criminología como también en pruebas de paternidad.
El DNA Fingerprint es una técnica utilizada para saber si una muestra de DNA pertenece a cierta persona. Al
igual que una huella digital el DNA de cada persona es único, o mejor dicho, la secuencia de los pares de
bases del DNA es única para cada persona. Científicos son capaces de identificar a una persona solamente por
el ordenamiento de los pares de bases de su DNA. El DNA Fingerprint es usado en casos de paternidad y
maternidad para identificar a los padres de un niño. Otra aplicación es en la medicina forense en casos de
identificación de víctimas y establecer la inocencia o culpabilidad de los sospechosos. Y una tercera
aplicación sería como identificación personal, pero por el momento el Fingerprint es muy complejo y costoso
para usarse como identificación personal.
El DNA Fingerprint requiere la utilización de otras técnicas. El Southern blot es utilizado para el Fingerprint
ya que con el uso de una sonda radioactiva es posible identificar fragmentos de una secuencia de DNA. Otra
técnica usada es el PCR. Con esta técnica es posible amplificar el DNA de una pequeña muestra. El PCR es
una técnica necesaria para casos criminales ya que el DNA encontrado en la escena del crimen generalmente
no es suficiente para poder trabajar con él.
Caso 10
Juan sobrevivió al síndrome de Li−Fraummeni, pero desgraciadamente fue encontrado asesinado en su
departamento.
Muestras de sangre fueron halladas sobre el sofá y al parecer Juan prestó una feroz resistencia antes de ser
asesinado. Se sospecha de "un amigo" con el cual mantenía relaciones.
El amigo es arraigado en el hotel "EMIS" localizado en la avenida Colón y ahí se le pide una toma de sangre.
Por ley tú tienes que explicarle con lujo de detalle a este "amigo" que es lo que vas hacer con su sangre.
Le explicas muy generalmente que le vas a practicar un "DNA Fingerprint".
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Como vas de prisa le dices que mañana le explicarás con más detalle en que consiste esta nueva tecnología (en
México).
TERMINOLOGIA
• DNA Fingerprint.
El patrón único de fragmentos de DNA identificados por hibridización southern (utilizando una sonda que se
une a una región polimórfica de DNA) o por reacción en cadena de la polimerasa (utilizando iniciadores −
primers− que flanquean la región polimórfica).
IDENTIFICACION DEL PROBLEMA
• ¿Para qué nos sirve la muestra de sangre encontrada?
• ¿Para que le piden al amigo de Juan una muestra de sangre?
• ¿Qué van a hacer con esas 2 muestras?
• ¿Para qué nos sirve el DNA fingerprint?
JERARQUIZACIÓN DEL PROBLEMA
• ¿Para qué nos sirve la muestra de sangre encontrada?
• ¿Para que le piden al amigo de Juan una muestra de sangre?
• ¿Qué van a hacer con esas 2 muestras?
• ¿Para qué nos sirve el DNA fingerprint?
HIPOTESIS
La muestra encontrada en el cuarto se usará como prueba para ver si la muestra del amigo de Juan es la misma
y determinar si el amigo fue el que asesinó a Juan. La técnica de DNA fingerprint es la que nos va a decir si
las 2 muestras coinciden.
OBJETIVOS
• Estudiar lo que es el DNA fingerprint.
• Estudiar en que consiste el PCR.
• Estudiar lo que es el Southern Blot.
ESTUDIO
Organización cromosómica y DNA no codificador
Quizá más del 90% no codifica precursores de mRNA. En organismos multicelulares este DNA contiene
regiones muy similares pero no idénticas las variaciones de este DNA repetido son tan grandes que es posible
distinguir a cada persona por sus huellas dactilares de su DNA.
Las regiones codificantes, es decir, los genes se encuentran entre estas secuencias.
Un gen lo podemos definir como una secuencia completa de ácidos nucleicos necesarios para la síntesis de un
polipéptido funcional.
Las regiones codificadoras que solo se representan una vez en el genoma haploide se llaman genes solitarios y
abarcan de un 25 50% de los genes.
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El DNA a menudo contiene secuencias que son copias parecidas pero inexactas del gen estas se denominan
genes codificadores de proteína duplicados que constituyen cerca del 50% de las secuencias codificadoras.
Estas secuencias dan origen a las familias de genes que son genes duplicados que codifican secuencias
similares pero no idénticas por lo tanto dan origen a familias de proteínas con estructuras similares así como
sus funciones.
Una variación a este tipo de secuencias duplicadas son los seudogenes sólo que son secuencias no
codificantes.
Los genes codificadores de mRNA, tRNA e histonas pertenecen a secuencias dispuestas en tandem es decir
aparecen una después de otra, estas a diferencia de las duplicaciones son repeticiones idénticas.
Otras clases de secuencias repetidas de DNA que en base a su desnaturalización y velocidad de reintegración
se clasificaron en 3:
De baja velocidad que abarca del 50 a 60 % de DNA no codificante y es de copia única se le llama puesto que
no tiene función importante DNA espaciador.
De velocidad intermedia o repeticiones intermedias son el 25 a 40 % del DNA son secuencias complejas que
se pueden copiar y reinsertar en nuevos sitios del genoma se les llama elementos móviles del DNA.
De velocidad muy grande alrededor de un 10 a 15% del DNA que son secuencias repetitivas muy cortas de 5 a
10 pares en largas disposiciones en tandem estas por lo general se encuentran cerca de los centrómeros y de
los telomeros.
Estas secuencias están muy conservadas en cada especie mas no su numero de repeticiones a causa de
entrecruzamientos no equitativos, esto es lo que hace las llamadas fingerprints.
Southern Blot
El Southern Blot recibe su nombre de Edward M. Southern quién desarrollo la técnica, en 1970, para localizar
secuencias de DNA especificas. Los pasos para realizar un Southern blot se muestran a continuación.
1.− El primer paso es aislar el DNA del núcleo, ya sea usando detergentes para eliminar el resto del material
del núcleo, o aplicando presión para forzar el DNA a que salga.
2.− El segundo paso es cortar el DNA en cadenas cortas. Esto sea hace usando enzimas de restricción.
3.− El tercer paso consiste en separar las cadenas por tamaño. El proceso usado es la electroforesis de gel. El
DNA es puesto en un gel, como el de agarosa, y una carga eléctrica es aplicada al gel, con el polo negativo
arriba y el positivo abajo. El DNA tiene carga negativa por lo que se moverá hacia abajo, pero las cadenas
más pequeñas se moverán con mayor rapidez que las grandes.
4.− El cuarto paso es desnaturalizar el DNA en el gel usando calor ó químicos.
5.− El quinto y último paso consiste en copiar el DNA del gel a un papel de nitrocelulosa. Una vez que el
DNA se adhiera permanentemente a este papel, el Southern blot ya está terminado.
Para analizar el Southern blot, se usa una sonda de DNA radioactiva. Una sonda es un fragmento de DNA o
de RNA que se aparea con una cadena complementaria en el Southern blot. Después de esta reacción de
hibridación se toma un X−Ray del Southern blot y solamente en dónde se haya unido la sonda aparecerá en el
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film.
Northern Blot
El Northern blot es una técnica para localizar secuencias específicas de RNA. Debido a que la técnica para
localizar secuencias de DNA se llamó Southern blot, los científicos que usaban la técnica de RNA la llamaron
Northern blot. Procedimiento usado por el Northern blot es exactamente el mismo que el del Southern blot,
con la diferencia de que el Northern blot busca secuencias en el RNA en vez del DNA.
Electroforesis convencional
La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de
elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa
delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus
poros. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así
su migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre
el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las
separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para
visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación
(por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel)
de moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre
ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también
actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más
grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De
este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la
relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son agarosa y
poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de gelificación y
propiedades físico−químicas, lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de
Biología Molecular. La poiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N´
metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas.
Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por el gel cuando se active el campo
eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar esta técnica de separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica, aspecto este que se ha podido
comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la literatura más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa,
electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan general
pero no por ello dejan de ser importantes.
Electroforesis Capilar (CE)
La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la
velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico
aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia
directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la
calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar
con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta técnica está representada en el
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siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la
separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con
volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis
convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL, con una elevada resolución y
rapidez. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues
emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de
la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado,
aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se pueden utilizar detectores
cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos
característicos de cada compuesto separado. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en
mecanismos de separación diferentes.
Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite
la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las
muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una
mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles
utilizados son también de agarosa y poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a
su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los analitos según la relación
carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado
hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se
separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas
completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite
separar los compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por
el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un gradiente de pH estable en una
disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que
migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce
una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica
conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo de recorrido en el
capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. Es una técnica de separación por
desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Este debe
tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se introduce la
muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los
componentes de la muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de
los valores de las movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta característica es
necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema, dado que no hay un electrolito de
soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere usualmente corridas separadas
para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores
características de cada técnica por separado, por lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la
electrocromatografía capilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. Proporciona una
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elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un
bombeo de alta presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo
ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que simplifica significativamente el
equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar:
• Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a
través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones
dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida
por el relleno.
• Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en
un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar
compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la
separación.
En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la
resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de
ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la
electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para
el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida
entre las técnicas de separación.
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Sus siglas en español significan Reacción en cadena de la polimerasa y es una técnica realizada In Vitro
utilizada en Biología Molecular para a partir de un fragmento de ADN, sintetizar miles y/o millones de estos.
Para poder hacer esto, se necesita:
• Muestra de ADN, que se va a tomar de molde para a partir de esta, sintetizar las demás.
• Taq Polimerasa (Enzima extraída del Thermus Aquaticus), es una polimerasa de ADN con propiedades
termoestables que conserva su actividad enzimática hasta alrededor de los 100oC. Se encarga de incorporar
los dNTPs(eslabones clave para que la polimerasa pueda extender los primers para dar lugar a los
amplicones o fragmentos amplificados).
• Termociclador, que con los constantes cambios de temperatura va a realizar la función de la helicasa en
diferentes fases: desnaturalización, alineamiento y elongación.
• Primers (Oligonucleótidos): Cebadores e iniciadores.
• Bases Nitrogenadas Activadas (dNTP).
• Electroforesis, ya sea en gel de agarosa o poliacrilamida.
La técnica PCR para sintetizar las miles de cadenas de ADN se divide en 2 ciclos:
• El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su
vez, son capaces de hibridar con los primers. Este tipo de productos se irá acumulando de forma
geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de
la reacción.
• Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes, generándose
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en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos de ambos
oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La
cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de forma
exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrán aparecido
El termociclador hace los cambios de temperatura y logra las 3 fases:
Durante la primera, desnaturalización el fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 92º a
96 ºC; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada hibridación, la temperatura
de la mezcla se rebaja hasta 40−60 ºC para que los cebadores se enlacen con el ADN escindido. En la tercera
fase de extensión o polimerización, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72°C para la extensión, una
enzima la Taq DNA polimerasa la cual es termoestable y es la que en buena cuenta ha permitido la mejoría
del proceso PCR en una forma relativamente sencilla, copie rápidamente la molécula de ADN.
Estas tres fases constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos o tres minutos.
Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores
suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para
producir mil millones de copias de ADN.
La técnica de PCR tiene varias aplicaciones actualmente, se usa en la secuenciación, en estudios evolutivos y
para el ADN fingerprint.
Conclusión
Después de haber analizado el caso se puede llegar a la conclusión de lo que es el DNA Fingerprint o huella
genética.
Esta técnica es muy importante básicamente para dos cosas, para el campo forense y para comprobar la
paternidad de una persona. Esto se logra mediante dos técnicas mas comunes y que han sido utilizadas en
México, conocidas como Southern Blot y Reacción en Cadena Polimerasa(PCR).
Como se vio anteriormente el Southern Blot es un proceso mas laborioso y con menor precisión que el PCR,
por lo que actualmente alrededor del mundo se utiliza mas el PCR, ya que además de ser un proceso rápido y
exacto, permite analizar muestras parcialmente degradadas o impuras como cabello, saliva, hueso y semen.
Estas técnicas han producido un gran avance en materia forense, ya que permiten analizar evidencias con una
mayor facilidad y exactitud, además gracias al PCR se pueden sacar datos de muestras mínimas.
El DNA Fingerprint ha sido, en general, un gran avance para la medicina y para la ciencia en general, es una
técnica que parece sencilla, pero que es asombrosa y que de seguro en su tiempo de descubrimiento causo
gran revuelo como lo esta haciendo ahora el genoma humano.
Referencias.
http://www.bioxamara.tuportal.com/diccionario.htm
www.uprm.edu/biology/cursos/genetica/pcr.htm
www.biomedicina.ucse.edu.ar/docencia1.htm
http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/index.html
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http://www.biology.washington.edu/fingerprint/blot.html
Química orgánica
William d. stansfield
Mc Graw Hill
Tercera edición
Páginas 335 − 339
Biología Celular y Molecular
Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S.Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James.
Capítulo 7 DNA recombinante y genómico; parte 7.7 Reacción en cadena de la polimerasa: una alternativa a
la clonación; páginas 246−247.
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