TEMA: MICROPROPAGACION DE LAS SEMILLAS DE ORQUIDEAS

MICROPROPAGACION DE 0RQUIDEAS.
I.-ANTECEDENTES HISTORICOS.
Hardley ( 19829) llegó a la conclusión que las orquídeas obtenian los hidratos de carbono de
los hongos. Pero está lejos de la realidad.
Sin embargo se ha comprobado que las orquídeas reciben a veces aminoácidos ( glutamina,
ácido glutámico, ácido aspártico y ácido nicotínico) provenientes del hongo. (Hyner y Arditti
1973).
Knudson ( 1922), demostró que era posible la germinación sobre un medio simple que
contuviera minerales y azúcartes, sin la presencia de hongos.
La investigación desarrollada por Knudson (1922) supuso una conmoción en el mundo de
las orquídeas, al demostrar que las semillas de Cattleya, Epidendrum y otras orquídeas eran
capaces de germinar asimbióticamente in vitro. A pesar del descubrimiento de Knudson, se
comprobó que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de
orquídea pueda germinar y desarrollar..Se
han descrito muchos medios nutritivos, para
muchos géneros y especies diferentes (Arditti,1967, 1982, Arditti y Ernst, 1982 y Fast, 1980).
Razones por las que no puede germinar:
1.-Las semillas de orquídea son muy pequeñas y
contienen poco o nada
de reserva
alimenticia.
2.-La germinación y el subsiguiente desarrollo de la plántula, dependen en la naturaleza de la
relación simbiótica con un hongo, sin embargo, en in vitro es posible sustituir la acción del
hongo por un medio nutritivo, a esta germinación se denomina asimbiótica.
3.-La siembra in vitro permite germinar embriones inmanduros de orquídea, disminuyendo su
ciclo de mejora.
4.-La germinación y el desarrollo es más eficiente
en in vitro, ya que se realiza en un
ambiente acondicionado, y sin competencia con hongos y bacterias.
II.- DESCRIPCION DE LAS ORQUIDEAS-
2.1.-LAS CARACTERISTICAS ANATOMICAS DE LAS SEMILLAS.
Las semillas de orquídeas son muy pequeñas, 1-2mm de largo y 0.5-1mm de ancho..
Se producen en cantidades elevadas por cápsula : 1300 -4 000 000.
Las semillas constan de una testa gruesa, que encierra un embrión de alrededor de 200
células.La cubierta tiene un aspecto exterior característico, en forma de red, que es diferente
para cada especie.La testa está formada por un tejido muerto, compuesto hasta en un 96% de
aire, de tal forma que cada semilla puede ser considerada como un auténtico globo.
El embrión tiene una forma redondeada o esférica.
La mayor parte de las semillas de orquídeas están escasamente diferenciadas:
No se distinguen cotiledones ni raíces y carecen de endospermo.
En el extremo distal del embrión existe un punto de crecimiento potencial, no identificable en
el estado de semilla.
2.2.-LA GERMINACION DE LAS SEMILLAS.
La germinación de las semillas de orquídeas, según Arditti (1967), Harley (1969) y Pierik (
1982) se puede describir de la siguiente forma:
El embrión absorbe agua a través de la testa, aumentando de volumen.
Después se inicia la división celular, rompiendo el embrión la cubierta seminal.
A continuación se forma una estructura de tipo protocormo, a partir del agregado de células, y
sobre aquel se puede distinguir un meristemo del vástago.
Luego se diferencia los órganos ( meristemo del vástago en un lado y rizoides en el opuesto),
comienza un período de crecimiento intenso.
Si el protocormo está expuesto a la luz, adquiere el color verde y al mismo tiempo se
desarrolla hojas.Como resultado de la formación de la clorofila de planta se hace autótrofo.
Luego se forman las raíces verdaderas en forma endógena.
Posteriormente el protocormo y los rizoides pierden su misión nutritiva y desaparecen.
2.3.-METODOS DE LA PRUEBA DE LA VIABILIDAD.
Sing (19819) demostró que el test del tetrazolio ( los embriones viables se tiñen de rojo,
mientras que los no viables quedan blancos), puede ser utilizado para determinar la viabilidad
de las semillas de orquídeas tropicales epífitas.
Van Waes y Debergh (1986) han demostrado que el método Sing no puede ser aplicado a las
orquídeas del oeste de Europa, cuya viabilidad se determina bajo tres etapas:
1.-Preparación de la semilla en una solución al 5% de Ca (0Cl)2 más 1% tween 80.
2.-Inmersión en agua estéril durante 24 horas.
3.-Aplicación, al final, la prueba clásico del tetrazolio.
Se aconseja almacenar las semillas maduras a 5°C ( Fast 1980).
Lucke (1971) afirmó que, en principio, las semillas de orquídea se pueden sembrar cuando la
semilla se encuentra en el estadío intermedio entre la fertilización y la
maduración de la
cápsula.El mismo recomienda que las semillas no se deben sembrar in vitro, antes de que la
cápsula haya llegado a los dos tercios de su madurez.En la tabla que se da a continuación
(Lucke 1971) se indican los períodos de tiempo entre la fertilización y la madurez.
Calanthe
4 meses
Cattleya
11 meses
Coelogyne
13 meses
Dendrobium
12 meses
Epidendrum
4 meses
Miltonia
9 meses.
Odontoglossum 7 meses
Phalaenopsisi
6 meses.
2.4.-ESTERILIZACION.
La esterilización se realiza de dos formas:
1.-CAPSULAS CERRADAS.-En este caso la esterilización es muy simple:
Se baña la cápsula en alcohol de 96% y posteriormente se flamea.
La cápsula que contiene las semills, que generalmente está estéril en su interior, luego se abre
con una escapel estéril.
2.-CAPSULAS ABIERTAS.- La esterilización de las semillas individuales constituye un
proceso más delicado y complejo.Se colocan las semillas en un pequeño matráz conteniendo
lejía al 10% t Tween 20 en una proporción de 2-5 % (v/v).La esterilización se realiza durante
5-10 minutos. Las semillas viables se hunden en la lejía, mientras los que flotan, no
contienen embrión.Después de la fertilización el líquido es retirado, bien por vertido, o con
la ayuda de una pipeta, posteriormente se aclaran las semillas con agua esterilizada.
2.5.-LA SIEMBRA.
La siembra se realiza generalmente sobre un medio nutritivo sólido con una cierta
pendiente.Se utiliza una espátula aguja de siembra para distribuir las semillas de forma
uniforme sobre el medio, también se pueden suspender las semillas en agua estéril y hacer la
siembra por medio de una gota (Arditti,1982). Las semillas se siembra sobre el agar.
La densidad a la que se siembran dependen de la proporción de las semillas viables y también
de la especie de orquídea de que se trate.
Smith (1975) afirmó que la cubierta seminal no tiene efecto inhibidor sobre la germinación.
Sin embargo, Van Der Kinderen (1982) indica que la germinación de algunas orquídeas, es
influida por la concentración de ABA de las semillas:
De manera que si la concentración de ABA es alto, la germinación es baja.
Para ser trasplantado al suelo, es necesario repicar las plántulas de orquídeas dos a tres veces.
El medio en el que se repican es generalmente diferente de la siembra. El tiempo que las
orquídeas permanecen en el tubo es muy variable : entre 6 meses y 2 años.
El repicado es necesario, sino se realiza las plantas llegan a estar demasiado apretados y el
crecimiento es lento.
Las orquídeas in vitro se refieren en grupos, ya que las semillas crecen así mejor que cuando
están aislados.
Cuando las orquídeas se trasplantan al suelo, generalmente se llevan en macetas madre.
2.6.-FACTORES QUE AFECTAN A LA GERMINACION Y AL CRECIMIENTO.
Los factores complejos que influyen la germnación y el crecimiento de orquídeas, además
dependen en gran medida de la especie.Esta información se ha recopilado con la ayuda de los
siguientes artículos: Arditti (1967,1977,1982), Arditti y Ernst (1982), Fast (1980) Hadley
(1975, 1982), Harley (1969) , Rao (1977), Thomale (1957) y Zimmer (1980).
Las Revistas American orchid Society bulletin, die orquidae.
1.-La temperatura.-Las semillas germinan a 20- 25°C.
2.-LUZ.- La duración del día es de 12-16 horas ( tubos fluorescentes) se aconseja una
irradiación baja de 2.5-10 w/m2.
3.-AGAR.-La concentración recomendada es de 0.6 - 0.8 % (Bacto-Agar-Difco).
4.-MINERALES.-Se recomienda utilizar un medio que contenga micro-macronutrientes.
Las orquídeas generalmente necesitan Fe para germinar y es muy probable que necesite
Mn.
Las orquídeas terrestres requieren un medio, pobre en sales, mientras las epífitas necesitan un
medio más rico en sales.
5.-AZUCAR.-Es importante como fuente de energía, especialmente para las semillas que
germinan en la oscuridad. Por lo general se emplea Sacarosa, a veces se utiliza una mezcla de
glucosa y fructosa.
6.-EL pH debe situarse entre 4.8-5.8 . Un pH más bajo de 4 o más alto de 7 resulta muy
desfavorable.
7.-VITAMINAS.-Es necesario añadir las siguientes vitaminas : biotina, ácido Nicotínico,
vitamina C, piridoxina, ácido pantoténico.
8.-LOS REGULADORES.- Generalmente no son necesarios para la germinación de las
semillas y su presencia puede producir efectos no deseados ( Formación de callos ,
o
vástago Adventicio) . Concentraciones bajas de IBA y NAA, a veces estimulan el crecimiento
de las plántulas de endrobium, Cattleya y otros.
9.-MEZCLAS COMPLEJAS.- Se utiliza el homogenizado de plátano, Leche de coco,
peptona, triptona, Levadura de fermentación, Hidrolizado de caseína, jugo de piña, jugo de
tomate y extracto de patata.Los efectos estimuladores de estas mezclas se explica por su
contenido en vitaminas y aminoácidos.
III.- OBJETIVOS.
IV.-MATERIALES Y METODOS,
A.- MATERIALES.
a.-MATERIALES VEGETALES.
Semillas provenientes de cápsulas dehiscentes.
Brotes vegetativos de 5-15 cm de longitud.
Frutos inmaduros (cápsulas).
b.-REACTIVOS Y OTROS.
-Sales Nutritivas Básicas del medio de cultivo Murashige Skoag (1962).
-Medio Knudson C (1946)
-Agar
-Gel-Rite.
-Sucrosa
-Tiamina
-Carbón activado
-Kinetina
-Alcohol etilico al 96%
-Hipoclorito de calcio
-Hipoclorito de sodio al 10%
-Teween 20
-Trifenil tetrazolium
-Tubos de ensayo
-Tapones de tubos
-Macetas de plásticos y arcilla.
-Carbón vegetal
-Polipropileno.
-Musgo
METODOS.
Se aplican las técnicas de cultivo in vitro en la propagación de las especies de orquídeas, a
partir de semillas (Arditti, 1982) y de yemas (Marel,1984) de la siguiente manera.
1.-SIEMBRA DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CAPSULA DEHISCENTE.
Para su esterilización las semillas pueden colocarse en un pequeño sobre de papel de filtro
bien cerrado, a fin de evitar que se pierdan las semillas durante el enjuague.
Se utiliza el Hipoclorito de calcio ó sodio al 2%, durante 15-25 minutos.
Pasado este tiempo el sobre es trasladado a agua destilada estéril para el enjuague.
Luego se procede a sembrar las semillas en condiciones asépticas en el medio basal de
Muraashige y Skoog (1962), suplementado con 0.4mg/L de Tiamina, 0.5mg/L de Acido
nicotínico, 2g/L de Carbón activado, 2g/L de Gel-Rite o 8g/L de Agar y 20g/L sucrosa, y en
el medio Knudson C suplementado en 20 g/L de sucrosa, 2g/L de Carbón activado, 2g/L de
Gel-Rite o 8g/L de Agar ,( León Fernández Marco 1995).
2.-PROPAGACI0N POR YEMAS DE BROTES VEGETATIVOS.
Se colectaron brotes vegetativos de Cattleya Máxima y Cattleya Rex en pleno crecimiento de
5 a 15 cm de longitud, mediante el corte en la parte basal.
Se eliminaron los restos de tejidos muerto que podría ser fuente de contaminación.Los brotes
fueron lavados con una escobilla suave, agua y detergente para luego ser sumergido por unos
segundos en alcohol al 75 %.
Se hicieron dos esterilizaciones superficiales.En la primera esterilización los brotes fueron
sumergidos por 20 minutos en una solución de Hipoclorito de sodio al 4% a la cual se agregó
Tween -20 (2 gotas/100ml).
Pasado este tiempo el brote se ubica en una placa petri estéril y se eliminan las hojas
envolventes descubriendo las yemas.
Se realiza la segunda esterilización de los brotes sumergidos por 10 minutos en una solución
de Hipoclorito de sodio al 2% a la cual se agregó 2 gotas /l00 ml de tween 20.
Se enjuaga con agua destilada estéril y se ubican en placa estéril .(Tesis, León Fenández,
1995).
El aislamiento de las yemas de brote vegetativo se realiza mediante cortes laterales a las
yemas expuestas.
Los explantes sembraron en medio basal de Murashije y Skoog (1962).
ACLIMATACION DE LAS ORQUIDEAS.
Luego del segundo replante,, cuando las plantas desarrollaron varias hojas y un buen sistema
radicular, fueron extraídos de los frascos y sometidos al proceso de aclimatación.
1.-PREPARACION DEL SUSTRATO.
El sustrato en el que se sembraron las plántulas fue una mezcla de musgo y pequeños trozos
de carbón 3 partes de musgo: 1 parte de carbón) que permite una buena retención de
humedad y a la vez un buena ventilación de las raíces.
Este sustrato fue esterilizado en una estufa a 80°C por 6 horas.
2.-PREPARACION DE LAS PLANTULAS.
Las plantas fueron retiradas de los frascos limpiados y lavados eliminando el agar adherida a
las raices. Se eliminan las raíces delgadas que podría ser una vía de infección para la plántula.
Se seleccionaron plántulas por tamaños: Grandes, medianos y pequeños.
3,-SIEMBRA.
Se sembró por grupos en macetas comunitarios cuyo tercio inferiior fue llenado con pedazos
pequeños de polipropileno y dos tercios superior rstante con el sustrato estéril (Wright-Tippit,
1994). (Tesis León Fernández, 1995).
Luego de ser sembrados las plántulas se trasfieren a la cámara de Aclimatación que esta
condiocionado para proporcionar una alta humedad y evitar su deshidratación.
V.- BIBLIOGRAFIA.
1.-ALEX D. HAWKES . Encyclopaedia of cultivated Orchids.
2.-H.T Hartmann, D.E Kester.F.T. davies. 1997. Plant Propagation Principles and Practices6ta Edición.
3.-PIERIK R.L.M. 1989. Cultivo in vitro de las plantas superiores.
4.-LEON MARTINEZ, Marco A. TESIS. CONSERVACION DE ESPECIES PERUANAS
DE ORQUIDEAS UTILIZANDO TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO 1995.
5.-MICROPROPAGACION. http:/grffin.rbgkew.org.uk/microprop.
Royal Botanic Gardens, Kew: Information sheets:
6.-THE
Many
Dimensions
of
Plant
horticulture.tamu.edu/tissult/pltissue/pltissue.
Tissue
Culture
Research..
http:/aggie-