11.10_García SantoyoV - Universidad Autónoma de Querétaro

AFINIDAD DE FRACCIONES CONCENTRADAS DE LECTINAS DE FRIJOL TÉPARI
(Phaseolus acutifolius) POR ERITROCITOS HUMANOS
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García Santoyo V1, Mendiola Olaya E2, Blanco Labra A2, García Gasca T3.
Facultad de Química. 3Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Autónoma de Querétaro.
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Departamento de Bioquímica y Biotecnología de Plantas. CINVESTAV-Irapuato.
RESUMEN
Las lectinas son proteínas capaces de unirse a moléculas de azúcar. Los eritrocitos presentan en
su membrana glicoproteínas que pueden ser reconocidas de manera específica o inespecífica por
lectinas causando aglutinación. Dicha aglutinación puede ser inhibida por carbohidratos que
presenten mayor afinidad por la lectina. El objetivo del trabajo fue determinar el grado de
afinidad de una fracción concentrada de lectina (FCL) de frijol térapi (Phaseolus acutifolius) y
sus dos subfracciones separadas por cromatografía de exclusión de peso molecular (pico A, PA y
pico B, PB) así como la afinidad por diferentes carbohidratos de la fracción más activa. Se
obtuvo sangre de donadores voluntarios, la cual se tipificó de acuerdo a los antisueros contra
sangre tipo A, B y O, todas con Rh positivo. Los eritrocitos fueron fijados con glutaraldehído y la
actividad aglutinante se determinó mediante el método de diluciones dobles seriadas. El PA fue
capaz de diferenciar entre eritrocitos de distinto tipo sanguíneo además de presentar mayor
afinidad por eritrocitos de tipo A+. Estas propiedades no las presentaron la FCL y PB. Por otro
lado, se observó que PA presentó mayor afinidad por carbohidratos como xilosa, maltosa,
rafinosa y glucosa. Los resultados obtenidos muestran que la FCL y las subfracciones PA y PB
presentan lectinas con diferentes grados de afinidad y los eritrocitos humanos A+ fueron son los
más afines.
INTRODUCCIÓN
Las lectinas constituyen un grupo de proteínas de origen no inmune que comparten en
común la propiedad de enlazarse de forma específica y reversible a carbohidratos, ya sean libres
o que formen parte de estructuras más complejas. Contienen al menos 2 sitios de unión, de ahí
que puedan enlazarse en primer lugar a un azúcar específico y en forma secundaria a una
molécula glicosilada. Se utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la
estructura de las membranas, detección de transformaciones malignas, purificación de
glicoconjugados, estudios citogenéticos, así como también en ensayos histoquímicos, enzimáticos
y en la tipificación de grupos sanguíneos. Las interacciones de estas proteínas con células pueden
ser inhibidas en muchos casos por azúcares(1).
Las membranas de las células del organismo humano, incluyendo los eritrocitos, están
formadas por varias capas de moléculas lipídicas, proteicas y carbohidratos distribuidos en tal
forma que permiten una separación entre el medio intracelular y el medio extracelular. Los
carbohidratos se encuentran formando oligosacáridos y polisacáridos que en su mayor parte están
ligados a lípidos y proteínas. Muchas de estas sustancias es decir, glicolípidos y glicoproteínas
tienen capacidad antigénica y en los eritrocitos constituyen los llamados grupos sanguíneos(2, 3).
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Todos los sujetos normales sintetizan un glucano central común, denominado antígeno O,
que está unido a un esfingolípido. Un único locus genético codifica tres alelos comunes de una
enzima glucotransferasa. El producto genético del alelo O carece de actividad enzimática,
mientras que el producto génico del alelo A transfiere una porción N-acetilgalactosamina
terminal y el producto génico del alelo B transfiere una porción galactosa terminal(4).
Los métodos actuales para determinar la actividad de lectinas se basan en su capacidad
para reconocer oligosacáridos de membrana sin embargo, existe mucha controversia respecto a la
forma de cuantificar dicha actividad. Algunos estudios utilizan eritrocitos de conejo (que han
mostrado gran afinidad por ciertas lectinas) aunque no se cuenta con un método para tipificarlos y
con ello se pierde reproducibilidad en la técnica. Otros estudios han utilizado eritrocitos
humanos, lo cual puede disminuir la variabilidad en el método. Por lo anterior, el objetivo del
presente trabajo fue determinar el grado de afinidad de los diferentes tipos sanguíneos por la FCL
y sus dos subfracciones denominadas pico A (PA) y pico B (PB) obtenidas a partir de extractos
proteínicos acuosos de frijol Térapi.
MATERIALES Y METODOS
La FCL y sus subfracciones, PA y PB, fueron obtenidos mediante cromatografía de
exclusión molecular y proporcionados por el Dr. Alejando Blanco Labra del CINVESTAVIrapuato. Las muestras sanguíneas fueron proporcionadas directamente por donadores conocidos
o proporcionados por la Maestra Susana Flores Robles de la Unidad de Servicios Clínicos de la
Facultad de Química de la UAQ. Los tipos sanguíneos utilizados fueron A, B y O, con Rh
positivo. Para recuperar sólo los eritrocitos, las muestras fueron lavadas con PBS 1X, se
tripsinaron llevando el volumen a una concentración de tripsina al 1%, se fijaron con
glutaraldehído al 0.1% y se resuspendieron en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) 1X para
su almacenamiento(5). La FCL, PA y PB; fueron preparadas 1:1 con PBS 1X; cuantificándose en
cada solución la concentración de proteína por la técnica de Bradford (1976)(6).
Las pruebas de hemaglutinación se realizaron colocando 100 µL de proteína en el primer
pozo de una placa de 96 pozos, 50µL de PBS a partir del pozo 2 hasta el pozo 12. Del primer
pozo se tomaron 50µl de la solución de la proteína y se pasaron al segundo pozo, de éste segundo
pozo se tomaron otros 50µL de la dilución y se pasaron al tercer pozo, siguiendo de la misma
forma hasta el último pozo(7). Las diluciones se hicieron por duplicado. Finalmente se agregaron
50 µL de eritrocitos, en una concentración menor al 1%, en cada pozo. Las placas se dejaron
incubando durante 2 horas a 36.4°C y se almacenaron en refrigeración durante 24 h para su
posterior observación al microscopio.
La prueba de inhibición de aglutinación por carbohidratos se realizó colocando 100 µL de
proteína en el primer pozo y se sustituyó el PBS 1X por 50 µL de las soluciones de los
carbohidratos en una concentración de 200 mM cada uno en PBS 1X, para finalmente agregar 50
µL de eritrocitos en una concentración menor al 1%. Las disoluciones se hicieron en serie y por
duplicado para cada carbohidrato. Los carbohidratos utilizados fueron: xilosa, ribosa, glucosa,
maltosa, sacarosa, sorbitol, fructosa, arabinosa, rafinosa, galactosa. La fracción de proteína
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utilizada para ésta prueba fue PA y el tipo de sangre utilizado fue A+. Para la cuantificación de la
actividad aglutinante se utilizó la ecuación:
2n
AE=------mg
Donde: AE=actividad específica aglutinante (U/mg) expresada en unidades por mg de
proteína, n=última dilución con aglutinación apreciable al microscopio, mg es la cantidad de
proteína.
El análisis estadístico se llevó a cabo mediante ANOVA para la comparación entre
tratamientos y (Tukey, p<0.05) y para la comparación entre cada tratamiento respecto al control
(Dunnett p<0.05) utilizando el programa SPSS versión 14.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Utilizando una curva patrón con albúmina (y = 0.0085x + 0.1676) se determinó la
concentración de proteína de las soluciones 1:1 de las fracciones estudiadas (Tabla 1).
Tabla 1. Concentración de proteína de la FCL (G75), pico A y pico B.
Fracción
pico A
pico B
FCL
mg/100µL
0.119
0.097
0.066
Actividad aglutinante (U/mg proteína)
La Figura 1 muestra la comparación de las actividades aglutinantes de la FCL, PA y PB
sobre eritrocitos de distintos tipos sanguíneos. El pico A fue capaz de reconocer diferencialmente
los distintos tipos sanguíneos (p<0.05) mientras que la FCL y PB no presentaron reconocimiento
selectivo. Adicionalmente puede observarse que los eritrocitos del grupo A+ fueron más afines a
PA que los eritrocitos de los grupos B+ y O+.
9000
c, C
8000
7000
6000
5000
b
B
4000
A+
C
B+
O+
a
3000
2000
1000
0
FCL
PA
PB
Figura 1. Comparación de la actividad aglutinante de la FCL, PA y PB sobre eritrocitos humanos de
diferentes tipos sanguíneos. Las letras minúsculas indican diferencia estadística significativa entre muestras para un
mismo tipo sanguíneo (Tukey, p<0.05). Las letras mayúsculas indican diferencia estadística significativa entre tipos
sanguíneos entre las diferentes muestras (Tukey, p<0.05).
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Actividad aglutinante (U/mg proteína)
Posteriormente, se determinó la afinidad de las lectinas presentes en PA utilizando
carbohidratos y eritrocitos del grupo A+. Todos los carbohidratos probados mostraron afinidad
por la lectina estudiada (p<0.05), principalmente xilosa, maltosa, rafinosa y glucosa.
9000
8000
c
7000
6000
a, b*
5000
a, b*
a, b* a, b*
a, b* a, b*
4000
a*
3000
a*
a*
2000
a*
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 2. Afinidad de carbohidratos por las lectinas presentes en el pico A. 1-control sin carbohidratos, 2-ribosa,
3-xilosa, 4-arabinosa, 5-galactosa, 6-fructosa, 7-glucosa, 8-sorbitol, 9-sacarosa,10- maltosa,11-rafinosa. Las letras
minúsculas indican diferencia estadística significativa entre muestras para un mismo tipo sanguíneo (Tukey, p<0.05).
Los asteriscos indican diferencia significativa entre cada tratamiento respecto al control sin carbohidratos.
CONCLUSIONES
La fracción PA fue más afín a eritrocitos de tipo A+, además de que identificó entre eritrocitos de
tipo A+, B+ y O+. La FCL y PB no fueron capaces del reconocimiento diferencial. El PA
presentó mayor afinidad por xilosa, maltosa, rafinosa y glucosa. Los resultados sugieren que PA
y PB contienen diferentes lectinas o formas con diferente actividad.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a todos los donadores de las muestras sanguíneas, especialmente a la maestra Susana Flores Robles de
la Unidad de Servicios Clínicos de la Facultad de Química de la UAQ, por su amable disposición y ayuda.
BIBLIOGRAFÍA
1. Hernández DP, Martín GO, Rodríguez de Pablos Vélez Y, Ganem BF. Aplicaciones de Las Lectinas. Rev Cubana
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lectins. Anal. Biochem. 68:651-653. 1975
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7. Jaffé, W. Hemagglutinins (lectins). In: Toxic constituents of plant foodstuffs. Academic Press. New York, N. Y.
pp. 73-102. 1980
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