Physiological responses of the ghost shrimp Neotrypaea uncinata

RESPUESTA FISIOLÓGICA DE NEOTRYPAEA UNCINATA A LA DISPONIBILIDAD DE
OXÍGENO Y RECUPERACIÓN LUEGO DE LA HIPOXIA AMBIENTAL SEVERA
Leiva, F.P.1, 2, Urbina, M.A.3, Cumillaf, J.P.1, Gebauer, P.2 y Paschke, K.1
1
Instituto de Acuicultura, Universidad Austral de Chile, Puerto Montt, Chile; 2Centro i~mar, Universidad de Los
Lagos, Puerto Montt, Chile. 3Department of Biosciences, College of Life and Environmental Sciences, University of
Exeter, Exeter, United Kingdom. [email protected]
Introducción
La hipoxia es definida como una falta de oxígeno que puede ser de origen ambiental o funcional (Farrell &
Richards 2009). A diferencia del medio aéreo, este fenómeno en el medio acuático es frecuente y usualmente
impredecible (Zonas Mínimas de Oxígeno), o inestable pero predecible para cierto ambientes como los marismas
intermareales (Seibel 2011). A pesar de estos desafíos, algunos taxa son capaces de vivir en estos ambientes, siendo
los invertebrados bien conocidos por su habilidad de tolerar la hipoxia severa o aún más, anoxia (Herreid 1980;
Grieshaber et al. 1994). Los crustáceos talasínidos son uno de los grupos que habitan en estos ambientes. Ellos viven
en madrigueras de arena o barro donde los eventos de hipoxia son frecuentes y consecuentemente han desarrollado
cierto grado de tolerancia a dicho factor (Atkinson and Taylor, 2005). Neotrypaea uncinata, comúnmente conocido
como nape o camarón fantasma, es un talasínido de amplia distribución (Sur de México a Península de Taitao,
Chile). En el sur de Chile, las mareas son típicamente semidiurnas, con un periodo de aproximadamente 12,4 h y una
amplitud máxima de cerca de 7 m. Adicionalmente, debido a la baja pendiente batimétrica costera, la zona
intermareal de dichas playas en las cuales habita N. uncinata podrían extenderse por varios kilómetros (por ejemplo,
Pelluhuín, cerca de Puerto Montt).
El presente estudio exploró la respuesta fisiológica que permite a N. uncinata desempeñarse en un ambiente
donde la disponibilidad de oxígeno es variable. Dado que tanto los eventos de hipoxia (baja marea) así como la
recuperación (pleamar) son controlados por el mismo conductor y coinciden temporalmente, nosotros hipotetizamos
que i) N. uncinata es tolerante a condiciones hipóxicas, mostrando una alta capacidad regulatoria y ii) que la
recuperación debiera ocurrir durante un periodo determinado por la altura de marea (6 h). El estatus fisiológico y el
metabolismo fueron medidos en ejemplares adultos de esta especie expuestos a diferentes presiones parciales de
oxígeno (pO2) y tiempos de recuperación. La presión crítica de oxígeno (pcrit) y la capacidad oxi-regulatoria (R)
fueron también evaluadas y usadas como indicadores de tolerancia a la hipoxia en esta especie.
Materiales y métodos
Machos adultos de N. uncinata fueron capturados desde el intermareal de Puntilla Tenglo, Puerto Montt, Chile
(41º 28’ S; 72º 56’ W) y luego transportados en contenedores plásticos con arena del mismo sitio de colección hasta
el Laboratorio de Ecofisiología de Crustáceos (LECOFIC), en la Universidad Austral de Chile, Puerto Montt, Chile.
Para prevenir agresiones, los camarones fueron mantenidos en refugios plásticos individuales, con flujo de agua de
mar (32,3 ± 0,2 PSU) constante, aireación, y a temperatura controlada de 11,5 ± 0,2 ºC. Los camarones fueron
aclimatados a estas condiciones por tres semanas, siendo alimentados hasta 48 h antes de que comiencen los
experimentos. Todos los experimentos fueron conducidos dentro de una cámara de temperatura y luz controlada a las
mismas condiciones descritas anteriormente para el mantenimiento de los animales y usando agua de mar esterilizada
(UV) y filtrada (1 µm).
Serie 1: Respuesta fisiológica a diferentes pO2(s) y recuperación después de la hipoxia severa. Un total de 42
camarones fueron distribuidos dentro de 5 tratamientos experimentales de pO2(s): 21 (n=6), 12 (n=6), 8 (n=6), 4
(n=6) y 2 kPa (n=18). Siendo las cuatro últimas preparadas con burbujeo de nitrógeno (N2). En cada tratamiento, los
camarones fueron expuestos por 6 h en cámaras respirométricas sumergidas en un baño de temperatura controlada a
11,5 ± 0,1ºC. El contenido de oxigeno fue medido al inicio y final de cada periodo (6 h) para el calculo de la MO2.
Luego de este periodo, a todos los camarones, con excepción de un sub-set de 12 de ellos, se les tomaron muestra de
hemolinfa. Los 12 camarones restantes fueron luego incubados en agua normóxica (21 kPa), permitiendo su
recuperación en esta condicion por 6 h (n=6) y 12 h (n=6). Después de este periodo, su hemolinfa fue tomada.
Serie 2: Efecto de la hipoxia severa y tiempo de recuperación. Se usó un set de 24 diferentes camarones
distribuidos dentro de 4 tratamientos experimentales (n=6 por tratamiento) de 24 h en normoxia (control, 21 kPa),
severa hipoxia 12 h (2 kPa), severa hipoxia 12 h + recuperación 6 h (21 kPa) and severa hipoxia 12 h + recuperación
12 h. Las determinaciones de MO2 y el muestreo de hemolinfa fueron conducidos de manera similar que los
experimentos de la Serie 1. La tasa de consumo de oxígeno (MO2) fue medida en ambas series experimentales al
inicio y final de un periodo de incubación de 6 h, usando cámaras respirométricas de 5 L y empleando un sensor
óptico conectado a un oxigenómetro Microx TX3 AOT (PreSens, GmbH, Germany). Una vez obtenidos los valores
de MO2 individuales para aquellos tratamientos entre 21-2 kPa, se calculo la pcrit mediante una regresión lineal
segmentada. La capacidad oxiregulatoria de N. uncinata fue evaluada usando un valor de “R”, siguiendo el método
descrito por Alexander & McMahon (2004). Cerca de 500 µL de hemolinfa fueron retiradas usando jeringas
desechables de 1 mL, transferidas a microtubos de 1,5 mL e inmediatamente congeladas a -80ºC en un ultrafreezer
hasta el análisis. La concentración de oxi-hemocianina (Oxy-Hc) fue medida espectrofotométricamente a 335 nm.
Las proteínas en la hemolinfa fueron determinadas por el método de Lowry. La concentración de Lactato (Hem-Lact)
fue determinado usando un método colorimétrico de acuerdo al Lactate Assay Kit (Spinreact, S.A. /S.A.U., Spain).
Todos los datos son presentados como promedio ± desviación estándar. Las diferencias en MO2, Oxy-Hc, Hem-Prot
y Hem-Lact entre tratamientos (pO2, hipoxia y recuperación) fueron testeadas con un ANOVA a una vía, seguido por
un test a posteriori de Tukey. La distribución normal y homegeneidad de varianzas fueron chequeadas previamente
con el test de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. Para el cálculo del índice R, se escogió la mejor
curva de regresión en base a r2. Diferencias fueron consideradas significantes con un valor de P < 0,05 (Zar 2010).
Resultados
Respuesta fisiológica a diferentes pO2 y después de la recuperación de la hipoxia severa
N. uncinata oxi-reguló de normoxia (21 kPa) hasta un pcrit of 8,46 ± 1,32 kPa (Figura 1A, línea vertical
segmentada). La MO2 en normoxia (21 kPa) promedió 5,39 ± 0,40 µmol O2 g-1 h-1 y los camarones mantuvieron esta
tasa hasta 8 kPa (4,96 ± 0,37 µmol O2 g-1 h-1; Test de Tukey, P > 0,05, Figura 1A). Por debajo de este nivel, la MO2
disminuyó a 3,56 ± 0,36 µmol O2 g-1 h-1 y 3,11 ± 0,36 µmol O2 g-1 h-1, a 4 kPa y 2 kPa respectivamente. Durante las
primeras 6 h de recuperación en normoxia, la MO2 permaneció elevada, sin embargo, después de 12 h de
recuperación retorno a los valores de exposición pre-hipoxia. No hubo diferencias en los valores de Oxy-Hc en
camarones expuestos a 21, 12, 8 y 4 kPa, mostrando un promedio de 1,03 ± 0,07 mmol L-1 (Test de Tukey, P > 0,05;
Figura 1B). Sin embargo, a 2 kPa, incrementó a 1,62 mmol L-1. Durante la recuperación, tanto a 6 h ó 12 h en
normoxia, los valores de Oxy-Hc retornaron a los valores de exposición pre-hipoxia. De manera similar, la Hem-Prot
no cambio sino hasta 8 kPa, promediando un valor en este rango de 56,59 ± 1,00 mg mL-1 (Test de Tukey, P > 0,05;
Figura 1C). El valor más alto en Hem-Prot fue observado en camarones expuestos a 2 kPa, con un promedio de 80,32
± 12,23 mg mL-1. Cuando los camarones retornaron a condiciones de normoxia, tanto a 6 h ó 12 h, la Hem-Prot
retorno a los valores observados en el rango de 21-8 kPa. El Hem-Lact no cambió de normoxia (21 kPa) hasta los 8
kPa, pero incrementó significativamente a 8 kPa y 2 kPa, con valores de 11,54 ± 4,94 mmolL-1 y 15,8 ± 3,18 mmol L1
, respectively. Cuando los camarones retornaron a condiciones normóxicas, tanto por 6 h ó 12 h, los valores de
Hem-Lact fueron similares a aquellos reportados entre 21 y 8 kPa (Test de Tukey, P > 0,05; Figura 1D).
Figura 1. Respuesta fisiológica de N. uncinata expuesta a diferentes pO2 (s) y después de la recuperación de la
hipoxia severa. A) Consumo de oxígeno (MO2, µmol O2 h-1 g-1) y pcrit (línea vertical segmentada), B) oxi-hemocianina
(Oxy-Hc, mmol L-1), C) proteínas en la hemolinfa (Hem-Prot, mg mL-1) y D) concentración de L (+) lactato (HemLact, mmol L-1). El gráfico secundario a la derecha muestra la respuesta fisiológica respectiva a 6 h y 12 h de
recuperación, luego de 6 h de hipoxia severa (tratamiento de 2 kPa), en condiciones normóxicas (círculos blancos).
Los datos son presentados como promedio ± desviación estándar (n = 6). Diferencias siginificativas son indicadas
por letras diferentes (Test de Tukey, P < 0,05).
Efecto de la longitud de la hipoxia y tiempo de recuperación
El MO2 de los camarones mantenidos en hipoxia por 12 h disminuyó un 49,69% respecto a aquellos mantenidos en
normoxia. Luego, durante las primeras 6 h de recuperación, el MO2 aumento significativamente, siendo más alto que
los valores del control e hypoxia. Sin embargo, a 12 h de recuperación retornaron, la MO2 retorno a los valores
control (Figura 2A). La Oxy-Hc incrementó en un 81% durante la exposición a 12 h de hipoxia (P < 0,05; Figura 2B)
comparado con el tratamiento control. Tanto a 6 h como a 12 h de recuperación, la Oxy-Hc retorno a los valores del
tratamiento control. Comparada a los valores control, la Hem-Prot incremento en un 75% durante las primeras 12 h
de exposición en hipoxia (P < 0.05; Figura 2C). Sin embargo, tanto a 6 h como a 12 h, la Hem-Prot retornó a los
valores del tratamiento control. La concentración de Hem-Lact de camarones expuestos a 12 h de hipoxia fue 1,2
veces mas alta que el tratamiento control, pero, al igual que la Oxy-Hc y Hem-Prot retornó a los valores control,
cuando fueron expuestos tanto a 6 y 12 h (Figura 2D).
Figura 2. Respuesta fisiológica de N. uncinata a la hipoxia severa prolongada (2 kPa; 12 h) y diferentes tiempos de
recuperación. (A) Consumo de oxígeno (MO2, µmol O2 h-1 g-1), (B) oxi-hemocianina (Oxy-Hc, mmol L-1), (C)
proteínas en la hemolinfa (Hem-Prot, mg mL-1) y (D) concentración de L(+) lactato (Hem-Lact, mmol L-1) de N.
uncinata expuesta a normoxia (Control), hipoxia (H12), o hipoxia seguida por 6 h (H12+R6) y 12 h (H12+R12) de
recuperación en condiciones normóxicas. Diferencias significativas son indicadas por letras diferentes (Test de
Tukey, P < 0,05).
Capacidad oxi-regulatoria
La capacidad de oxi-regulación de N. uncinata fue calculada por la integración del area bajo la curva, la cual
mostró un valor R de 71,54%, indicando que los adultos de esta especie tienen la habilidad para oxi-regular (Figura
3).
Figura 3. Capacidad de regulación de N. uncinata. El valor de regulación “R” está indicado por el area bajo la curva,
de acuerdo a Alexander & McMahon (2004).
Discusion
Nuestros resultados muestras que los adultos de N. uncinata son tolerantes a la hipoxia, regulando su consumo de
oxigeno hasta ~8.46 kPa y luego de ello, hace uso del metabolismo anaeróbico por debajo de este umbral. De
acuerdo a datos publicados en otras especies, las MO2 obtenidas en este estudio fueron bajas, lo que indicaría que
dicha respuesta podría ser funcionalmente adaptativa en talasínidos, característica fundamental para desempeñarse en
ambientes con baja disponibilidad de oxígeno (Thompson & Pritchard 1969). Si bien, dentro del grupo, las pcrit es
alta, existen varios factores tanto bióticos como abióticos que pueden afectar dichos resultados (Herreid, 1980).
Adicionalmente, la oxigenación a los tejidos es aumentada por incrementos en la concentración y afinidad de los
pigmentos respiratorios como la hemocianina (Gorr et al. 2010). Dicha respuesta, es observable en ambas series de
experimentos, donde tanto las Hem-Prot y la Oxy-Hc aumentan significativamente durante la hipoxia severa. Aunque
este fenómeno ha sido descrito en varias especies de decápodos como Carcinus maenas (Taylor & Anstiss 1999),
Callinectes sapidus (Defur et al. 1990), Macrobrachium rosenbergii (Chen & Kou 1998), and Lithodes santolla
(Urbina et al. 2013), un aumento de ellas resulta contrainstuitivo, ya que la sínteisis involucra un gasto de energía, lo
que nos lleva suponer que existen reservas de proteínas que son liberadas sin necesidad de incurrir en un costo extra
de energía.
La activación de vías anaerobicas durante periodos de recuperación post-hipoxia es crucial para el
restablecimiento de reservas de energía, del balance osmótico y ácido-base, asi como para remover productos tóxicos
acumulados durante la hipoxia. El lactato en crustáceos es el principal producto final de la anaerobiosis, y asi fue
demostrado en N. uncinata, donde alcanza valores máximos durante la hipoxia, pero luego de la reoxigenacion es
rápidamente oxidado, llegando a los mismos valores del tratamiento control. Varios estudios han mostrado una
relación durecta entre entre la duración de la hipoxia y la magnitud de la deuda de oxigeno como una consecuencia
de los productos anaeróbicos generados. Nuestro estudio muestras que los camarones previamente expuestos tanto a
6 h como a 12 h de hipoxia severa se recuperan completamente antes de 6 h de reoxigenación. Futuros experimentos
que evalúen el consumo de oxígeno con tiempos de recuperacion de más alta resolución seran útiles para determinar
más precisamente cuando ocurre la recuperación completa.
Conclusión
N. uncinata es tolerante a bajas presiones presiones parciales de oxígeno (pO2), mostrando una estrategia de oxiregulación, concordante con nuestra primera hipótesis. Los mecanismos usados por N. uncinata involucran un
incremento en las concentraciones de Hem-Prot y Oxy-Hc a bajas pO2 (2 kPa). Sin embargo, un desacople entre estas
dos variables sugiere un cambio en la afinidad del oxígeno por la hemocianina y el lactato puede estar involucrado
como un cofactor. Consistente con nuestra segunda hipótesis, con la excepcion de la MO2, todas las variables
fisiológicas evaluadas retornaron a los valores control antes de 6 hde reoxigenación, un marco de tiempo
ambientalemnet relevante considerando el ciclo de marea del hábitat de N. uncinata.
Referencias
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