Ozono y fosfolipasa A2

EL PRECONDICIONAMIENTO OXIDATIVO CON OZONO Y SUS ACCIONES
SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA MEMBRANA Y LA ENZIMA
FOSFOLIPASA A2
Rodolfo López Pérez, Adrián Sanchez Machado, Jeovanis Gil Valdés, Yahelín Ferrer Fernandez, Alain
Valdivia Acosta, Meylín Ortega Gonzalez, Ivonnes Hernández Balmaseda.
Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de la
Habana.
El ozono es ampliamente conocido por su papel en el mantenimiento del
equilibrio ecológico, por la protección efectiva contra la entrada de los rayos
ultravioletas. Este se considera uno de los mayores oxidantes al que los
humanos estamos expuestos continuamente, además de ser extremadamente
reactivo capaz de reaccionar con cualquier tipo de molécula orgánica1.
A pesar de lo antes expuesto, actualmente este gas está siendo utilizado
con fines terapéuticos y se ha evidenciado su eficacia en diferentes
desórdenes fisiopatológicos.
El ozono médico es una mezcla de un 1-5% de O3 y de un 95-99% de O2.
En estos momentos, esta farmacoterapia es utilizada con muy buenos
resultados en países de Europa, tales como España, Francia, Alemania,
Rusia e Italia. También es utilizado con resultados satisfactorios en nuestro
país.
Recientemente se ha demostrado que la generación de un episodio
isquémico corto seguido de una breve reperfusión protege al miocardio y al
hígado, aparentemente a través de un mecanismo adaptativo. Este proceso
se ha demostrado experimentalmente en diferentes especies animales y en
humanos, y recibe el nombre de “precondicionamiento isquémico”3. Los
resultados experimentales que se han obtenido con el ozono han demostrado
que este es capaz de originar un estrés oxidativo controlado que estimula y/o
regula los sistemas antioxidantes endógenos precondicionando al hospedero
de forma tal que revierta los eventos fisiopatológicos del hígado mediado por
la formación de radicales libres 4, teniendo este proceso una cierta analogía
con el ya reconocido proceso de “precondicionamiento isquémico”, fenómeno
de una estrecha relación con la generación de ERO.
Más adelante ha sido demostrado que el tratamiento con ozono en
condiciones de dosis y número de tratamientos, es capaz de mantener la
homeostasis del calcio y revertir las acciones hepatotóxicas del CCl44.
Atendiendo a estos resultados y teniendo en cuenta los pocos conocimientos
acerca de las bases biológicas de la ozonoterapia asociada a la regulación del
calcio decidimos determinar experimentalmente si el ozono mimetiza las
acciones de la trifluoperazina y la lidocaina a través de la inhibición de la
enzima fosfolipasa A2 y la estabilización de la membrana, mecanismos
reconocidos internacionalmente para estos productos.
MATERIALES Y METODOS
La metodología utilizada para la determinación de los parámetros fue a
través de técnicas reconocidas para estos ensayos (Producto Reactivo del
ácido tiobarbitúrico, Técnica del DTNB, Cuantificación con O-cresoftaleina,
Complexona).
RESULTADOS Y DISCUSION
En la figura 2 se muestran los resultados obtenidos con respecto a los niveles
de calcio en homogenatos de hígado, los cuales como puede apreciarse,
muestran una disminución significativa en los grupos tratados con O3/O2 y
Lidocaína con respecto al grupo tratado con CCL4, manteniéndose la
concentración de calcio de estos grupos a nivel del control; mientras que el
grupo tratado con Trifluoperacina exhibió un aumento significativo en los
niveles de este catión con respecto a todos los grupos experimentales
exceptuando el grupo tratado con la hepatotoxina. La actividad de la
fosfolipasa incrementó significativamente en el grupo tratado con CCL4 con
respecto al resto de los grupos. Sin embargo el grupo tratado con O3/O2
mantiene la actividad de la misma similar a la Lidocaína y la Trifluoperacina,
los cuales no difirieron del control. En correspondencia con las acciones
protectoras del O3/O2 sobre la generación de ERO se apreció en el grupo
tratado con este gas un incremento significativo en los niveles de glutation en
homogenato de hígado; mientras que en suero los niveles de este
antioxidante endógeno disminuyeron considerablemente en dicho grupo. Con
respecto al resto de los grupos podemos plantear que en ambos casos
mantuvieron un comportamiento semejante al grupo control. Por último la
peroxidación lipídica se elevó, con significación estadística para el CCl4 con
respecto a todos los tratamientos; en tanto que el grupo tratado con O3/O2 no
difirió significativamente del control.
Estos resultados experimentales nos permiten plantear que los efectos
precondicionantes del ozono encontrados en este estudio se deben
fundamentalmente al control que ejerce el mismo sobre los niveles de Ca y la
consecuente inhibición de la FLA, evitando así la potenciación del daño
hepatocelular y la peroxidación lípidica evaluados a través de los niveles de
MDA. Además es importante señalar que los mecanismos que pudieran
explicar las acciones sobre el control de la homeostasis cálcica están muy
asociados a los efectos estabilizantes de membrana, pues el grupo tratado
con ozono mimetizó los efectos de la Lidocaína en los parámetros
relacionados con esta regulación.
Para llevar a cabo la experiencia se emplearon ratas hembras SD (SpragueDawley) n= 30 con un peso entre 200-250g, procedentes del CENPALAB y se
establecieron cinco grupos de trabajo con los siguientes tratamientos:
Niveles de Calcio
Actividad de la PLA2
8
3
mM/L
U/L
INTRODUCCION
2
GI
n
6
Descripción del tratamiento
y dosis
Ozono(vía rectal, 15 días),
dosis 1mg/Kg + CCL4 20%
(vía IP), dosis 1mg/Kg, día 16
GII
6
Control (+) CCL4 20 % (vía
IP), dosis 1mg/Kg
GIII
6
Lidocaína 2% (vía IP) dosis
0.2 ml 3 veces, a intervalos de
4 horas+ CCL4 20% (vía IP),
dosis 1mg/Kg
1
0
1
1
2
3
Grupos
4
6
GV
6
El sacrificio de los animales se realizó 16 días después del inicio del ensayo
y antes del mismo se le extrajo a cada animal 1ml de sangre procedente del
plexo ocular. Esta sangre se recolecto en viales, se dejo reposar 15 minutos y
se centrifugó a 30 000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (25°C)
y después se colectó el sobrenadante sanguíneo. Después de la extracción y
antes de proceder a la eutanasia de los animales los mismos se anestesiaron
con éter dietílico y se realizó la disección de los mismos para realizar una
perfusión hepática durante 5 minutos con NaCl al 0.9%. Luego se extrajo el
hígado, haciendo además un análisis macroscópico con el resto de los
órganos. El hígado es pesado íntegramente y de él se tomaron muestras
respectivas para la obtención de homogenatos para la realzación de las
determinaciones bioquímicas las cuales se hicieron por técnicas
espectrofotométricas y el sistema SUMA. Los parámetros bioquímicos
determinados fueron los siguientes: MDA, GSH, Calcio, FLA.
3
4
5
Grupos
Glutation en homogenato
4000
Trifluoperacina (vía IM) dosis
1mg/Kg+ CCL4 20% (vía IP),
dosis 1mg/Kg
Control (-) sin tratamiento
2
5
M DA
3000
2000
nM / L
1000
2000
0
GIV
4
2
0
mg/L
Grupos
6
0
1
2 3 4
Grupos
5
1
2
3
4
Grup o s
5
REFERENCIAS BILIOGRAFICAS
1.
2.
3.
4.
Pryor, W., y Squadrito, G.L. (1995). Am. J. Physiol. 268, L699-L721
Pryor, W.A (1991): The ozonization of insaturated falty acid: Aldehydes
and hydrogen peroxides as product and possible mediator of ozone
toxicity. Chem. Res in Toxical. 276-277.
Parrat JR (1994): Protection of the heart by ischaemic preconditioning:
mechanism and possibilities for pharmacological exploitation. TIPS, vol.
151: 19-25.
León, O.S; Merino, N; Castillo, R; Menéndez, S; Peréz, L; Lopéz, R;
Cruz, E. (1995): Ozone oxidative preconditioning. A protection against
cellular damage by free radical. Pharmacological Research.