ARA-CANTHUS: PUEDEN LOS GENES DE Arabidopsis AFECTAR

ARA-CANTHUS: PUEDEN LOS GENES DE Arabidopsis AFECTAR EL
METEBOLISMO SECUNDARIO DE Catharanthus?
Cázares Flores, Paulo E.; de Folter, Stefan & Marsch Martínez, Nayelli
Facultan de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de Querétaro / Centro de
Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad
Irapuato
RESUMEN
Durante las últimas décadas ha habido un gran interés en conocer y manipular las rutas
biosintéticas de diversos compuestos con actividad biológica sintetizados por las plantas.
Catharanthus roseus es una de las fuentes más importantes de estos compuestos la cual
produce poderosos antineoplásicos: Vincristina y vinblastina. Debido a que los métodos
alternativos como la síntesis química son muy costosos, las plantas siguen siendo la mejor
fuente de estos compuestos. El objetivo principal de este proyecto es estudiar de que
manera genes involucrados en la floración de Arabidopsis thaliana pueden afectar el
metabolismo secundario de Catharanthus roseus principalmente en las rutas involucradas
con la síntesis de alcaloides. Para llevar a cabo este proyecto se propone realizar
construcciones de sobreexpresión inducibles de los diversos genes seleccionados y
transformarlas en un cultivo de raíces mediante Agrobacterium rizhogenes, finalmente
cuantificar los niveles de alcaloides mediante HPLC.
INTRODUCCIÓN
Catharanthus roseus (Periwinkle), originaria de Madagascar, es un sub-arbusto perenne del
cual se han aislado diversos compuestos antineoplásicos como la vincristina y la
vinblastina. La vincristina es un poderoso alcaloide que se une a la tubulina impidiendo la
polimerización de los dímeros de tubulina, interrumpiendo la formación de los
microtúbulos (Warber, S. 1999) los cuales son críticos para la formación del huso en las
células que se preparan para la mitosis. La formación del complejo tubulina-alcaloide trae
como consecuencia que la célula sea detenida en la fase M del ciclo celular (Warber, S.
1999). Los alcaloides están formados por diversas clases de compuestos nitrogenados los
cuales se encuentran en muchas plantas y normalmente exhiben actividad fisiológica
(Hughes, E. 2002). Su biosíntesis dentro de las plantas ha atraído la atención de diversos
grupos de investigación, ya que representa uno de los más grandes retos de la ingeniería
metabólica, hasta ahora solo se conocen 20 de los 50 pasos requeridos en la síntesis de los
alcaloides más importantes de Catharanthus roseus (Loyola-Vargas y col. 2007). Una de
las alternativas para aumentar la producción de estos compuestos, es el uso de cultivo de
tejidos, principalmente el de raíces, ya que no se necesita de toda la planta completa y se
puede mejorara el tiempo de generación de biomasa bajo condiciones que son controladas.
El reto se encuentra en que cada uno de los pasos enzimáticos de la ruta metabólica de
Catharanthus roseus normalmente se encuentra en compartimentos específicos de la planta
(Hughes, E. 2002), esto quiere decir que para poder obtener la vincristina se necesita de
toda la planta.
Los órganos que forman el cuerpo de la planta consisten en diferentes tipos de células, los
cuales están organizados en relación uno a otro, lo cual confiere funciones específicas
formando un órgano (St-Pierre y col. 1999). En adición a la morfogénesis, el proceso de
desarrollo resulta en una especialización bioquímica de las células para la biosíntesis y/o
acumulación de metabolitos secundarios (St-Pierre y col. 1999).
Fig1. Ruta biosintética de alcaloides tipo indol de Catharanthus roseus
Fig. 2 Ubicación de las enzimas
involucradas en la ruta biosintética, según
el estudio realizado por St-Pierre y col
1999
Por otra parte se ha demostrado que el tratamiento con metil-jasmonato MJ, el cual es una
fito-hormona producida por la planta, aumenta la acumulación de alcaloides en plántulas de
C. roseus (Loyola-Vargas y col. 2007). El factor de transcripción con dominio AP2/ERF
ORCA3, controla la expresión responsiva a ácido jasmónico AJ de algunos genes
involucrados en el metabolismo primario y secundario de C. roseus (Van der Fits y col
2000). Por lo cual en este proyecto se desean analizar más genes de la misma familia de
factores de transcripción tipo AP2, y conocer más acerca del metabolismo secundario de
Catharanthus roseus.
OBJETIVO GENERAL
Determinar si los genes de Arabidopsis thaliana involucrados en la floración,
principalmente factores de transcripción tipo AP2, pueden afectar el metabolismo
secundario de Catharanthus roseus principalmente en las rutas involucradas en la síntesis
de alcaloides.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Realizar las construcciones de sobre-expresión inducible y constitutiva de los
diferentes genes de Arabidopsis thaliana. ᵝ
 Transformar Catharanthus r. mediante Agrobacterium r.
 Crecer el cultivo de raíces en un biorreactor
 Cuantificación de los alcaloides mediante HPLC
ᵝ Parte del trabajo que se tiene concluida.
EXPERIMENTAL
Se realizó la construcción del plásmidos de sobre-expresión constitutiva con el promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor
Sobre-expresión con 35S
A partir de 2 plásmidos diferentes, el pBI121 y el pGEM-T se realizaron digestiones con el
fin de extraer del plásmido pGEM-T el gen de nuestro interés y ligarlo dentro del vector
pBI121 donde se encuentra el promotor constitutivo 35S. Después de las digestiones se
paso a correr la muestra dentro de un gel de Agarosa al 1% y de ahí cortar las bandas
correspondientes al gen y al vector para después purificarlas y mediante una reacción de
ligación unir los 2 fragmentos. Una vez que se tuvo el plásmido listo se paso a transformar
células de E.coli DH5α en cajas de LB/kanamicina 50mg/L para reproducir nuestro
plásmido. Se corroboró mediante PCR de colonia con primers específicos para el gen AP2.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4kb
2.5kb
1kb
pBI121
Gen / Factor de transcripción tipo AP2
Fig. 3 Electroforesis en gel de agarosa 1% se muestran las bandas correspondientes
al gen AP2 y el pBI121
En el resultado de la digestión se puede ver claramente como la banda corresponde al
marcador de peso molecular lo cual nos indica que tuvimos una digestión exitosa.
Una de las partes más difíciles se encontró al momento de hacer la purificación de las
bandas, ya que teníamos una cantidad muy pequeña de DNA el cual no era suficiente para
hacer la ligación. Se encontró que el problema era que las soluciones que se utilizaban eran
demasiado viejas, por lo cual se opto por preparar nuevas soluciones, lo cual mejoro
bastante el resultado ya que tuvimos ligaciones positivas, como se puede observar en la
figura no. 4.
2.5kb
1kb
Gen/Factor de transcripción AP2
Fig. 4 Electroforesis en gel de agarosa 1% se muestran las bandas correspondientes
al PCR de colonia de 10 muestras
CONCLUSIONES
El proyecto sigue en marcha, solo se cuenta con una de las 2 construcciones de sobreexpresión necesarias. Catharanthus roseus representa un reto muy grande para la ingenieria
metabólica, ya que muchos de sus compuestos no se pueden obtener mediante síntesis
química, ya que sería demasiado costoso y no tendrian la misma actividad biológica. La
transformación de plantas y el cultivo de tejidos son una alternativa muy atractiva, pero
hasta que no se conozca las enzimas involucradas y los lugares específicos de su síntesis y
sobre todo sus reguladores genético sigue habiendo lugar para más investigación.
REFERENCIAS
Hughes, E., Shanks, J.V. “Metabolic engineering of plants for alkaloid production”
Metabolic Engineering 4, 41-48, 2002.
Loyola-Vargas, V., Galaz-Ávalos, R., Kú-Cauich, R. “Catharanthus biosynthetic enzymes:
the road ahead” Phytochem Rev 6, 307-339, 2007
St-Pierre, B., Vazquez-Flota, F., De Luca, V. “Multicellular compartmentation of
Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis predicts intercellular translocation of pathway
intermediate” The plant cell Vol 11, 887-900, 1999
Van der Fits, L., Memelink, J. “ORCA3, a jasmonate-responsive transcriptional regulator
of plant primary and secondary metabolism”. Science 289, 295–297, 2000.
Warber, S. “Models of action at target site”, Natural products from plants USA:CRC Press,
158-181, 1999.