serodia® - htlv-i

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SERODIA® - HTLV-I
Ensayo por aglutinación pasiva de partículas para la detección de anti-HTLV-I. Para diagnóstico in vitro
PRINCIPIO Y VENTAJAS
El reactivo se preparar a partir de un soporte de partículas de gelatina sensibilizadas con HTLV-I (Virus Linfotrópico Humano Tipo I) sobre la base de que estas partículas sensibilizadas se aglutinan
por los anticuerpos anti-HTLV-I en suero o plasma humano. El HTLV-I se prepara por disrupción de HTLV-I purificadocon detergente.

Este se prepara concentrando el fluido que se cultiva de una línea celular productora del virus, que se somete a una centrifugación en gradiente de sacarosa, colectando la fracción viral
que corresponde a una densidad de 1,16 g/cm3 aproximadamente.
Serodia HTLV-I tiene las siguientes ventajas
1. El procedimiento del ensayo es extremadamente simple como toda técnica de microtitulación y es particularmente apto para screening en masa de muestras.
2. El ensayo permite ahorrar tiempo y los resultados se leen a simple vista en dos horas aproximadamente.
3. Serodia HTLV-I involucra el uso de una recientemente desarrollada partícula de soporte artificial Fuji que no presenta la aglutinación no específica observada usualmente con soportes de
eritrocitos.
COMPONENTES DEL EQUIPO
Serodia HTLV-I consta de los siguientes reactivos y accesorios.
REACTIVOS
Máximo de ensayos
Diluyente de suero
(Líquido)
Solución reconstituyente
(Líquido)
Screening:100
(5 x 20)
Screening: 220 (4 x 55)
Screening: 550
(5x110)
**Después de la reconstitución
Partículas sensibilizadas
Partículas no
sensibilizadas (Liofilizado)
Control positivo
(Líquido)
Un vial de
10 ml
Un vial
de 16 ml
Cinco viales de 0,6 ml**
Cinco viales de 1,0 ml**
Un vial de 0,5 ml
Un vial de 20 ml
Un vial
de 35 ml
Cuatro viales de 1,5 ml**
Cuatro viales de 2,0 ml**
Un vial de 0,5 ml
Dos viales de 20 ml
Dos viales
de 35 ml
Cinco viales de 3,0 ml**
Cinco viales de 3,5 ml**
Un vial de 0.5 ml
A: Solución reconstituyente (Líquido). Usada para la reconstitución de partículas sensibilizadas y partículas no sensibilizadas.
B: Diluyente de suero (Líquido). Usado para dilución de muestras de suero.
C: Partículas sensibilizadas (Liofilizado). Preparación liofilizada de partículas de gelatina sensibilizadas con antígeno HTLV-I inactivado. Se reconstituye agregando la cantidad prescripta de solución
reconstituyente en el momento del uso.
D: Partículas no sensibilizadas. Preparación liofilizada de partículas de gelatina coloreada. Se reconstituye agregando la cantidad prescripta de solución reconstituyente en el momento del uso. Use
este reactivo como control para chequear la aglutinación no específica de las muestras de suero
E: Control positivo (Líquido)
El suero control positivo (conejo) se prepara para mostrar un título de 1:64 (dilución final) cuando se realiza la prueba utilizando el mismo procedimiento que se usa con las muestras.
Materiales Provistos
1. Goteros de aproximadamente 25 ul. 2 unidades
Utilizados exclusivamente para dispensar las Partículas Sensibilizadas y No sensibilizadas.
Nota: Reconstituya las Partículas Sensibilizadas y No sensibilizadas 30 minutos antes de su uso
PREPARACIÓN
Prepare el siguiente material de laboratorio antes de realizar la prueba
1) Microplacas en forma de “U”
2) Dilutores ................................................... 25 ul
3) Goteros calibrados ................................... 25 ul
4) Pipetas
Micropipetas (con tips)..... ......25 ul y 50 ul para dispensar muestras
Pipetas Volumétricas............ .1,0 ml, 5.0 ml y 10 ml para reconstitución.
5) Goteros ..................................................... 25 ul aprox ( para agregar Partículas Sensibilizadas y No sensibilizadas reconstituidas)
6) Mezclador de placas (Agitador vibratorio automático)
7) Visor de Placas
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Preparación de Muestras de Suero
Los eritrocitos y otros componentes visibles presentes en la muestra de suero o plasma deben removerse por centrifugación antes del ensayo para evitar interferencias con los resultados. No es
necesaria la inactivación de las muestras de suero.
Realización del ensayo
[Procedimiento del ensayo Qualitativo (Screening)] (ver tabla I)
1) Coloque 1 gota (25 ul) de diluyente de suero en los pocillos 1 a 3, usando un gotero calibrado.
2) Con una micropipeta, agregue 25 ul de la muestra en el pocillo 1 y mezcle llenando y descargando la micropipeta 3 ó 4 veces con el contenido del pocillo. Luego llene la micropipeta con 25
ul de la solución diluida en el pocillo 1 y transfiéralo al pocillo 2. Mezcle bien y transfiera al pocillo 3 siguiendo el mismo procedimiento del pocillo 1. Repita la operación en el pocillo 3 para
obtener la segunda dilución.
3) Coloque una gota (25 ul) de Partículas No Sensibilizadas en el Pocillo 2 y una gota (25 ul) de Partículas Sensibilizadas en el pocillo 3 usando los goteros suministrados en el equipo.
4) Mezcle el contenido de los pocillos a fondo usando un mezclador de placas ( agitador vibratorio automático). Si no tiene un agitador vibratorio disponible, el procedimiento puede realizarse
manualmente golpeteando los cuatro bordes de la microplaca varias veces para mezclar bien. Luego tape la placa y déjela reposar a temperatura ambiente (15 –25° C) durante 2 horas.
Luego lea los patrones.
Tabla 1. Procedimiento del ensayo cualitativo
1
2
Pocillo No.
Diluyente de suero (ul)
Muestra (ul)
25
25
25
25
)
3
25
25
)
Dilución del suero
1:2
1:4
Partículas no sensibilizadas (ul)
25
Partículas sensibilizadas (ul)
Partículas sensibilizadas (ul)
Dilución Final
1:8
Mezcle usando un mezclador de placas ( agitador vibratorio automático, cubra la placa e incube por 2 horas.
Interpretación
)
descarte
1:8
25
1:16
[Realización del Ensayo Usando el Control Positivo] (Ver Tabla 2)
Pocillo No.
Diluyente de suero (ul)
Control positivo (ul)
1
25
25
2
)
25
25
Tabla 2. Procedimiento del ensayo del control positivo
3
4
)
25
25
)
25
25
)
Dilución del suero
1:2
1:4
1:8
1:16
Partículas no sensibilizadas (ul)
25
Partículas sensibilizadas
25
25
Dilución Final
1:8
1:16
1:32
Mezcle usando un mezclador de placas ( agitador vibratorio automático, cubra la placa e incube por 2 horas.
5
25
25
)
descarte
1:32
25
1:64
1
Interpretación
Controles
1) Confirme que la reacción de cada una de las muestras y las Partículas no Sensibilizadas sea negativa (-) (dilución final 1:8)
2) La mezcla de Diluyente de Suero y Partículas Sensibilizadas o No sensibilizadas no debe dar reacción (-) en cada corrida (control de reactivos)
3) Confirme que el título del Control Positivo del suero es 1:64 en la dilución final cuando realice el procedimiento del ensayo (ver Tabla 2) para consistencia de lote a lote.
Interpretación
Coloque la microplaca suavemente sobre el visor de placas (con luz indirecta), compare los patrones de aglutinación negativa con aquellos del control de reactivos e interprete de acuerdo con los
criterios presentados en la Tabla 3.
Tabla 3.
Patrón establecido de las partículas
Lectura
Interpretación
Partículas concentradas en forma de botón, en el centro del pocillo, con un borde
(-)
Negativo
externo circular y liso
Partículas concentradas en forma de un anillo compacto con un borde externo
(±)*
No concluyente
circular y liso
Anillo grande definido, con un borde externo rugoso multiforme y aglutinación
(+)
periférica
Positivo
Partículas firmemente aglutinadas que se despliegan cubriendo el fondo del pocillo
(++)
uniformemente
* Las muestras que presentan un resultado no concluyente (±) deben ser ensayadas nuevamente, siguiendo la Tabla 1 y los resultados del ensayo deben interpretarse de acuerdo con los criterios
de la Tabla 3. Una muestra (±) que se repite debe confirmarse por otros métodos para una interpretación exacta.
Criterios para interpretación
En el ensayo, una muestra que tiene reacción negativa con las partículas no sensibilizadas (dilución de suero final 1:8), pero presenta aglutinación con las partículas sensibilizadas (dilución final del
suero 1:16 o más) se considera una reacción positiva.
Procedimiento de absorción
Si una muestra presenta aglutinación tanto con partículas sensibilizadas como con las no sensibilizadas, se debe reanalizar después del siguiente procedimiento de absorción:
1.
Coloque 1 gota (25 ul) de diluyente de suero en el pocillo 3 de una microplaca
2.
Coloque 0,3 ml de Partículas No sensibilizadas en un tubo de ensayo pequeño.
3.
Agregue 0,1 ml de muestra de suero, mezcle a fondo usando un mezclador de tubos e incube a temperatura ambiente (15 –25°C) durante 20 minutos. (Mezcle bien agitando manualmente 1 ó
2 veces).
4.
Centrifugue durante 5 minutos a 2.000 rpm. Separe cuidadosamente el sobrenadante (dilución del suero absorbido: 1:4) y coloque 50 ul en el pocillo 2 de la microplaca.
5.
Mezcle llenando y descargando una micropipeta 3 ó 4 veces con el líquido del pocillo 2. Llene luego la micropipeta con 25 ul de la solución diluida en el pocillo 2 y transfiérala al pocillo 3.
Repita este procedimiento en el pocillo 3 para obtener la segunda dilución.
6.
Luego, siga el mismo procedimiento que el de la Prueba Cualitativa y lea los resultados.
PRECAUCIONES
Precauciones en el Procedimiento
1)
Mezcle el contenido de los pocillos de la microplaca a fondo para asegurar buenos resultados del ensayo.
2)
Durante la incubación, cubra la microplaca y evite vibraciones.
3)
Todos los instrumentos y herramientas, (por ejemplo, pipetas y tubos), soluciones de desecho, tips, papeles, etc, deben ser manipulados cuidadosamente, debido a que pueden estar
contaminados con HBV u otros virus. Se requiere decontaminación con solución de glutaraldehído (por al menos 1 hora, con sol ución al 2%), solución de hipoclorito de sodio (concentración
de cloro efectiva 1,000 PPM, al menos una hora), autoclavado ( a 121°C por, al menos, 1 hora) o incineración, ya que las muestras de suero pueden estar contaminadas con antígeno HBs.
4)
En principio, los reactivos liofilizados contenidos en el equipo deben ser usados pocos días después de reconstituidos. De todos modos permanecerán estables por 7 días después de la
reconstitución, almacenados entre 2 –10°C.
Precauciones en la Manipulación
1) Casos anti-HTLV-I positivos pueden no ser siempre diagnosticados como portadores del virus o ATL con este equipo. Para diagnóstico final y concluyente, se requiere un juicio integral junto
con otros métodos (ensayos serológicos y morfología de los linfocitos) y síntomas clínicos.
2) Aunque los antígenos virales que recubren las partículas son sustancias no infecciosas, deben ser tratados cuidadosamente como virus de HBV.
3) El control positivo contenido en este equipo es suero de conejo inmunizado con HTLV-I.
4) Se usa azida sódica como conservante para los reactivos Serodia HTLV-I. Drene los fluidos de desecho con una gran cantidad de agua, por seguridad.
5) Por favor, observe que los ensayos de aglutinación, en general, pueden en raras ocasiones exhibir un fenómeno de prozona. También se ha reportado, en raros casos, que la infección viral
puede no generar producción de anticuerpos en algún estadio de la infección.
[Conservación]
Almacene entre 2 y 10ºC. No congele
[Vida Útil]
Remítase al envase externo para ver la fecha de vencimiento. (La vida útil de los equipos Serodia HTLV-I es de 12 meses después de la fecha de fabricación). Por favor, remítase a la descripción
que aparece en el envase y las etiquetas de cada vial.
[ Contenido]
Producto No 4595: Reactivos para 100 determinaciones cualitativas.
Producto No 4601: Reactivos para 220 determinaciones cualitativas.
Producto No 4618: Reactivos para 550 determinaciones cualitativas.
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