Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) son partículas esféricas

ACTIVIDAD PRÁCTICA UTI-DREMR
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FACULTAD DE MEDICINA
ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES
OXIDATIVAS DE LA LIPOPROTEINA DE BAJA
DENSIDAD (LDL): ANALISIS DE LA OXIDACION
DEL COMPONENTE LIPIDICO Y PROTEICO.
Elaborado por:
Dr. Andrés Trostchansky
Dra. Madia Trujillo
Dra. Laura Castro
Dr. Homero Rubbo
Agosto de 2010
Introducción.
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) son partículas esféricas con un
diámetro de 19-23 nm, constituyendo la población de lipoproteínas que poseen
una densidad entre 1,019 y 1,063 g/ml. La hipótesis oxidativa de la
aterosclerosis postula que las placas de ateroma se forman a partir de células
(principalmente macrófagos y musculares lisas) cargadas con lípidos (ésteres
de colesterol), como consecuencia de modificaciones oxidativas de la LDL (LDL
oxidada u ox-LDL). Las LDL son internalizadas en las células a través del
receptor normal de LDL (receptor apoE/apoB) por endocitosis mediada por
receptor. Este es un proceso regulado a la baja que impide la entrada excesiva
de lipoproteínas a las células; además su regulación está coordinada con la del
metabolismo del coleterol impidiendo la acumulación nociva de este lípido. A
diferencia de la LDL nativa, la ox-LDL es reconocida por receptores
barrenderos o “scavenger” a nivel de las células endoteliales y musculares
lisas, monocitos y macrófagos por un proceso no regulado. Mientras la LDL es
oxidada, la lipoproteína pierde su habilidad de ser reconocida por el receptor de
la LDL incrementándose a su vez la afinidad por el receptor scavenger. Durante
la oxidación de la LDL a una forma reconocida por los receptores scavenger,
existe una disminución de la cantidad de grupos - amino libres de los residuos
de lisina de las LDL lo cual explica el cambio en la especificidad del receptor.
La acumulación intracelular de lípidos, combinada con la disminución de la
degradación de los lípidos oxidados, resulta en la conversión de los
macrófagos en células espumosas formándose la estría grasa que constituye
una acumulación focal de lípidos en la íntima arterial y que representa la lesión
más precoz del proceso.
Estructura de la LDL.
La LDL humana se define como la población de lipoproteínas que pueden ser
aisladas por ultracentrifugación en gradiente de densidad, con un rango de
densidad entre 1,019 a 1,063 g/ml.
Características de las principales lipoproteínas del plasma humano.
Densidad
(g/ml)
Movilidad
Electroforética
Diámetro
(nm)
Peso molecular
(daltons)
Relación
Lípido/ Proteína
Lípidos más
Abundantes
Principales
Apoproteínas
Quilomicrones
 0,95
VLDL
0,95 -1,006
Origen
Pre- beta
 70
25 - 70
0,4- 30
 10 9
99 : 1
TG
Exógenos
A-I, B-48,
C-I,C-II, CIII
IDL
1,006 - 1,019
LDL
1,019 - 1,063
HDL
1,063 - 1,210
Beta
Alfa
22 - 24
19 – 23
4 - 10
5 - 10
 10 6
4-5
 10 6
1,8 - 2,8
 10 6
1,8 - 3,6
 10 5
90 : 10
85 : 15
80 : 20
50 : 50
Entre beta y pre
- beta
TG endóge-nos TG endógenos
y Ce
B-100, C-I,
B- 100, E
C-II,C-III,E
CE y FC
Phl y CE
B-100
A-I, A-II
TG: triacilglicéridos; CE: ésteres de colesterol; FC: colesterol libre; Phl: fosfolípidos
Como muestra la tabla, las moléculas de LDL son grandes partículas esféricas
con un diámetro de 19 - 23 nm y un peso molecular entre 1,8 y 2,8 millones.
Tomando 2,5 millones como un valor promedio del peso molecular de la
lipoproteína cada partícula contiene alrededor de 1600 moléculas de ésteres de
colesterol y 170 moléculas de triglicéridos que juntos forman un core central
lipofílico. Este core central se encuentra rodeado por una monocapa formada
principalmente por unas 700 moléculas de fosfolípidos (particularmente
fosfatidilcolina) y 600 moléculas de colesterol libre. Las cabezas polares de los
fosfolípidos se encuentran en la superficie de la partícula de LDL contribuyendo
a su solubilidad en la fase acuosa. El número total de moléculas de ácidos
grasos unidos a las diferentes clases de lípidos de la LDL es en promedio de
2700. De estos, alrededor del 50 % son ácidos grasos poliinsaturados,
principalmente ácido linoleico (18:2).
El contenido de ácidos grasos y su patrón de distribución varía
considerablemente de persona en persona probablemente por los distintos
hábitos dietéticos. La variación en el contenido de ácidos grasos
poliinsaturados y la relación saturados/poliinsaturados tiene un efecto
significativo sobre el comportamiento oxidativo de las distintas partículas de
LDL ya que estos ácidos grasos son más susceptibles de oxidación por
mecanismos no enzimáticos.
En la capa externa de la molécula se encuentra la única proteína que forma
parte de la LDL y que recibe el nombre de apolipoproteína B-100 (apo B-100).
La apo B-100 es una proteína constituida por 4536 aminoácidos y un peso de
512 kDa. De su secuencia aminoacídica se destacan la presencia de
triptofanos, tirosinas y metioninas (37,152 y 78 mol/mol respectivamente) así
como cuatro residuos de cisteína libres.
Es importante resaltar la presencia de diversos antioxidantes como
componentes estructurales de la LDL. Entre ellos se destaca el -tocoferol con
una concentración en nmol/mg de LDL que equivale a aproximadamente seis
moléculas de -tocoferol por partícula de LDL. Los demás antioxidantes, como
ser el -tocoferol, -caroteno,- caroteno y ubiquinol-10 se encuentran en
cantidades menores.
Procesos de oxidación lipídica.
La lipoperoxidación es el proceso en el cual el oxígeno molecular es
incorporado a moléculas de lípidos insaturados (LH) para formar
hidroperóxidos lipídicos (LOOH). El proceso de ataque y daño oxidativo que
sufren los lípidos insaturados se debe a reacciones en cadena mediadas por
radicales libres, iniciadas por la abstracción de un átomo de hidrógeno del
metileno bis- alílico del lípido insaturado por un radical libre reactivo y seguido
por una secuencia de reacciones propagadoras.
La lipoperoxidación procede a través de tres fases: iniciación,
propagación y terminación. La fase de iniciación, el primer paso crítico, está
promovida por algún tipo de iniciador que sobrepasa la energía de
disociación del enlace alílico causando la abstracción del hidrógeno y entonces
la formación del radical alquilo (L.). La oxidabilidad de un lípido está dada por la
facilidad con la que el átomo de hidrógeno inicial puede ser abstraído. J.P.
Cosgrove et al propusieron una relación entre la capacidad de los ácidos
grasos insaturados (PUFAs) de oxidarse con respecto a la cantidad de dobles
enlaces alílicos presentes en la molécula.
Una vez que se formó el radical alquilo grupos adyacentes le proveen
estabilización por resonancia. Si está presente el oxígeno molecular
reaccionará rápidamente con el radical alquilo para formar en el caso del O2
radical peroxilo (LOO.). El radical peroxilo es un importante intermediario en la
cadena de propagación porque una vez formado, continuará la cadena de
reacciones oxidativas abstrayendo un átomo de hidrógeno de otros grupos
alquilo cercanos. Este ciclo de reacciones propagadoras se repite a través de la
abstracción de hidrógenos y formación de LOO ., siempre que se encuentran
disponibles suficientes moléculas de O2 y sustratos lipídicos insaturados. La
duración del ciclo de reacciones de radicales peroxilo es gobernado por varias
reacciones competidoras de terminación. En teoría, estas incluyen la reacción
bimolecular de dos radicales alquilo o de dos radicales peroxilo para formar
productos no radicalares. También existen reacciones de tipo radical-radical
entre los radicales lipídicos generados durante la propagación y otras especies
radicalares
LH
RH
R∙
INICIACION
∙
HOO
∙
O2
L∙
LOOH
∙OO
PROPAGACION
LOO∙
L∙ + L∙
LOO∙ + LOO∙
L∙ + LOO∙
XH + L∙
XH + LOO∙
LH
LL
LOOL + O 2
LOOL
X∙ + LH
X∙ + LOOH
TERMINACION
Esquema para las transformaciones químicas en las tres fases de lipoperoxidación
generalizado para un lípido diinsaturado.
LH: lípido; L.: radical (centrado en el carbono) lipídico; LOOH: hidroperóxido lipídico;
LOO.: radical lipoperoxilo; XH: compuesto antioxidante.
Protocolo experimental.
Objetivos.
Estudiar la oxidación de la LDL por Cu(II) utilizando diferentes metodologías
experimentales, analizando las modificaciones sufridas por los tres principales
componentes de la lipoproteína: lípidos, apolipoproteína B-100 y antioxidantes.
Purificación de LDL.
A partir de plasma humano fresco se purifica la fracción de LDL por
ultracentrifugación.
1) 24 ml de plasma se mezclan con KBr para llevar la solución a una densidad
final de 1.3 g/ml. Para ello se agregan 0.28 g de KBr por ml de plasma. Se
obtiene una solución de una fase agitando suavemente al plasma.
2) En cada tubo de ultracentrifugación se agregan 1.4 ml de la solución de
plasma y 2.2 ml de NaCl 0.15 M (isotónico).
Nota: el NaCl se agrega sobre las paredes del tubo para evitar que se mezclen ambas
soluciones y alcanzar eficientemente el gradiente de densidad.
3) Se centrifuga a 80000 rpm por 90 minutos a 4ºC.
4) Se separa la banda de color naranja que se observa en el tercio superior del
tubo evitando arrastrar fracciones superiores.
5) Se mide la concentración proteica a 280 nm (= 1 mg/ml), y la LDL se
guarda a 4ºC.
Oxidación de la LDL.
La oxidación de la LDL se llevará a cabo a 25ºC en presencia de Cu(II) de
acuerdo a Batthyany C. et al (Arch. Biochem. Biophys., 2000). Los procesos de
oxidación lipídica en la LDL serán analizados por consumo de oxígeno y
espectrofotometría (consumo de antioxidantes) mientras que las modificaciones
en la apoliporoteína B-100 serán analizadas por electroforesis.
Oxidación lipídica-Consumo de oxígeno.
El consumo de oxígeno se realiza en una cámara de 4 ml de volumen final a
agitación constante.
CALIBRACION: el aparato se calibra al 100% de oxígeno mediante el burbujeo
con pipeta pasteur durante algunos minutos para saturar con aire la cámara
que contiene agua solamente. Posteriormente esperar a que se estabilice la
medida y llevar a 100% con la perilla de CAL. El 100% depende de la
temperatura:
Temperatura (ºC)
O2 nmoles/ml
5
397
10
351
15
314
20
284
25
258
28
30
35
37
244
237
222
217
Una vez calibrado se puede empezar a trabajar.
OBSERVACIONES: no olvidar lavar después de cada medida y cambiar la membrana
cuando se va a trabajar con material diferente al utilizado en la última corrida.
No olvidar dejar con agua la cámara una vez que se termina de trabajar.
Para la oxidación de la LDL:
1) Se incuba, en un volumen final de 4 ml, la LDL (0.1 mg/ml, concentración
final) en buffer fosfato 50 mM, pH 7.4 con CuSO 4 en una relación LDL/Cu(II) de
1:75.
2) Se registra el consumo de oxígeno por 100 minutos, detectando las fases de
latencia, propagación y terminación.
Consumo de antioxidantes endógenos de la LDL: oxidación de carotenoides.
1) Determinación de la longitud de onda de trabajo. Realizar el espectro de
absorción de la LDL. Para ello incubar LDL (2 mg/ml, concentración final) en
una cubeta de espectrofotómetro y realizar medidas de absorbancia cada 5
nm entre 380 nm y 550 nm. La longitud de onda de trabajo se corresponde
con aquella donde la solución presenta mayor absorbancia.
2) Se incuba la LDL (2 mg/ml, concentración final) en una cubeta de
espectrofotómetro (volumen 1 ml), con CuSO4 en una relación LDL/Cu(II) de
1:75.
3) Se realizan medidas de absorbancia cada 3 minutos, durante 60 minutos, a
la longitud de onda seleccionada en 1.
Oxidación de la LDL- Electroforesis en agarosa.
Materiales y métodos.
a) Gel de agarosa al 0,5% en buffer de corrida (Tris-Glicina 1x pH=8,3),
aproximadamente 60 ml  0,4 gr de agarosa
b) Buffer de muestra 5x : 0,58 ml de glicerol + 0,42 ml de H2O + 1 ml de buffer
corrida 10x
c) Buffer corrida: Tris-Glicina 1x pH=8,3, aproximadamente 500 ml. Se prepara
por dilución de un stock 10x: 114,2 gr glicina + 30,3 gr Tris, disolver en 800
ml de H2O, ajustar pH a 8,3 y llevar a 1 litro.
d) Solución de fijación: 250 ml de etanol:acético:agua (60:10:30)  150 ml de
EtOH + 25 ml acético + 75 ml de H2O
e) Solución de tinción: Coomasie Brillant Blue R-250 0,15% en Destain.
Preparar aprox. 120 ml  0,18 gr coomasie
f) Solución de Destain: MeOH:acético:H2O (35:25:40). Se prepara 1 litro
Procedimiento
La LDL se oxida con cobre como previamente. Se sacan muestras a los 0, 15,
50 y 90 minutos para analizar los cambios en la movilidad electroforética de la
LDL. Además se lo compara con una muestra de plasma.
a. Se siembran por pocillo hasta 20 µl de solución de muestra (4 µl de buffer
de la muestra 5x + 16 µl de muestra) con una cantidad final de proteína
entre 10 a 20 µg.
b. Corrida: 40 minutos a 65 voltios constante (aprox.30 mA) + 15 minutos a 90
voltios
c. Fijación: 10-20 minutos en solución de fijación (antes de fijar poner en el
congelador la solución de fijación y el coomasie)
d. Deshidratar el gel por peso entre papel de filtro seco.
e. Coloración: 10 minutos en solución de tinción
f. Decoloración: 1 hora (o hasta que exista buen contraste bandas/fondo) en
destain con cambios sucesivos de la solución
g. Secado: 1) Con papel de filtro sin peso
2) Con papel de filtro con peso
3) Secador de geles entre papel celofán
Análisis de los datos.
1) En los casos de la oxidación lipídica y de antioxidantes graficar las medidas
realizadas en función del tiempo identificando, donde amerite, las fases de
latencia, propagación y terminación.
2) Indicar para cada fase los principales intermediarios involucrados y que
función cumplen: reductor u oxidante.
3) Para el caso de la electroforesis, y de acuerdo a la literatura, identificar las
especies presentes en cada carril.
4) Hipotetizar la razón por la cual se observan cambios en la movilidad
electroforética de la LDL incubada con Cu(II) y como se relaciona con la
formación de las células espumosas. ¿Cuáles serían los oxidantes
responsables de la oxidación de LDL in vivo?
Referencias.
Herrera E. Metabolismo de las Lipoproteínas. In: Graw-Hill IM, ed. Elementos
de Bioquímica, 1993.
Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and
antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol Med 1992;
13:341-90.
Westhuyzen J. The oxidation hypothesis of atherosclerosis: an update. Ann Clin
Lab Sci 1997; 27:1-10.
Cosgrove JP, Church DF, Pryor WA. The kinetics of the autoxidation of
polyunsaturated fatty acids. Lipids 1987; 22:299-304.
Trostchansky, A., Batthyany, C., Botti, H., Radi, R., Denicola, A., and Rubbo, H.
Formation of lipid-protein adducts in low-density lipoprotein by fluxes of
peroxynitrite and its inhibition by nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys. 395:
225-232.; 2001
Trostchansky, A., Ferrer-Sueta, G., Batthyany, C., Botti, H., Batinic-Haberle, I.,
Radi, R., and Rubbo, H. Peroxynitrite-mediated LDL oxidation is inhibited by
manganese porphyris in the presence of uric acid. Free. Rad. Biol. Med. 35:
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