caracterización inmu..

CARACTERIZACIÓN
INMUNOLÓGICA
DE
LA
EXOCRINOPATÍA
MOSTRADA POR LOS RATONES ET/ET.
Rubén Marroquín segura1, Claudia Fabiola Martínez Rodríguez1, Martha Mercedes García
Burciaga2, Calvillo Esparza Ricardo y Maurilio Flores Pimentel1.
1.Laboratorio de Microbiología e Inmunología L313 Campo II FES Zaragoza UNAM.
2. Departamento de Farmacia. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN.
Resumen.
Se estudiaron, en 57 ratones de las cepas +/+, et/+ y et/et, machos y hembras de diferentes
edades, lo siguiente: lesiones visibles en ojos, un estudio histopatológico de sus glándulas
lagrimales y maxilares y presencia de anticuerpos anti Ro/SSA y anti La/SSB. Se encontró
que las lesiones visibles en ojos están limitadas a la cepa mutante et/et, también se encontró
que en ésta cepa los tamaños de las glándulas tuvo una correlación negativa con la edad
(r=-0-370, P=0.011). También la presencia de anticuerpos anti Ro/SSA con un 13.5% de
positividad y anticuerpos anti La /SSB con un 10.5% se asoció a la cepa et/et. De los
sueros positivos a los anticuerpos anti Ro/SSA solamente 1/5 fueron positivos a los
anticuerpos anti La/SSB. La alteración en las glándulas, pesos de glándulas pequeñas con
infiltrados severos de mononucleares, se asoció a la presencia de anticuerpos anti Ro/SSA y
éstos se aumentaron con la edad al realizar una correlación entre estas dos variables
(r=0.403, P=0.006). Conclusión. La cepa mutante et/et muestra signos que semejan al
síndrome de Sjögren. El estudio es relevante porque se puede usar como modelo
terapéutico del síndrome de Sjögren. El proyecto ha recibido apoyo del programa de
DGAPA. PAPIIT IN224201.
Introducción. El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune que se
caracteriza por la destrucción progresiva de glándulas lagrimales, salivales y trae como
resultado xerostomia y queratoconjuntivitis sicca, los paciente con el SS desarrollan
autoanticuerpos que incluyen anti-Ro/SSA y anti La/SSB1. El ratón desnudo et/et fue
observado en 1985 en una cepa cerrada no consanguínea de ratones albinos CD1 en el
Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza de la Universidad Nacional
Autónoma de México, y una de las características es la alopecia la cual es el resultado de un
gen recesivo autosómico simple, el término “et” se adoptó para referir a la forma mutante,
además los ratones presentan una fertilidad baja, mortalidad alta, lesiones en ojos y
muestran mayor cantidad de células CD3+ y CD8+, comparado con los ratones et/+ y +/+2,
y no muestran una susceptibilidad mayor a la infección de germenes intracelulares como el
Mycobacterium lepraemurium3 los ratones et/et desarrollan una exocrinopatía inflamatoria
que semeja al síndrome de Sjögren, además las glándulas lagrimales y submaxilares
muestran un menor tamaño que los ratones +/+. En el estudio histopatológico se observa
una infiltración mononuclear en las glándulas después de las 20 semanas de edad con un
rango amplio que va de moderada (infiltrado de mononucleares con observación de la
arquitectura normal de la glándula) a muy severa (infiltrado celular muy abundante, con
pérdida total del parénquima glandular)4. El presente estudio tuvo como propósito
determinar la presencia de anticuerpos anti-Ro/SSA y anti-La/SSB en los sueros de los
ratones et/et, et/+ y +/+ y relacionarlo con los índices glandulares, el sexo, la edad, las
lesiones visibles en ojos y con los infiltrados linfocitarios en las glándulas.
Material y métodos.
Se estudiaron 57 ratones machos y hembras de 10 a 50 semanas de edad de las cepas +/+,
et/+ y et/et mantenidos bajo condiciones convencionales de bioterio, con control de ciclo de
luz-oscuridad, cambio de cama de viruta de madera cuatro veces por semana y con libre
acceso al agua y alimento. Los ratones et/et se obtuvieron cruzando machos et/et con
hembras et/+; los críos et/et se separaron de sus hermanos con pelo, de los cuales se
diferenciaron al nacer por la ausencia de vibrisas (vibrissae). Los animales fueron
identificados según su genotipo y antecedentes de crianza en animales normales +/+,
ratones desnudos hipotímicos et/et y los heterocigotos o portadores et/+. Los ratones se
distribuyeron de la siguiente manera: 9 +/+, 10 et/+ y 38 et/et. Para cada ratón se registro
la cepa, el sexo, la edad, el peso corporal, peso de las glándulas y lesiones visibles en ojos
como son: inflamación, cataratas y ojos perdidos (ptisis bulbi). Se asignó a las lesiones en
ojos, un rango de 0 a 3 de acuerdo al grado de daño, de la siguiente manera: 0 ojo sano; 1
ojo inflamado; 2 presencia de catarata y 3 ojo perdido, asignando siempre el valor máximo.
Por ejemplo, si un ratón mostraba un ojo inflamado y otro con catarata se daba el número 2.
Los ratones se pesaron y se anestesiaron en cámara de éter, se sangraron en blanco por
incisión axilar el suero se separó y se congeló a –20° C hasta su uso. Se extrajeron las
glándulas lagrimales y submaxilares con equipo de microcirugía. Las glándulas se pesaron
inmediatamente en una balanza analítica. Debido a que se manejaron diferentes edades en
los animales fue conveniente calcular el índice glandular(IG) que es el peso relativo de las
glándulas y se calculó según la siguiente formula: IG=(suma del peso de las glándulas /peso
del animal) X10 0005. Las glándulas se colocaron en solución de formalina al 10% en PBS,
se incluyeron en parafina, se realizaron cortes de 5m de grosor usando un microtomo
rotatorio y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Para el ensayo de ELISA se usó un
equipo comercial para detectar anticuerpos anti SSA/Ro (ETI-SS-A/Ro cat. N0067
Diasorin, Italia) y anti SSB/La (ETI-SS-B/La cat. N0066 Diasorin, Italia). Las placas de
cada equipo estaban recubiertas con antígeno de timo de ternera SS-A(Ro) y antígeno de
timo de ternera SS-B (La) respectivamente, y del equipo comercial solo se usaron las
placas con los antígenos pegados. Los sueros de los ratones fueron diluidos 1:50 en PBS y
se usó un anticuerpo anti- IgG de ratón obtenido en chivo y conjugado a peroxidasa de
rábano picante Sigma Chem Co. Cat.A-3673, diluido 1:1000 y como cromógeno se uso ofenilendiamina. Las lecturas se ralizaron a 492 nm en un lector de placas de ELISA,
Awareness Technology Inc. Se calculó el valor corte, sacando la media de las
absorbancias de los ratones normales (+/+) mas 2 desviaciones estándar de la media.
Corte de positividad  N + 2 SD y todo lo que fue mayor se tomó como positivo, los
resultados cercanos al valor de corte se repitieron.
Las pruebas paramétricas estadísticas usadas se seleccionaron de acuerdo con la
distribución de datos y homogeneidad de varianzas (P>0.05, por la prueba de Bartlett) y
que los datos mostraran una distribución normal; mientras que las pruebas no paramétricas
se aplicaron cuando las varianzas no mostraron homogeneidad (P0.05, por la prueba de
Bartlett) y que los datos no siguieron una distribución normal6.
Para el análisis de los resultados de las cepas y las lesiones macroscópicas se evaluaron
mediante el análisis de varianza de Kruskal-Wallis. Las lesiones se correlacionaron con los
índices glandulares y el título de anticuerpos anti-Ro/SSA y anti-La/SSB. Los resultados
de los valores de los índices glandulares y los valores absolutos de las glándulas, así como
el análisis de resultados de la edad y los índices glandulares se evaluaron mediante el
análisis de varianza de un factor, seguido de la prueba de Tukey. Mientras que para la
diferencia de sexos dentro del grupo et/et se aplicó la prueba de t de Student. Todos los
análisis estadísticos se realizaron usando un paquete estadístico SPSS versión 10 para
Windows7.
Resultados.
Las lesiones visibles en ojos se asociaron a la cepa et/et, Cuadro 1, presentándose todo el
rango desde ojos sanos hasta ojos perdidos y solo se encontró una catarata en un ratón de la
cepa portadora et/+. Respecto a los índices glandulares que se muestran en el Cuadro 2, se
observa que son mayores en los ratones +/+ y hay diferencia significativa tanto en los
índices de la glándulas de los et/+ y como de los et/et, P<0.001. Para los índices lagrimales
no se presentó diferencia significativa entre los ratones +/+ y et/+; pero si la hubo entre los
ratones +/+ y los et/et y entre los et/+ y et/et.
Para la técnica de ELISA se calcularon los valores positivos de corte:
Corte= Media de los ratones (+/+) + 2 desviaciones estándar de la media.
Para el título de anticuerpos, anti Ro, los valores fueron:
0.236 + 2 (0.036) = 0.308. Valor de corte  0.308.
Para el título de anticuerpos, anti La, (ETI-SS-B-La) los valores fueron .
0.342 + 2 (0.030) = 0.402. Valor del corte  0.402.
Los porcentajes de positividad están representados en la Cuadro 3. donde se puede
observar que los ratones et/et tienen un 13.5% de positividad para los anticuerpos antiRo y
un 10.52% para los anticuerpos antiLa, no se encontraron sueros positivos entre las cepa
+/+ y et/+.
El Cuadro 4, nos muestra el comportamiento de las variables ordenadas en binomios, al
aplicarle un ensayo de correlación bivariada no paramétrica de Spearmean y se encontró
una correlación negativa para la edad y los índices lagrimales (r= -0.370. y P=0.011), con
respecto a la edad y los títulos de los anticuerpos anti-Ro/SSA la correlación fue positiva
(r=0.403, y P= 0.006) y para los índices lagrimales y la respuesta anti Ro/SSA se encontró
una correlación negativa (r=0.381, y P=0.009). Los sueros que resultaron positivos a
antiRo/SSA y anti La/SSB mostraron en el estudio histopatológico, un infiltrado de
mononucleares muy abundante y una destrucción total de las glándulas lagrimal y
submaxilar (Figura 1). Dentro del grupo de los ratones et/et , se realizó una prueba de t de
Student entre el sexo y los siguientes variables: lesiones, índices glandulares y título de
anticuerpos anti-Ro y anti-La. Cuadro 5, solo se encontró diferencia significativa entre
machos y hembras con respecto a las glándulas lagrimales la media de las hembras fue de
6.23 .487 y la media de los machos fue de 9.84.676.
Discusión.
El SS es un desorden autoinmune crónico de las glándulas exocrinas de etiología
desconocido, típicamente se asocia con infiltrado linfocitario de los tejidos glandulares y
respuesta de autoanticuerpos anti Ro/SSA y anti La/SSB8. En nuestro estudio encontramos
que los pesos relativos de las glándulas maxilares y lagrimales en la cepa et/et, están
disminuidos al compararlos con los pesos de los ratones +/+. El estudio histopatológico de
esas glándulas alteradas (con pesos pequeños), muestran en algunas de ellas, infiltrados
mononucleares con mantenimiento de la estructura acinar, y en otros el infiltrado es muy
abundante con destrucción total de la glándula. Se observó solo en la cepa et/et, un
porcentaje de positividad de anticuerpos antiRo/SSA y antiLa/SSB, 13.15% y 10.52%
respectivamente. Estos porcentajes son bajos en relación a los porcentajes de positividad en
suero reportados para humanos con diagnóstico establecidos de SS, en el cual los
porcentajes son de 57% para antiRo/SSA y 50% para anti La/SSB9; pero en nuestra
población de animales et/et estudiados, de 10 a 50 semanas de vida , no todos los animales
presentan la exocrinopatía, sobre todo los de menor edad debido a que los índices
lagrimales disminuyen con la edad en los animales et/et, mientras que la respuesta de
autoanticuerpos séricos antiRo/SSA se ve aumentada con la edad. Al correlacionar el
título de los anticuerpos antiRo/SSA y los índices glandulares de las glándulas lagrimales
se obtuvo (r = -0.381, P= 0.009) el valor negativo de la correlación nos indica que a mayor
título de anticuerpos el peso relativo de la glándula es menor y pudieran los titulos
elevados de los anticuerpos ser un indicador de daño en la glándula. No se presentó una
correlación significativa entre los anticuerpos séricos antiLa/SSB con la edad ni tampoco
con el índice glandular, probablemente porque existen reportes de que los anticuerpos anti
La/SSB en pacientes con SS fueron positivos en lagrimas y de estos solo el 60% lo fueron
también en suero; mientras que para los anticuerpos antiRo/SSA la presencia en lagrimas
y suero tiene una correlación positiva y estadísticamente significativa8 y en nuestro estudio
los anticuerpos anti La/SSB solo se determinaron en suero. Slobbe et al 10, encontró que
los anticuerpos séricos anti la proteína Ro 52KD, sin presencia de anticuerpos anti la
proteína Ro 60KD, dio positiva en 9/26 pacientes con SS, mientras los anticuerpos séricos
anti la proteína Ro 60KD sin contener anticuerpos anti Ro 52KD, dio positivo en 8/38
pacientes con LES. En pacientes con SS positivos a anticuerpos anti Ro/SSA se encontró
que 20/26 presentaron también anticuerpos anti La/SSB. En nuestro ratones que dieron
positivo para los anticuerpos anti Ro solo 1/5 dio también positivo para los anticuerpos anti
La/SSB. Sería interesante determinar los anticuerpos anti proteína Ro 52KD y anti 60KD
para saber en nuestro modelo contra cual de las proteínas es la respuesta. Consideramos que
nuestro modelo animal semeja al síndrome de Sjögren.
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Detection and ocurrence of the 60KD and 52KD Ro (SSA) antigens and of antibodies
against these proteins. Clinical and Experimental Immunology.1991;86:99-105.
Propuestas para fortalecer la investigación en la FES Zaragoza.
Considero que los programas como PAPIIT debieran de apoyar a profesores que no somos
investigadores como es mi caso, que estamos dedicados principalmente a la docencia con
12 horas por semana frente a grupo todo el año, que participamos en la formación de
recursos humanos, como son cursos a profesores, atención de tesistas y alumnos de servicio
social, dar apoyo institucional como es el de pertenecer a una comisión dictaminadora de la
carrera que me quita mucho tiempo y me acarrea problemas con los maestros que no
obtienen la evaluación esperada y que además tenemos la obligación de realizar
investigación y por no pertenecer a un equipo de investigación consolidado, no nos
aprueban proyectos, por no contar con corresponsables con publicaciones en el área, por no
tener alumnos de maestría y doctorado involucrados en el proyecto y que además estén
dentro de un posgrado de la UNAM. Éste requisito nos lleva a un circulo vicioso no
tenemos tesistas de posgrado, por no tener un proyecto aceptado y no nos aprueban un
proyecto por no contar con alumnos de posgrado, y que además en el dictamen por parte
del Comité Evaluador de los proyectos de PAPIIT, se indique que las publicaciones son
locales, se nota que no leen los proyectos o ¿que es una publicación local para ellos?.
La infraestructura obtenida por 2 proyectos de PAPIIT, nos ha permitido publicar además
en el área del proyecto aceptado, también en otras áreas como son: microbiología oral,
análisis de agua potable, evaluar el efecto de varias sustancias extraídas de plantas como es
su actividad microbiana, inflamatoria y efecto hipoglicemiante, mas de 10 tesis de
licenciatura y 2 tesis de maestría terminadas y presentadas, además nos ha permitido en el
laboratorio, implementar y mantener prácticas a nivel de licenciatura como ELISA,
western blot, evaluación de fagocitosis, tamices moleculares, citometría de flujo etc, que sin
estos recursos se tendrán que eliminar de los laboratorio de inmunología de las carreras de
QFB, Medicina y Odontología de ésta Facultad.
Lesiones
Cepa
+/+
et/+
Sanos
9
9
Inflamados
0
0
Cataratas
0
1
Perdidos
0
0
et/et
12
11
6
9
Cuadro 1. frecuencias de lesiones en las diferentes cepas.
Cepa
Índice submaxilar
Índice lagrimal
+/+
11.362.4*
14.101.42
et/+
4.770.74
17.151.89
et/et
6.160.4
7.40.48º
Cuadro 2 . medias  error estándar de los índices. Análisis de varianza de un factor. Para los índices
submaxilares: +/+ vs et/+ *P=0.001, +/+ vs et/et *P=0.001 y et/+ vs et/et P= 0.522. Para los índices
lagrimales: +/+ vs et/et P= 0.001, et/+ vs et/et P= 0.001 y +/+ vs et/+ P= 0.203.
Positividad
Cepa
+/+
et/+
et/et
Anti Ro
0% 0/9
0% 0/10
13.15% 5/38
Anti La
0% 0/9
0% 0/10
10.52% 4/38
Cuadro 3. Porcientos de positividad obtenidos mediante ELISA
__________________________________________________________________
Binomios
correlación
significancia
Edad-lesión
-0.072
P=0.334
Edad-índlag
-0.370
P=0.011*
Edad-indsubmax
0.027
P=0.436
Edad-Anti-Ro
0.403
P=0.006
Edad-Anti-La
0.067
P=0.344
Lesión-índlag
-0.109
P=0.258
Lesión-índsubmax
0.111
P=0.254
Lesión-AntiRo
-0.199
P=0.116
Lesión-AntiLa
0.142
P=0.198
Índlag-AntiRo
-0.381
P=0.009*
Índlag-AntiLa
-0.029
P=0.431
Índsubmax-AntiRo -0.064
P=0.352
Índsubmax-AntiLa -0.076
P=0.326
Cuadro 4. Correlación bivariada no paramétrica de Spearman, análisis dentro del grupo de ratones et/et. *
diferencia estadísticamte significativa.
Machos
medias ± Hembras
Medias ±
error estándar.
error estándar
Lesiones
1.153 ± 0.355
1.40 ± 0.223
Índice submaxilar
5.253 ± 0.418
6.636 ± 0.550
Índice lagrimal
9.846 ± 0.676
6.236 ± 0.487*
anticuerpos anti Ro
0.189 ± 0.012
0.241 ± 0.019
Anticuerpos anti La
0.236 ± 0.016
0.288 ± 0.022
Cuadro 5. Se realizó una prueba de t de Student, entre machos y hembras dentro del grupo et/et. *P= 0.001.
Figura 1. Glándula lagrimal de ratón et/et con anticuerpos séricos anti Ro/SSA y anti La/SSB.