Collao, Javiera - Congreso Ciencias del Mar

BIOPROSPECCIÓN,
OPTIMIZACIÓN
METABÓLICA
MICROALGAS EN ZONAS EXTREMÓFILAS
Y
CULTIVO
DE
M.C. Ruiz-Domínguez1, J. Collao1, J. Morales 1, M. Zapata 2,1 y M. Rivas2,1
1
Laboratorio de Biotecnología Algal, Facultad Ciencias del Mar y Recursos Biológicos, Dpto. CC Acuáticas y
Ambientales, Campus Coloso, Avenida Universidad de Chile 02800 Antofagasta (Chile)
2
Bioenergía y Sustentabilidad Ambiental, Centro Científico Tecnológico para la Minería CICITEM (Chile)
[email protected]
Las microalgas son una prometedora fuente de compuestos para la alimentación y para la industria energética. A
pesar de ser una fuente útil, este potencial todavía está limitado económicamente ya que sus costes de producción y
extracción siguen siendo elevados. De ahí surgió la idea del proyecto MIRACLES. Es un proyecto KBBE del VII
programa marco de la Unión Europea, de 4 años de duración. Se centra en I+D e innovación, impulsado por la
industria que tiene como objetivo desarrollar el concepto de biorrefinería de microalgas. En él participan y colaboran
26 Organismos Internacionales (Universidades y empresas), entre ellas la Universidad de Antofagasta y se divide en
diferentes finalidades de trabajo repartidos entre los distintos socios. El fin es unir conocimientos, técnicas y
experiencias internacionales para lograr una mejora en el desarrollo de la tecnología aplicada al cultivo de
microalgas para obtener subproductos de interés con aplicación en alimentación humana, acuicultura y productos de
alto valor agregado para la industria farmaceútica (Borowitzka 1997, Pulz and Gross 2004, Ibañez et al. 2012).
El grupo de la Universidad de Antofagasta, en la primera fase del proyecto, comenzó con los análisis de
crecimiento de tres especies de microalgas llamadas Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis gaditana y
Scenedesmus obliquus. Son especies objeto de estudio por alcanzar una alta concentración de biomasa y por contener
en su composición moléculas de interés farmacéutico, industrial y alimentaria (Bertrand 2010; Pulz and Gross 2004).
Es el caso de los lípidos, con especial énfasis la familia de ácidos grasos insaturados como DHA o EPA de relevante
importancia en la industria alimentaria. (Subramaniam et al. 2010). O entre otras moléculas de interés, la fucoxantina
que se caracteriza por tener un alto potencial antioxidante (Xia et al. 2013).
Estos compuestos, los ácidos grasos, son parte de los resultados presentados en este primer trabajo. Para ello se
realizó un análisis del crecimiento y de forma más específica, un estudio del contenido de lípidos totales y de la
variación del perfil de ácidos grasos de cada especie en condiciones de cultivo controladas de laboratorio y en
cultivos en modo batch.
Las condiciones controladas de laboratorio fueron; una temperatura óptima de crecimiento entre 23 - 26 ºC, una
irradiancia en los cultivos entre 60-100 µmol fotones · m-2·s-1 y se airearon con aire sin CO2 añadido. Los medios de
nutrientes fueron los propuestos por el proyecto basados en la bibliografía. En el caso de Scenedesmus obliquus fue
BBM en agua dulce el medio de nutrientes elegido (Bold 1949) y F/2 en agua de mar para Phaeodactylum
tricornutum y Nannochloropsis gaditana, típicamente usado para el cultivo de diatomeas (Guillard and
Ryther,1962).
Por tanto, se procedió al seguimiento de parámetros que sirven para controlar la evolución de su crecimiento
celular. Estos fueron; la Densidad Óptica o absorbancia a una longitud de onda de 680nm, el conteo celular (nº
células · mL-1 de cultivo) obtenido gracias a la cámara de Neubauer y la concentración de biomasa seca (Zhu CJ. and
Lee YK, 1997 modificado) en g·L-1 de biomasa seca. También se determinó la eficiencia fotosintética o quantum
yield (Qy, Parkhill, Maillet, and Cullen 2001) que es una medida aproximada de cuantificar la producción de
fluorescencia por parte de las clorofilas. Esto demuestra ser una herramienta útil para la evaluación del potencial
fotoquímico del PSII y también del posible estrés celular (Mohammed et al. 1995) ya que el cloroplasto disipa
energía lumínica sobrante. Las medidas de fluorescencia se determinaron usando un equipo PAM (Pulse Amplitude
Modulation, modelo AquaPEN AP100).
Para el análisis de ácidos grasos, se determinó primeramente el contenido de lípidos totales por el método Bligh
& Dyer (1959) a través de un equipo de extracción de grasas o Soxhlet. Una vez cuantificado los lípidos
gravimétricamente se realizó la transesterificación de ácidos grasos a FAMES o ácidos grasos metil ésteres para
poder identificarlos y cuantificarlos por cromatografía gaseosa (modelo Shimadzu GC 2010 Plus con detector FID).
Se realizó además un seguimiento por microscopía óptica y de fluorescencia para conocer de forma más detallada
la fisiología de las células, tal y como se observan el Figura 1, mediante microscopia de epifluorescencia. Las
muestras fueron teñidas con citifluor AF87 para poder observarlas al microscopio y en el campo de epifluorescencia
es la clorofila emite fluorescencia la que se puede observar en las imágenes.
A
B
C
Figura 1. Vista de N. gaditana (A), S. obliquus (B) y P. tricornutum (C) al microscòpio de epifluorescencia en
campo claro y fluorescencia de clorofilas (1000x)
En la Figura 2 se representa la evolución de las tres especies de microalgas a lo largo del tiempo respecto a la
absorbancia (A) y al número de células (B). Las microalgas utilizadas producen una cantidad significativa de
biomasa, siendo Nannochloropsis gaditana la que demostró una mayor productividad.
Figura 2. Curva de densidad óptica a 680 nm y número de células de las tres microalgas modelos.
En la Tabla 2 se representan los valores de eficiencia fotosintética o Qy y porcentaje de lípidos totales obtenidos
por Soxhlet. Según estos análisis de composición de lípidos, Phaeodactylum tricornutum presenta el mayor
contenido de lípidos totales, entre 35-50% respecto su biomasa seco y la eficiencia media de todas las especies
resultó ser similar, por lo que no se encontraban estresadas y pueden tomarse estos porcentajes de lípidos totales
como representativos de las especies en condiciones controladas.
Microalga
Qy
Lípidos totales (%)
(eficiencia fotosintética)
g lípidos · g biomasa seca-1
P. tricornutum
0.70
35-50
N. gaditana
0.66
30-40
S. obliquus
0.72
25-32.5
Tabla 1. Quantum yield (Qy) o eficiencia fotosintética y % medio de lípidos totales de las microalgas modelo.
Por último se publican tres perfiles de ácidos grasos de las microalgas estudiadas (Figura 3). Phaeodactilum.
tricornutum y Nanochloropsis gaditana presentan un alto contenido de EPA, pero no de DHA. En el caso de
Scenedesmus obliquus, ésta no presenta ni EPA ni DHA.
A
B
uV(x100,000)
C
uV(x100,000)
uV(x10,000)
Chromatogram
Chromatogram
Chromatogram
7.0
2.00
1.75
6.0
1.75
1.25
EPA (C20:5n3)
C1 6:1
C1 7:0
1.25
4.0
1.00
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
20.0
22.5
25.0
min
7.5
10.0
15.0
20.0
25.0
27.5 min
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
17.5
22.5
DHA
EPA
25.0
C24:0
C20:3n6
C20:0
20.0
C18:3n6
C18:3n3
C18:1n9t
C17:0
15.0
C17:1
C14:1
C13:0
0.00
22.5
C15:0
0.25
C18:1n9c
C18:2n6t
0.50
C11:0
C2 0:1
C1 8:2n6 t
C2 0:0
17.5
C1 8:3n6
C1 7:1
12.5
C1 8:1n9 t
C1 4:1
5.0
C1 3:0
C1 1:0
C1 0:0
2.5
C1 2:0
0.0
C1 5:0
C1 5:1
DHA (C22:6n 3)
27.5
1.0
C16:1
0.75
2.0
C2 4:0
C2 0:3n6C2 0:3n6
C2 0:0
C1 8:2n6 t
17.5
1.00
C2 2:1n9 + C2 0:4n6
EP A (C20:5n 3)
15.0
C1 8:3n6
C1 8:3n3
C2 1:0
C1 7:1
C1 5:1
C1 5:0
0.00
C1 3:0
C1 2:0
0.25
C1 8:1n9 t
C1 4:1
0.50
C2 2:1n9 + C2 0:4n6
C1 6:1
0.75
3.0
C10:0
C1 7:0
5.0
C21:0
1.50
1.50
27.5
Figura 3. Perfil de ácidos grasos por cromatografía de gases de Phaeodactilum. tricornutum (A), Nanochloropsis
gaditana (B) y Scenedesmus obliquus (C) en su fase exponencial de crecimiento.
Estos resultados, presumen ser prometedores para la optimización de la concentración de compuestos de interés
antes mencionados o para la mejora de los perfiles de ácidos grasos ricos en DHA y EPA. Durante los próximos
meses se evaluará el contenido de compuestos antioxidantes y de pigmentos presentes en estas especies, incluyendo
β-caroteno y xantofilas, entre otros. También se evaluará el contenido de carbohidratos y proteínas, tanto en
condiciones in-door como en producción continua en out-door. Una vez optimizado todo, se realizarán posibles
condiciones descritas para la inducción de la síntesis de estos compuestos de interés, tal como la alta irradiancia o la
carencia de nutrientes (Guedes et al. 2010; James et al. 2011; Liu et al. 2012).
Bibliografía
Bertrand, Martine. 2010. “Carotenoid Biosynthesis in Diatoms.” Photosynthesis research 106: 89–102.
Bligh, E.G. y Dyer, W.J. 1959. “A rapid method for total lipid extraction and purification”. Canadian Journal of
Biochemistry and Physiology, 37, 911-917.
Bold, H.C.1949. "The morphology of Chlamydomonas chlamydogama, sp." Bulletin of the Torrey Botanical
Club 72(2): 101-108.
Borowitzka MA. 1997. "Microalga for aquaculture: opportunities and constraints". J Appl Phycol 9:393-401.
min
Guedes, C, Meireles L, Amaro HM, and Malcata FX. 2010. “Changes in Lipid Class and Fatty Acid Composition of
Cultures of Pavlova Lutheri, in Response to Light Intensity.” Journal of the American Oil Chemists’ Society 87(7):
791–801.
Guillard RRL and Ryther JH. 1962. "Studies of marine planktonic diatoms". I. Cyclotella nana Hustedt and
Detonula confervaceae (Cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229239.
Ibañez, E,, Herrero M, Mendiola J,, and Castro-puyana M.. 2012. "Extraction and Characterizaton of Bioactive
Compounds with Health Benefits". Marine Bioactive Compounds..
James, G.O. et al. 2011. “Fatty Acid Profiling of Chlamydomonas Reinhardtii under Nitrogen Deprivation.”
Bioresource technology 102(3): 3343–51.
Liu, J., Yuan C., Hu G,, and Li F. 2012. “Effects of Light Intensity on the Growth and Lipid Accumulation of
Microalga Scenedesmus Sp. 11-1 under Nitrogen Limitation.” Applied biochemistry and biotechnology 166(8):
2127–37.
Mohammed, G.H., Binder, W.D. y Gillies, S.L. 1995. "Chlorophyll fluorescence- a review of its practical forestry
applications and instrumentation". Scandinavian Journal of Forest Research, 10 (4), 383-410.
Parkhill, J.P, Maillet G, and Cullen JJ. 2001. “Fluorescence-based maximal quantum yield for PSII as a diagnostic of
nutrient stress.” 529 517–29.
Pulz, O. and Gross W. 2004. “Valuable Products from Biotechnology of Microalgae.” Applied microbiology and
biotechnology 65(6): 635–48.
Subramaniam, R, Dufreche S, Zappi M, and Bajpai R. 2010. “Microbial Lipids from Renewable Resources:
Production and Characterization.” Journal of industrial microbiology & biotechnology 37(12): 1271–87.
Xia, S. et al. 2013. “Production, Characterization, and Antioxidant Activity of Fucoxanthin from the Marine Diatom
Odontella Aurita.” Marine Drugs 11: 2667–81.
Zhu, CJ., Lee, YK. 1997. Determination of biomass weight of marine micraolagae. J. Appl. Phycol. 9: 189-194