NEUROFISIOLOGIA - POTENCIAL DE DIFUSION

PRACTICA 2
NEUROFISIOLOGIA
El potencial de acción (PA, también llamado impulso nervioso) es una propiedad
fundamental de las células excitables. Fenomenologicamente es una perturbación transitoria
y regenerativa de la diferencia de potencial transmembrana (Vintracelular - Vextracelular), que
consiste en una rápida despolarización que invierte la polaridad de la membrana, seguida de
una repolarización que devuelve el potencial a las condiciones de reposo. Una vez que se
inicia un PA en una parte de la célula se induce la generación de PAs en los sitios
adyacentes, dando lugar a la propagación del impulso. El PA se produce por mecanismos
activos que existen solo en las células excitables. Estos mecanismos activos son canales
sensibles a voltaje que permiten un flujo selectivo de iones a favor de su gradiente
electroquímico. Es el flujo de corriente a través de estos canales lo que le da la forma
característica a un PA. Existen diversos tipos de canales permeables a iones y más aun,
cada tipo celular posee su propio conjunto de canales lo que produce una variada gama de
formas de potenciales de acción.
La iniciación del potencial de acción requiere de la estimulación de la neurona vía otra
neurona, un mensajero químico o un estímulo apropiado proveniente del ambiente externo
(en el caso de neuronas sensoriales). Sin embargo, cualquier fenómeno capaz de
despolarizar la membrana celular podría iniciar un potencial de acción. En el laboratorio, se
puede estudiar las características del potencial de acción aplicando intra o extracelularmente
pulsos de corriente. Tanto el estímulo como el consecuente cambio de potencial de
membrana pueden ser registrados utilizando capilares de vidrios (microelectrodos) que
atraviesan la membrana superficial (registro intracelular), o vía electrodos de metal que se
colocan en estrecho contacto con la preparación en estudio. En este último caso, es posible
registrar un cambio transitorio en el voltaje asociado con el potencial de acción (registro
extracelular), pero las características en el tiempo y su dependencia con la amplitud del
estímulo dependerá de otros factores tales como, la distancia entre el axón y el electrodo, el
umbral de cada axón individual, diámetro de la fibra, entre otros.
El arreglo experimental frecuentemente utilizado para caracterizar la respuesta eléctrica
en todas las preparaciones se muestra en la siguiente figura:
estimulador
cámara experimental
electrodos
nervio
amplificador
osciloscopio
interface
Figura 1. Arreglo experimental para registro extracelular del
potencial de acción
A
B
C
D
Figura 2. Potencial de acción
compuesto
Con este diseño es posible registrar la diferencia de
potencial entre los dos electrodos superficiales en la forma
de una señal bifásica, que se denomina potencial de acción
compuesto para diferenciarlo del potencial de acción obtenido
en un registro intracelular (figura 2). En ausencia de un
estímulo, no se establece una diferencia de potencial entre
los punto (2A, línea base), pero al registrarse una
despolarización en el segmento inicial de axón, a medida
que la onda de despolarización alcanza el primer electrodo
de registro, la superficie del nervio por debajo de ese
electrodo se hace mas negativa con respecto a la superficie
debajo del electrodo más distante, registrándose (por
convención) una deflexión hacia arriba en la diferencia de
potencial. Cuando la despolarización afecta a ambos
electrodos simultáneamente, la diferencia de potencial entre
los puntos regresa a 0 (2C). Finalmente, cuando la onda de
despolarización alcanza el 2do electrodo, la superficie ahora
se hace mas negativa que la superficie del electrodo más
proximal, registrándose entonces, una deflexión hacia abajo
en el registro del potencial de membrana (2D).
El resultado final es una señal bifásica: un pico positivo
desde la entrada no inversora seguida de un pico negativo
que se origina desde el terminal inversor. Ambos picos se
superponen, de forma que un pico tiene mayor amplitud que
el segundo.
Dependiendo de la distancia entre los electrodos,
pueden observarse diferencias en la forma del potencial de
acción compuesto, mientras su amplitud se ve afectado por
la calidad del contacto entre los electrodos y la superficie del
nervio.
Modelos experimentales
Historicamente, las preparaciones que poseen axones de mas de 50 um de diámetro
(axones gigantes) son muy apreciados por los investigadores interesados en caracterizar los
mecanismos moleculares responsables del potencial de acción.
La mayoría de los animales invertebrados poseen axones gigantes que permiten la
propagación rápida de los potenciales de acción. Típicamente estos axones forman parte del
circuito responsable de la respuesta refleja de escape rápido que desarrolla el animal, ante la
presencia de un depredador. El mejor ejemplo, y el más conocido, es el axón gigante del
calamar. Sin embargo, el nervio gigante de la lombriz de tierra (Lumbricus spp) ha sido
también extensamente estudiado. Entre las ventajas que presenta esta preparación es la
facilidad con que se puede aplicar fácilmente estímulos eléctricos a través de electrodos
colocados sobre la superficie corporal. De igual forma, la señal eléctrica generada puede ser
detectada fácilmente utilizado métodos no invasivos (electrodos extracelulares). Las razones
para ello es que debido a su gran tamaño, la amplitud de la señal es grande y no requieren
de largas distancias de recorrido. Por otra parte, las corrientes pasan fácilmente a través de
la piel del animal que ofrece baja resistencia al flujo de corriente eléctrica.
Al igual que los artrópodos, loa
anélidos (lombrices de tierra), poseen un
cordón nervioso localizado en la región
ventral del cuerpo, muy cerca de la
superficie corporal. A diferencia de
muchas de las otras fibras nerviosas que
componen el sistema nervioso del
animal
(500-1000
neuronas
por
segmento), el cordón nervioso ventral
recorre el eje anteroposterior
del
cuerpo. Cada uno de los axones que
componen el cordón ventral está
formado
por
muchas
neuronas
individuales cuyos axones se acoplan
eléctricamente
mediante
uniones
Figura 3. Localización del cordón
brecha. Los dos axones laterales están
nervioso ventral en Lumbricus
interconectados en muchos puntos y
spp
normalmente
se
activan
simultáneamente. Estas características hacen que el potencial de acción que se genera en
cada
fibra
individualmente,
se
transmita a cada una de las células
vecinas en forma rápida y simultánea,
haciendo que la fibra gigante se
comporte como un axón individual
(unidad funcional).
En un corte transversal del cordón
nervioso ventral, se puede observar 3
fibras nerviosas gigantes en la
superficie
dorsal
del
cordón,
fácilmente identificables por su
diámetro y la presencia de una
cubierta (similar a mielina) que rodea
Figura 4. Sección transversal del cordón nervioso
cada fibra. El axón en el centro, fibra
ventral en lombriz
gigante medial (MGF, por su sigla en
inglés) es de mayor diámetro y
conduce más rápidamente, en comparación con las dos fibras gigantes laterales (LGF, por
su sigla en inglés). El neuropilo compone la mayor parte del cordón y es donde se encuentra
la mayoría de las conexiones sinápticas.
En vertebrados, nervios periféricos largos (nervios
vago, ciático y el ulnar) están compuestos de paquetes
miles de axones individuales agrupados en pequeños
fascículos rodeados de una capa epitelial (perineuro).
Los fascículos se agrupan dentro de un tejido conectivo
laxo denominado epineuro (en el nervio ciático de
anfibios, el nervio consiste de un único fascículo de
axones rodeado de el perineuro y un epineuro laxo).
En el ciático, los axones difieren en aspectos
Figura 5 Sección transversal del nervio
morfológicos y funcionales. Algunos axones muestran
ciático mostrando los fascículos de fibras
anillos concéntricos muy densos, alrededor del perímetro
del axón (mielina). Por otra parte, cada nervio incluye axones sensoriales aferentes y axones
eferentes (autónomos y motores). Los axones que inervan órganos internos y glándulas,
tienden a ser pequeños en diámetro (0.3 – 1.3 um) en comparación a los que inervan fibras
musculares esqueléticas (2 – 20 um). El voltaje umbral, período refractario y la duración del
potencial de acción difieren entre estas fibras acuerdo a las características intrínsecas de
cada una, haciendo que la interpretación de las propiedades del potencial de acción
compuesto requiera considerar al nervio ciático como una población heterogénea de axones
individuales. Así, el potencial de acción compuesto que se registra como respuesta a un
estímulo particular será reflejo de todos los potenciales de acción generados con esa
amplitud de estímulo.
OBJETIVOS
(1) Conocer y familiarizarse con el arreglo experimental que permitirá observar los PAC.
(2) Estudiar la relación entre el estímulo y el umbral del PAC.
(3) Relacionar las características del PAC con la composición (número y tipo) de axones
que lo componen.
(4) Medir la velocidad de conducción de las distintas fibras
Ia.- Registro extracelular del potencial de acción de invertebrado
Equipo y materiales
Sistema de adquisición de datos (PowerLab Unit o Interface Vernier)
Unidad de estimulación y cables
Cables de registro
Alambres de Ag, con terminal clorurado
Equipo de disección
Plasticina y masking tape
Caja de petri
Toalla de papel
Bandeja de disección & alfileres
Goteros
10% etanol en solución salina de lombriz
Lombriz de tierra (Lumbricus spp.) de al menos 6 cm
Procedimiento
Equipo
1. Revise que la Interface esté apagado y que el cable USB esté conectado a la
computadora.
2. Revise todas las conexiones. Encienda la interface.
Disección
1. Tome una lombriz lo suficientemente larga y lávela rápidamente con agua para eliminar
cualquier residuo sucio
2. Coloque la lombriz en la caja de petri que contiene solución salina fisiológica y 10-15 %
etanol. La solución salina debe cubrir la lombriz completamente. Deje pasar un tipo hasta
que el animal esté completamente anestesiado (regularmente toma 5 min).
Una forma de verificar el grado de anestesia del animal, presione ligeramente la
superficie con un instrumento de punta “roma”. En caso de observar una reacción, déjela
por más tiempo en la caja de petri.
3. Una vez anestesiado, lave cuidadosamente con agua corriente la preparación y
transfiérala a la bandeja de disección con la superficie dorsal del animal orientada hacia
arriba
Nota: La superficie dorsal de la lombriz se identifica fácilmente al ser muy lisa y suave al
tacto. La superficie ventral, por el contrario, se caracteriza por la presencia de asperezas
al recorrerla en dirección cola a la cabeza. Finalmente, la superficie ventral es mas clara
4. Fije los extremos del animal con alfileres de disección. No lo estire demasiado para evitar
daños al nervio.
5. Coloque la bandeja de disección en el campo visual del estereoscopio
6. Inserte 4 alfileres medianos solo en la región medial del
animal. Los alfileres deben ser colocados lo mas plano
posible para no interferir con la visibilidad y con los
instrumentos de disección (ver figura)
7. Utilizando sólo tijeras y pinzas, haga una incisión. Extienda
la abertura hacia los lados. Lave la preparación
Frecuentemente con solución salina
8. Localice el cordón nervioso ventral en la superficie ventral,
removiendo el sistema digestivo y demás órganos del animal. La siguiente figura le ayuda
a identificar el cordón nervioso y otras estructuras anatómicas
9. Con mucho cuidado, elimine cualquier conección del cordón nervioso hacia las paredes
corporales ventrales y laterales, de forma que usted puede levantar ligeramente el nervio
fuera de la solución salina.
10. Coloque firmemente los electrodos al manipulador y
utilizando los controles apropiados, baje el manipulador
hasta colocarlo por debajo del nervio.
11. Con los controles del manipulador, y con la ayuda del capilar
de vidrio, suba el cordón nervioso por encima de la solución
salina
12. Seque ligeramente el exceso de solución salina entre los
alambres del electrodo
13. Llame a su instructor para realizar las conexiones de su
preparación al equipo de registro y que le permita observar
actividad eléctrica espontánea, como se observa en la
siguiente figura.
14. Conecte dos pines rectos a la salida del estmulador e
inserte cada pin a través de la cavidad corporal de la
lombriz, en el extreme de la cabeza o la cola. Verifique que
la zona alrededor de los electrodos de estimulación se
mantenga seca.
15. Una vez finalizado el montaje, inicie los experimento, siguiendo las indicaciones
especificadas en el punto II.
Ib.- Registro extracelular del potencial de acción en anfibio (2 grupos)
Equipo y materiales
Sistema de adquisición de datos (PowerLab Unit o Interface Vernier)
Unidad de estimulación y cables
Cables de registro
Cámara experimental y conectores
Equipo de disección
Plasticina y masking tape
Caja de petri
Toalla de papel
Bandeja de disección & alfileres
Goteros
Nervio ciático previamente disectados
En este experimento se estudiaran los mismos parámetros que permiten caracterizar las
propiedades eléctricas en preparaciones multicelulares: latencia, umbral, magnitud, curso
temporal y duración.
1. Tome un nervio ciático previamente aislado
2. Transfiera el nervio a la cámara experimental, colocando el extremo proximal (central)
sobre los electrodos de estimulación. Para transferir el nervio, utilice los hilos de algodón
atados a los extremos del nervio.
3. Conecte la salida del estimulador al extremo anterior de la cámara como se observa en la
figura 6. El terminal negativo (cátodo) debe estar conectado al terminal más cercano a los
electrodos de registro. La distancia entre los electrodos debe ser aproximadamente 0.5
cm. No es necesario conectar los terminales verdes.
4. Conecte el terminal BNC rojo (+) del cable de estimulación a la salida analógica de la
interface. Así mismo, conecte el terminal BNC negro (-) a la salida analógica de la
interface.
Figura 6. Conexiones
entre el PowerLab y la
cámara experimental. El
pulso de estimulación se
generará a través del
terminal
de
salida
analógica. Generalmente
el terminal verde (tierra)
no se utiliza
5. Conecte los terminales los terminales rojo y negro del primer electrodo de registro a 2 de
los conectores de las cámara experimental (figura 8) Conecte el terminal 8-pin DIN al
canal de entrada 1 (Input 1) de la interface.
6. Repita el paso 5 con el segundo electrodo de registro, pero conectándolo en terminales
alejados de los electrodos de estimulación. Este electrodo de registro debe estar
conectado a la entrada 2 (Input 2) de la interface.
II.- Procedimiento general
1.-
Determinación del estímulo umbral
En este experimento, se registrará la respuesta del nervio en respuesta a pulsos de corriente
de amplitud creciente para determinar el valor del estímulo umbral (mínima amplitud del
estímulo capaz de generar un potencial de acción con una probabilidad del 50%).
1. Abra el programa de adquisición.
Determine la amplitud del
estímulo umbral para pulsos de
100 s de duración a una
frecuencia de 10/seg.
2. Inicie el experimento (star). Debe
observar un registro similar a la
figura 5. Con el artefacto del
estímulo. La amplitud de éste
artefacto puede alcanzar valores
muy
grandes,
pero
la
recuperación debe ser rápida, de
Figura 5. Estimulación subumbral genera una
respuesta artefacto
forma tal que la línea-base debe alcanzarse en 1 o 2 mseg luego del estímulo.
3. Comience con estímulos muy pequeños y gradualmente aumente la intensidad del
estímulo. Aumente la amplitud del estimulo, presionando el botón de amplitud en el panel
del estimulador.
4. Continúe aumentando la amplitud del estímulo en pasos de 0.05 V, permitiendo un
período de reposo de al menos 2 segundos entre estimulación. Cuando obtenga una
respuesta del axón gigante medial, similar a la figura 6, detenga el experimento.
Si alcanza valores mayores de 3 V sin obtener respuesta, consulte con su instructor.
Figure 6. Potencial de acción compuesto registrado en MGF
5. Disminuya la amplitud del pulso en 0.2 V. Estime el valor del estímulo umbral
aumentando y disminuyendo hasta alcanzar un valor de intensidad del estímulo que es
capaz de generar intermitentemente un respuesta en el nervio
6. Registre el valor del estímulo umbral: _______________________
7. Observe el registro
Describa brevemente las características de la señal registrada. ¿Cuál de los
componentes de la señal corresponde a un potencial de acción?
¿En que se diferencian un potencial de acción de un registro intracelular al observado en
esta preparación?
Con este arreglo experimental ¿será posible registrar un potencial de acción
monofásico?
¿Cuál es el origen del artefacto?
2.- Reclutamiento de axones periféricos
1. Aumente progresivamente la amplitud
del pulso de estimulación a partir del
valor umbral
2. Para cada respuesta determine
(a) amplitud de la respuesta
(b) duración
(c) latencia
Como referencia, observe las siguientes
figuras
Figura 7. Registro del potencial de acción de
MGF y LGF
amplitud máxima
latencia
duración
¿Observa cambios en la amplitud del potencial de acción compuesto en función de la
amplitud del estímulo? ¿Cuál es la base fisiológica para esta respuesta?
¿Observa cambios en el período de latencia cuando se aumenta la intensidad del
estímulo?¿Cuál es la base fisiológica para esta respuesta?
¿Cuál sería la diferencia de medir la latencia al inicio de PAC con respecto a medirlo en
su valor máximo?
Para la preparación de anélido, ¿porque existe diferencia en la latencia entre la
respuesta de MGF y LGF?
3.- Velocidad de conducción a través del nervio
1. Usando una regla, mida la distancia entre el cátodo (- , negro) y el primer electrodo de
registro (R1). Con estos datos calcule la velocidad de conducción.
2. Con los datos obtenidos del experimento 2 (características de CAP) seleccione el
registro donde obtuvo la máxima amplitud del CAP.
3. Use la siguiente ecuación para calcular la velocidad de conducción. Exprese sus
resultados en m/s.
V=
(distancia)_ ;
(Δt)
Velocidad de conducción: ________________
Diseñe otro método para medir la velocidad de conducción
¿Cuáles parámetro determinan la velocidad de conducción de un axón
Potencial de difusión - Potencial de membrana
OBJETIVOS :
1) Conocer la instrumentación y el arreglo experimental necesarios para medir las
señales eléctricas a través de la membrana plasmática
2) Conocer las condiciones necesarias para la generación de un potencial de difusión a
través de una membrana artificial
3) Comprender el origen del potencial de difusión y su relación con el gradiente de
concentración de iones distribuidos diferencialmente a través de la membrana
4) Comprender el significado y utilidad de la ecuación de Nernst para estimar el
potencial de membrana en reposo en membranas biológicas.
Cuando entran en contacto dos soluciones con diferente concentración de electrolitos, los
iones que conforman la solución tenderán a difundir a favor de sus gradientes de
concentración. Si las movilidades iónicas son distintas, se producirá temporalmente una
diferencia de potencial eléctrico (potencial de difusión) en la unión o interface entre las dos
soluciones. El curso temporal de éste potencial electroquímico se desarrollará en dos fases:
una fase inicial que evoluciona rápidamente hasta alcanzar un valor máximo, que
posteriormente decae a consecuencia de la igualación en las concentraciones iónicas en
ambos lados de la interface.
El funcionamiento del sistema nervioso se
basa en el procesamiento de una señal
eléctrica (potencial de membrana) que surge
como una diferencia en los potenciales
electroquímicos de ciertos iones que se
distribuyen diferencialmente a través de la
membrana. En células animales, la
membrana en reposo es relativamente
impermeable a los iones sodio (Na+) por lo
que el movimiento de este ión no es un factor
determinante en la magnitud y polaridad del
potencial de membrana. Sin embargo, existe
una mayor permeabilidad a los iones potasio
(K+) a través de canales no selectivos activados en el reposo (canales de fuga). El gradiente
de concentración de K+ a través de la membrana generado por la bomba Na-K ATPasa
permite que estos iones difundan al exterior celular, que en ausencia de un influjo de de
carga positiva, genera entonces un potencial de reposo negativo en el interior de la célula
Tiene que darse tres condiciones para que se forme una diferencia de potencial a través de
una membrana: (1) deben estar presente moléculas con cargas eléctricas, por lo general
iones en ambos lados de la membrana, (2) deben existir fuerzas que impulsen el movimiento
de los electrolitos a través de la membrana, y (3) el paso de los electrolitos por la membrana
debe ser diferencial, es decir, las cargas positivas y las cargas negativas deben pasar con
velocidad diferente. Esto puede ser por diferencias en la permeabilidad de la membrana o
por diferencias en la movilidad de los electrolitos. Si la membrana es permeable a todos los
iones, el potencial de difusión tendrá inicialmente un valor máximo que declina
progresivamente a medida que los iones difunden a través de la membrana y el gradiente de
concentración se reduce. Sin embargo, si la membrana es impermeable al anión o catión, la
diferencia de potencial se desarrolla en forma permanente
En este ejercicio de laboratorio, demostraremos la formación de un potencial electroquímico
entre dos compartimentos separados por una membrana artificial, originado únicamente por
las movilidades diferenciales de los iones que componen la solución. Observaremos como la
velocidad de difusión depende de la naturaleza del ion (ej.: carga y tamaño hidratado) y su
concentración. En este arreglo experimental, la membrana artificial difiere de las membranas
biológicas en dos aspectos importantes: 1) la membrana artificial es permeable tanto a K+
como a Na+, y 2) la membrana artificial no posee una bomba Na-K –ATPasa que mantiene el
gradiente de concentración de iones a través de la membrana
Para conocer la magnitud teórica del potencial eléctrico a través de la membrana artificial,
usaremos la ecuación de Nernst que incluye el parámetro permeabilidad iónica modificando
la relación de concentración iónica y asumiendo que la permeabilidad de cada ión particular
es proporcional a su coeficiente de movilidad:
V
C
R T
 ln 1
n F
C2
   

 





,
(1)
en donde:
R = constante de los gases = 2 cal / mol x kelvin
T = temperatura absoluta (kerlvin),
n = valencia del ion,
F = constante de Faraday = 23,062 cal/mol x volt.
C = concentración (M) en los compartimientos 1 y 2
 y  son las movilidades del catión y el anión del electrolito, respectivamente.(*)
Para iones monovalentes, a temperatura de 25°C, pasando a log decádico y sustituyendo los
valores de RT/zF, la ecuación de Nernst (1) puede ser simplificada como:
V  59 log
*
C1
C2
u  v

 
u

v

’
(2)
La velocidad o movilidad en centímetros por segundo en la cual un ión se mueve a
través de la solución, depende de la naturaleza del ión (carga, tamaño de la capa de
solvatación, concentración de la solución, temperatura y la diferencia de potencial
establecida por cm de la vía conductora). La movilidad absoluta se define como
velocidad promedio de migración en un campo eléctrico de 1 volt/cm
MATERIALES Y EQUIPO
1 voltímetro de alta resistencia de entrada
2 electrodos no polarizables Ag-AgCl con puentes de 2 M KCl en agar (4%)
1 botella pequeña de plástico sin fondo, con tapón de rosca perforado,
Membranas de diálisis
1 soporte con prensa
1 agitador magnético
2 probetas de 25 ml
Pipetas de 1, 2 y 5 ml
1 vaso de laboratorio (beaker) de 150 ml
Soluciones de HCl, LiCl (1 M, 1 mM)
Agua destilada
Electrodos de registro:
Los electrodos de registro (Fig. 1) consisten en primer
lugar de una jeringa plástica de 1ml, que se extiende
hasta un "puente salino" (agar al 4% en KCL 3M) en
uno de sus extremos. En el interior de la jeringa, se
encuentra una solución salina de KCl saturada (3M) y
sumergido en dicha solución, hay un electrodo
metálico de plata:plata clorurada (Ag/AgCl).
Con esta configuración se minimiza el potencial
de unión que se origina cuando un metal esta en
contacto con una solución iónica.
Los electrodos de plata se unen a cables en un punto
de soldadura localizado en el tapón del pistón, y
estos a su vez se conectan a la entrada (input) de un
voltímetro u otro sistema de registro
tapón del
pistón..
jeringa de
tuberculina
alambre de
Ag/AgCl
KCl
(3M)
Puente de
agar 4%
Figura 1
Mientras no se realizan registros (al comienzo del
experimento o entre medidas), los extremos de agar de los electrodos se deben mantener
en un recipiente en contacto con una solución de KCl 0,1M. En esta situación, si conectamos
los electrodos metálicos al voltímetro, la diferencia de potencial que se registra debe ser cero en
condiciones ideales. En la práctica, sin embargo, se producen potenciales residuales,
denominado potencial de asimetría, a nivel de los electrodos o de los instrumentos
electrónicos utilizados. Por lo tanto, con la finalidad de conocer el valor real del potencial
eléctrico, en cada medida debe registrarse el valor del potencial asimétrico entre los
electrodos que será posteriormente sumado o restado a las medidas realizadas.
Voltímetro:
Este aparato mide la diferencia de voltaje entre dos puntos conectados a cada cable. Por
convención, los cables se identifican por un código de color: negro es la referencia y el rojo
es el punto a medir. Siguiendo esta convención, si el voltímetro indica valores positivos (+)
indica que el cable rojo esta conectado a un punto con un voltaje mas positivo que el valor de
referencia (cable negro).
Cámara de registro:
El sistema de registro experimental es
bastante sencillo (Fig. 2) Se coloca una
pieza de membrana artificial (membrana
plasmática) entre dos compartimientos
(citoplasma y medio extracelular). En cada
compartimento se coloca la misma solución
salina pero a distintas concentraciones. El
voltímetro medirá el potencial (voltaje) que
se genera a través de la membrana artificial
cuando entran en contacto las dos
soluciones.
voltímetro
electrodo
Ag/AgCl
puente de
agar
rojo
negro
compartimiento
Para medir la diferencia de potencial
extracelular
eléctrico que se origina entre los
compartimientos (membrana) se ponen en
membrana artificial
compartimiento
intracelular
contacto los electrodos externos de Ag/AgCl
con las soluciones, y se conectan a la
figura 2
entrada del voltímetro u otro sistema de
registro analógico. Durante todo el
experimento, asegúrese de mantener conectado al terminal rojo el compartimiento designado
como el medio intracelular.
PROCEDIMIENTO
Experimento 1. - Registro del potencial de difusión.
1. Corte una pieza de membrana de aproximadamente 2 cm2 y colóquela en el fondo de la
tapa horadada (con rosca) de una botella plástica
2. Coloque una capa muy ligera de silicona tanto en la zona de la tapa que hace contacto
con la botella como en la rosca de la botella
3. Con la ayuda del cierre de rosca, tape la botella de plástico firmemente y fije la botella al
soporte metálico usando una prensa.
4. Llene ahora el vaso de 150 ml con la solución concentrada (0.1M HCl) y colóquelo debajo
de la botella fija
5. Conecte los electrodos a los terminales de entrada (input) del voltímetro
Registre la diferencia de potencial entre los electrodos en un período 5-10 seg. Repita el
procedimiento a los 15 seg. y luego a los 30 seg (mantenga el voltímetro apagado entre
lecturas). Considere el promedio de estas 3 lecturas como el potencial de asimetría y
utilícelo para corregir el valor del potencial de difusión medida en los experimentos
subsiguientes.
6. Llene ahora la botella de plástico con una solución de 1M HCl, y sumérjala rápidamente
en la solución del vaso de 150 ml, de forma que los niveles de los dos líquidos queden
iguales para evitar diferencia de presión hidrostática, fijándola luego en esta posición al
soporte.
7. Saque ahora los electrodos del baño y sumérjalos en los dos compartimentos.
a. Anote la polaridad y voltaje que indica el voltímetro. _______________________
b. Describa el curso temporal del cambio en el potencial transmembrana
c. Compare la magnitud y polaridad del potencial de difusión obtenido con el valor
esperado de a cuerdo a la ecuación de Nersnt.
________________________________________________________________
d. Si existen diferencia entre estos valores, explique brevemente las posibles razones
para estas diferencias
8. Apague el multímetro, lave los electrodos con agua destilada y retorne los electrodos al
baño de KCl (0.1 M) mientras hace el siguiente experimento.
9. Vacíe ambos compartimientos y lávelos ligeramente con agua destilada.
10. Repita el mismo procedimiento utilizando un gradiente de concentración de LiCl de 1/10
(extracelular/intracelular):
a. Anote la polaridad y voltaje que indica el voltímetro. _______________________
b. ¿Cuál es el valor esperado de potencial de difusión de acuerdo a Nersnt?
_________________________________________________________________
c. Describa el curso temporal del cambio en el potencial transmembrana
d. Explique brevemente porqué existen diferencias en la magnitud y polaridad del
potencial de difusión entre las soluciones de HCl y LiCl
e. ¿Qué pasaría si las movilidades entre los iones fueran las mismas?
Experimento 2: Determinar la relación entre la concentración extracelular de H+ y la
magnitud del potencial de membrana
1. Vacíe el compartimiento extracelular, lávelo ligeramente con agua destilada y sustituya
el contenido de la botella con una solución de HCl (0.1 mM)
2. Siguiendo la secuencia experimental del ejercicio anterior, mida la magnitud y polaridad
del potencial de membrana, bajo estas condiciones experimentales
3.
Repita el procedimiento anterior pero sustituyendo la solución contenida en la botella
(medio extracelular) con diluciones sucesivas de la solución prueba de HCl, a saber:
0,1 mM; 0.25 mM; 0.5 mM; 1 mM; 5 mM; 10 mM; 50 mM; 100 mM; 500 mM y 1M,
Recuerde siempre registrar la magnitud del potencial de asimetría entre los electrodos,
en cada una de los registros. Es posible que los electrodos, al estar expuestos a
soluciones diferentes, se vuelvan progresivamente más asimétricos. En este caso,
déjelos descansar más tiempo en la solución KCl y conéctelos eléctricamente.
4. Construya una grafica del la magnitud del potencial electroquímico registrado en función
de la relación logarítmica entre la concentración extracelular e intracelular de H+ (Vm vs
log [H+]o/[H+]i)
a. ¿Cuál es la pendiente de la curva? ________________________
b. ¿Que representa éste parámetro?
5. En la misma gráfica, represente los valores teóricos esperados de Vm de acuerdo a la
ecuación de Nernst
c. En teoría, ambas curvas deben coincidir. Discuta si existen desviaciones con
respecto a los valores esperados y las posibles razones que dan origen a estas
diferencias.
d. ¿Qué sugieren sus resultados?