Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999-2010 Diciembre de 2010
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WHO/HSE/GAR/BDP/2010.3 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999-2010 Diciembre de 2010 ALERTA MUNDIAL RESPUESTA MUNDIAL Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999-2010 Diciembre de 2010 Nota de agradecimiento La OMS desea agradecer a las siguientes personas que han colaborado con este documento: Directores editoriales Ali S. Khan Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta (Estados Unidos de América) Geoffrey L. Smith Colegio Imperial de Londres (Reino Unido de Gran Bretaña e Irlanda del Norte) Autores Antonio Alcami, Inger Damon, David Evans, John W. Huggins, Christine Hughes, Peter B. Jahrling, Grant McFadden, Hermann Meyer, Bernard Moss, Sergei Shchelkunov, Evgeny Stavskiy, Nina Tikunova Secretaría de la OMS Pierre Formenty, Daniel Lavanchy © Organización Mundial de la Salud 2011 Se reservan todos los derechos. Las denominaciones empleadas en esta publicación y la forma en que aparecen presentados los datos que contiene no implican, por parte de la Organización Mundial de la Salud, juicio alguno sobre la condición jurídica de países, territorios, ciudades o zonas, o de sus autoridades, ni respecto del trazado de sus fronteras o límites. Las líneas discontinuas en los mapas representan de manera aproximada fronteras respecto de las cuales puede que no haya pleno acuerdo. La mención de determinadas sociedades mercantiles o de nombres comerciales de ciertos productos no implica que la Organización Mundial de la Salud los apruebe o recomiende con preferencia a otros análogos. Salvo error u emisión, las denominaciones de productos patentados llevan en las publicaciones de la OMS letra inicial mayúscula. La Organización Mundial de la Salud ha adoptado todas las precauciones razonables para verificar la información que figura en la presente publicación, no obstante lo cual, el material publicado se distribuye sin garantía de ningún tipo, ni explícita ni implícita. El lector es responsable de la interpretación y el uso que haga de ese material, y en ningún caso la Organización Mundial de la Salud podrá ser considerada responsable de daño alguno causado por su utilización. Las opiniones expresadas en documentos de autores citados son responsabilidad exclusivamente de dichos autores. Servicios editoriales proporcionados por Biotext, Canberra (Australia). Impreso por el Servicio de Producción de Documentos de la OMS, Ginebra (Suiza). Índice Antecedentes ............................................................................................................. vii 1 Vacunas antivariólicas ...................................................................................... 1 Resumen de orientación .........................................................................................2 1.1 Introducción................................................................................................2 1.2 Historia de la vacunación antivariólica .......................................................3 1.3 El Programa OMS de Erradicación Mundial de la Viruela...........................4 1.4 Origen del virus variolovacunal ..................................................................5 1.5 La vacuna utilizada para erradicar la viruela ..............................................6 1.6 Vacunas antivariólicas clonales y vacunas antivariólicas preparadas en cultivos tisulares .................................................................7 1.7 Vacunas antivariólicas atenuadas mediante pases por cultivos tisulares o mediante recombinación genética ...........................................8 1.8 Vacunas antivariólicas de subunidades proteínicas y de ADN ...................9 1.9 La vacunación tras la exposición a la viruela ..............................................9 1.10 Retos futuros de la vacunación antivariólica............................................10 Abreviaturas ..........................................................................................................11 Referencias ............................................................................................................12 2 Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) ............. 17 Resumen de orientación .......................................................................................18 2.1 Introducción..............................................................................................18 2.2 Obtención y manipulación de muestras...................................................19 2.3 Aislamiento del virus.................................................................................21 2.4 Microscopia electrónica............................................................................22 2.5 Pruebas de diagnóstico basadas en el genoma o en elementos del genoma .....................................................................................................23 2.5.1 El trabajo con el ADN del virus variólico ......................................23 2.5.2 Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción..........23 2.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa ..........................................24 iii 2.5.4 2.5.5 2.5.6 2.5.7 Reacción en cadena de la polimerasa–polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción.........................................25 RCP en tiempo real.......................................................................25 Análisis de micromatrices de oligonucleótidos............................28 Secuenciación...............................................................................29 2.6 Pruebas de diagnóstico basadas en proteínas..........................................30 2.7 Pruebas de diagnóstico serológico ...........................................................30 2.8 Reflexiones sucintas..................................................................................32 Abreviaturas ..........................................................................................................32 Referencias ............................................................................................................33 3 Genómica del virus variólico........................................................................... 37 Resumen de orientación .......................................................................................38 3.1 El genoma del virus variólico ....................................................................39 3.2 Evolución de la viruela ..............................................................................43 3.3 Técnicas del genoma del poxvirus ............................................................45 3.4 Directrices para los genomas del virus variólico ......................................46 Abreviaturas ..........................................................................................................51 Referencias ............................................................................................................52 4 Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS.............................................................. 55 Resumen de orientación .......................................................................................56 4.1 Introducción..............................................................................................56 4.2 Situación de los repositorios de cepas del virus variólico y de ácidos nucleicos en el centro colaborador de la OMS en la Federación de Rusia..................................................................................57 4.2.1 Situación de la colección de cepas del virus variólico y de su repositorio ...............................................................................57 4.2.2 Situación de la colección de ADN del virus variólico y de su repositorio en el Centro VECTOR .................................................62 4.3 Situación de los repositorios de cepas del virus variólico y de ácidos nucleicos en el centro colaborador de la OMS en Estados Unidos .......................................................................................................68 Abreviaturas ..........................................................................................................81 Referencias ............................................................................................................82 iv Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 5 Modelos animales y patogenia ....................................................................... 83 Resumen de orientación .......................................................................................84 5.1 Introducción..............................................................................................84 5.2 Modelos animales.....................................................................................85 5.3 Conclusión.................................................................................................95 Abreviaturas ..........................................................................................................95 Referencias ............................................................................................................97 6 Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela: situación de la terapéutica con moléculas pequeñas........................ 101 Resumen de orientación .....................................................................................102 6.1 Introducción............................................................................................103 6.2 Descubrimiento de medicamentos.........................................................106 6.2.1 Tiosemicarbazonas .....................................................................106 6.2.2 Evaluación de fármacos nuevos aprobados y en investigación...............................................................................107 6.2.3 Fosfonatos de nucleósidos acíclicos...........................................107 6.2.4 Inhibidores de deshidrogenasas de monofosfato de inosina ........................................................................................108 6.2.5 Inhibidores de hidrolasas de la S‐adenosilhomocisteína ...........108 6.2.6 Inhibidores de decarboxilasas de orotidina‐5’‐ monofosfato...............................................................................108 6.2.7 Inhibidores de sintasas de timidilato .........................................109 6.2.8 Compuestos que interfieren en el ensamblaje del virus............109 6.2.9 Cinasas de la familia Abl .............................................................109 6.2.10 Preparaciones inmunobiológicas ...............................................110 6.2.11 Compuestos varios .....................................................................110 6.2.12 Compuestos cuya estructura no se revelará hasta una etapa avanzada de su obtención................................................110 6.2.13 Método basado en la biología molecular para inhibir la multiplicación vírica, como la ribointerferencia ........................111 6.3 Modelos animales de la viruela y de la viruela símica en primates .......111 6.4 Datos de seres humanos para validar modelos animales ......................113 6.5 Cidofovir intravenoso .............................................................................113 6.6 CMX001 oral ...........................................................................................114 6.7 ST‐246 oral ..............................................................................................116 6.8 Efecto de la administración de medicamentos antivíricos en la protección vacunal..................................................................................118 Índice v 6.8.1 6.8.2 Cidofovir y Dryvax ......................................................................118 Efectos del tratamiento con ST‐246 (tecovirimat) en la protección conferida por las vacunas Dryvax y ACAM2000.......119 6.9 Medicamentos en desarrollo clínico.......................................................119 6.10 Cronología de la obtención de tratamientos para la viruela..................121 6.11 Análisis final ............................................................................................122 Abreviaturas ........................................................................................................123 Referencias ..........................................................................................................125 vi Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Antecedentes El tema de la destrucción de las reservas de virus variólico, el agente causal de la viruela, se ha tratado en la Asamblea Mundial de la Salud desde 1986, tras la declaración sin precedentes de la erradicación de la viruela en 1980. En varios comités se ha debatido intensamente si deberían conservarse los virus variólicos vivos restantes a fin de realizar más investigaciones cruciales para la salud pública, así como la definición de la índole de tales investigaciones con virus vivos. El Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico, que fue creado en 1999, supervisa todas las investigaciones con virus variólico vivo, basándose en las decisiones de la Asamblea de la Salud contenidas en las resoluciones WHA49.10, WHA52.10 y WHA55.15. Actualmente se mantienen repositorios de virus variólico vivo autorizados por la OMS solo en dos centros colaboradores de la OMS: los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, situados en Atlanta (Estados Unidos de América), y el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, situado en Novosibirsk (Federación de Rusia). En mayo de 2007, la 60.a Asamblea Mundial de la Salud, por medio de la resolución WHA60.1, pidió a la Directora General de la OMS que llevara a cabo un examen de gran alcance en 2010 de los resultados de las investigaciones que actualmente se llevan a cabo y los planes y requisitos para realizar nuevas investigaciones esenciales con fines de salud pública mundial, teniendo en cuenta las recomendaciones del Comité Asesor, a fin de que en la 64.a Asamblea Mundial de la Salud pueda alcanzarse un consenso mundial sobre la fecha de destrucción de las reservas de virus variólico. En noviembre de 2007, el Comité Asesor propuso que se redactaran resúmenes de las investigaciones a fin de que pudieran tratarse en la Asamblea de la Salud de 2011. En noviembre de 2008, el Comité Asesor decidió utilizar los siguientes métodos para el examen de gran alcance: • preparación de un análisis exhaustivo de las publicaciones y los datos inéditos acerca de investigaciones sobre virus variólicos vivos, de seis capítulos (que se detallan más adelante), por un grupo de científicos respaldados por el Comité Asesor que representen todos los campos de investigación y desarrollo en relación con el virus variólico y el trabajo pertinente con otros ortopoxvirus; • consideración del examen científico por algunos miembros del Comité Asesor (de diciembre de 2009 a abril de 2010); • consideración del examen científico por un cuadro externo de expertos independientes ajenos al ámbito del virus variólico: el grupo consultivo de expertos independientes encargado de examinar el programa de la viruela (AGIES) (de septiembre de 2010 a noviembre de 2010); • presentación del examen científico y el informe del AGIES para su consideración final por el Comité Asesor (noviembre de 2010); • consideración por el Consejo Ejecutivo de la OMS del examen científico y el informe del AGIES solicitados mediante la resolución WHA60.1, incluidas las recomendaciones del Comité Asesor (WHA60.1 OP4(1)) (enero de 2011); y vii • consideración de dicho informe y de las observaciones del Consejo Ejecutivo por la Asamblea de la Salud (mayo de 2011). Un grupo de científicos que recibieron el respaldo de miembros del Comité Asesor en su reunión de 2008 y que representan todos los campos de la investigación sobre el virus variólico se abocó a la primera parte de este proceso: el examen científico exhaustivo y el resumen. Bajo la supervisión del Comité Asesor, el grupo de científicos con conocimientos y experiencia específicos en relación con el virus variólico u otros ortopoxvirus comenzó a redactar el presente documento, Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010. El documento tiene seis capítulos, en los que se abordan las vacunas antivariólicas, el diagnóstico de laboratorio, la genómica del virus variólico, la situación de los repositorios de la OMS, los modelos animales y los medicamentos antivíricos. En noviembre de 2009, el Comité Asesor consideró y examinó los seis capítulos del documento. De noviembre de 2009 a octubre de 2010, el documento fue modificado y analizado varias veces. En octubre de 2010, el AGIES examinó estos seis capítulos y presentó una evaluación independiente de la necesidad de seguir conservando el virus variólico vivo. En conjunto, estos capítulos y el examen independiente demostraron el enorme progreso realizado bajo los auspicios de la OMS con los siguientes fines: • caracterizar numerosas cepas del virus variólico; • obtener dos posibles medicamentos antivíricos excelentes con mecanismos de acción bien definidos; • obtener vacunas antivariólicas nuevas y menos reactógenas (tanto vacunas autorizadas como vacunas experimentales); • idear pruebas de diagnóstico para la infección por el virus variólico y otros ortopoxvirus; y • obtener modelos animales de la infección por el virus variólico y otros ortopoxvirus. En la duodécima reunión del Comité Asesor, realizada el 17 y 18 noviembre de 2010, se presentó una versión anterior del Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010, con fecha del 10 noviembre de 2010. En la versión actual, de diciembre de 2010, se han incorporado las modificaciones sugeridas por el AGIES y los integrantes del Comité Asesor. Ali S. Khan y Geoffrey L. Smith Ginebra, diciembre de 2010 viii Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 1 Va c u n a s a n t i v a r i ó l i c a s Antonio Alcami1 y Bernard Moss2 1 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC‐UAM), Madrid (España) 2 Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (Estados Unidos de América) Nota de agradecimiento Para la preparación de esta revisión de las vacunas antivariólicas se recibió apoyo parcial de la División de Investigaciones Internas del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, que forma parte de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos, y del Ministerio de Ciencia e Innovación de España. 1 Resumen de orientación Importancia para la salud pública La viruela es la única enfermedad humana que ha sido erradicada mediante una campaña mundial de vacunación. Este logro sigue siendo uno de los grandes triunfos de las ciencias médicas. La vacuna antivariólica, que consiste en virus variolovacunal vivo, fue sumamente eficaz. No obstante, tiene antecedentes de complicaciones graves, especialmente en personas con inmunodeficiencia o eczema. Además, como se elaboraba en animales vivos sin condiciones de esterilidad, no se ceñiría a las directrices actuales para la fabricación. Por lo tanto, hay un claro interés desde el punto de vista de la salud pública en obtener una vacuna nueva, eficaz y segura. Progreso realizado hasta la fecha Se han obtenido y autorizado vacunas antivariólicas elaboradas en células de cultivos tisulares. Sin embargo, estas vacunas tienden a presentar una tasa de efectos adversos similar a la de las vacunas originales. Por consiguiente, se han adoptado diversos métodos para producir vacunas más seguras. El mayor progreso se ha logrado con cepas más atenuadas del virus variolovacunal: el virus variolovacunal Ankara modificado (MVA) y la cepa LC16m8, producidos mediante pases repetidos por cultivos celulares. El MVA, más atenuado que la cepa LC16m8, generalmente se administra por vía intramuscular o subcutánea, de modo que no produce la lesión cutánea característica que constituye el indicio de que la vacuna «prendió». La cepa LC16m8 puede administrarse mediante escarificación cutánea, como la vacuna antivariólica convencional, pero prende menos que el virus original (la cepa Lister del virus variolovacunal). Se ha comprobado en primates no humanos que el MVA y la cepa LC16m8 son seguros y tienen una buena capacidad inmunógena, incluida la protección contra el virus de la viruela símica, que es un pariente cercano del virus variólico. Las vacunas de nueva generación que consisten en virus variolovacunal vivo con mutaciones de genes específicos, genes de poxvirus codificadores del ADN (ácido desoxirribonucleico) y proteínas purificadas han resultado prometedoras en modelos animales pero ninguna ha llegado a la etapa de pruebas clínicas. Resultados e implicaciones La autorización de vacunas antivariólicas obtenidas en cultivos tisulares ha constituido un adelanto útil. Sin embargo, el uso de estas vacunas estaría contraindicado desde el punto de vista médico para las personas con inmunodeficiencia y ciertos trastornos cutáneos. Como la viruela se ha erradicado, la eficacia de las vacunas de nueva generación tendrá que determinarse usando poxvirus relacionados con el virus variólico en estudios de la protección conferida en animales y en estudios de la seguridad y la capacidad inmunógena en seres humanos. Sin embargo, la confianza en la capacidad de estas vacunas para conferir protección contra la viruela sería mayor si se usara virus variólico vivo para las pruebas de neutralización in vitro y los estudios en primates no humanos. 1.1 Introducción En 1980, se declaró que la viruela se había erradicado como resultado del Programa OMS de Erradicación Mundial de la Viruela. Frente al riesgo de liberación deliberada de virus 2 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 variólico como acto terrorista en todo el mundo, algunos países han fabricado vacunas antivariólicas para reponer sus reservas. Hasta ahora, la vacuna antivariólica (el virus variolovacunal) es la única vacuna que ha llevado a la erradicación de una enfermedad infecciosa de los seres humanos. No obstante, su historial de seguridad no se ciñe a las normas actuales, puesto que el uso de la vacuna conllevaba el riesgo de transmisión de otras infecciones (debido a que se producía en animales) y de varios efectos adversos. Por lo tanto, en los últimos años se han producido vacunas antivariólicas en cultivos tisulares. Estas vacunas consisten en cepas purificadas en placas o en cepas no clonales del virus variolovacunal obtenidas en cultivos tisulares o en huevos de gallina embrionados. Algunas de estas vacunas se basan en cepas que no se multiplican o en cepas muy atenuadas del virus variolovacunal, que son más seguras y tienen buenas propiedades inmunógenas. La información derivada de las investigaciones sobre el virus variolovacunal permite obtener vacunas de virus vivos atenuados, utilizando técnicas de recombinación genética para modificar los genes que intervienen en la gama de huéspedes o en la evasión inmunitaria. Otra estrategia que evita el uso de virus variolovacunal infeccioso es la inmunización con proteínas víricas que inducen una respuesta inmunitaria que protege contra la infección. Las vacunas de nueva generación pueden someterse a prueba en modelos animales sustitutos y compararse con las utilizadas para erradicar la viruela, teniendo en cuenta características tales como la neutralización del virus o la inducción de respuestas inmunitarias específicas. Las vacunas antivariólicas de nueva generación son más seguras que las tradicionales, propiedad que puede someterse a prueba en ensayos clínicos en seres humanos, y conservan las propiedades inmunógenas. Sin embargo, como la viruela se ha erradicado, una limitación importante de las pruebas es la imposibilidad de demostrar que las nuevas vacunas antivariólicas inducen inmunidad protectora contra la viruela en los seres humanos. 1.2 Historia de la vacunación antivariólica La viruela es la única enfermedad humana que ha sido erradicada gracias a una campaña mundial de vacunación. Este logro sigue siendo uno de los grandes triunfos de las ciencias médicas (Fenner et al., 1988; Smith y McFadden, 2002; Henderson, 2009). La variolización fue la primera medida que se tomó para combatir la viruela. Consistía en administrar el virus variólico aislado de las pústulas de viruela de una persona infectada, mediante insuflación o escarificación, a una persona no inmune. Aunque este procedimiento presentaba una tasa de mortalidad elevada (de 0,5% a 2%), era beneficioso comparado con la tasa de mortalidad por la viruela natural transmitida por la ruta respiratoria (de hasta 40%). La variolización, que se realizó en India y China durante siglos antes de ser introducida en Europa occidental en 1723, era el único método de protección contra la viruela hasta que Edward Jenner introdujo la vacunación en 1796. Jenner, médico de Berkeley, un pueblo pequeño de Inglaterra, notó que a las mujeres que ordeñaban vacas a veces se les infectaban las manos con el virus de la viruela vacuna y sufrían una infección local que parecía conferir protección contra la viruela. Jenner fue el primero en poner a prueba esta hipótesis, para lo cual tomó material de una lesión de la lechera Sarah Nelmes y vacunó a un niño, James Phipps. Cuando Jenner posteriormente expuso al niño mediante la variolización, el niño resistió la infección. Tras 1. Vacunas antivariólicas 3 estudios adicionales, Jenner publicó su Investigación acerca de las causas y efectos de la viruela de la vacuna, que marcó el comienzo de la era de la vacunación. Aunque otros habían observado la correlación entre la infección por el virus de la viruela vacuna y la resistencia a la viruela, Jenner demostró la eficacia de la vacunación mediante la inoculación de virus variólico, recomendó que se conservara el virus mediante pases en serie en seres humanos y promovió la vacunación. En consecuencia, se justifica atribuir a Jenner el mérito del descubrimiento de la vacunación. La vacunación pronto sustituyó a la variolización y su éxito llevó a Jenner a predecir en 1801 que «el resultado de esta práctica debe ser la aniquilación de la viruela, el flagelo más terrible de la especie humana» (Jenner, 1801). El descubrimiento fue oportuno, puesto que la viruela era en esa época un verdadero flagelo en Europa y en el resto del mundo. En un plazo de cinco años, la obra de Jenner fue traducida a la mayoría de los idiomas europeos, se crearon institutos de vacunación en muchos países y la vacuna llegó a todos los continentes. Sin embargo, la vacunación generalizada no era posible debido a problemas técnicos y a la escasez de la vacuna. La viruela vacuna era una enfermedad rara en Europa y no existía en América. Se practicaba la vacunación de una persona a otra, que llevaba a la transmisión de otros agentes patógenos y a la larga se prohibió. Posteriormente, comenzó a producirse el virus de la viruela vacuna, y después el virus variolovacunal, estrechamente relacionado, en la piel de animales vivos. Otro adelanto fue la obtención de la vacuna liofilizada en 1950, que posibilitó el mantenimiento, el transporte y el uso de la vacuna en el terreno sin refrigeración ni pérdida de potencia. Por último, la invención de la aguja bifurcada posibilitó la administración correcta de la vacuna por personal no especializado. 1.3 El Programa OMS de Erradicación Mundial de la Viruela En 1959, la 12.a Asamblea Mundial de la Salud adoptó una resolución, presentada por la Unión Soviética, en la cual se anunciaba la meta de la erradicación mundial de la viruela (Fenner et al., 1988). De 1959 a 1966, el progreso fue más lento de lo previsto, pero en 1967 se inició el Programa Intensificado de Erradicación de la Viruela. La política de vacunación mundial establecida en el marco del programa ponía de relieve la vigilancia de la enfermedad y adoptó el método de la barrera de vacunación para prevenir la transmisión de una persona a otra y controlar las epidemias de viruela. De esta forma se detectaban los casos nuevos y se los ponía en cuarentena, al mismo tiempo que se vacunaba y se ponía en cuarentena a los contactos cercanos de las personas infectadas. Esta política llevó a la erradicación de la viruela: el último caso natural se notificó en Somalia en 1977. Tras una extensa vigilancia en todos los continentes, la OMS confirmó la erradicación mundial de la viruela en 1979, y la 33.a Asamblea Mundial de la Salud declaró el 8 de mayo de 1980 que se había erradicado la enfermedad. La erradicación de la viruela constituye el mayor éxito de la OMS hasta la fecha y demostró que la profilaxis mediante la vacunación masiva puede llevar a la erradicación de enfermedades infecciosas. El éxito se debió a seis características clave de la vacuna y de la enfermedad: 4 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 • La infección variólica se produce solamente en seres humanos. No hay un animal que sirva de reservorio donde el virus pueda persistir y desde el cual pueda reintroducirse en la población humana. • El virus variólico no puede producir infecciones latentes o persistentes porque las personas que se recuperan de la enfermedad eliminan el virus. • La viruela era una enfermedad grave y los signos se notaban fácilmente. Por lo tanto, era fácil detectar a las personas infectadas y entonces se podía vacunar a los posibles contactos. • La vacuna inducía inmunidad protectora y era eficaz contra todas las cepas del virus variólico. • Ninguna variante del virus variólico podía escapar a la inmunidad protectora mediante variación antigénica debido a la gran fidelidad de la polimerasa del ADN (ácido desoxirribonucleico) vírico y a la presencia de varios antígenos. • La vacuna era fácil de preparar, económica y estable sin refrigeración, lo cual facilitaba su transporte durante la campaña mundial de erradicación. Es impresionante que se haya erradicado la viruela antes del advenimiento de la biología molecular y con conocimientos limitados del ciclo de multiplicación del virus variolovacunal, las proteínas víricas que constituyen el blanco de la inmunidad neutralizante o los mecanismos inmunitarios de la protección. A fin de evitar la reintroducción de la viruela en la población humana, bajo la dirección de la OMS todas las reservas conocidas de virus variólico que había en los laboratorios de todo el mundo fueron destruidas o enviadas a dos repositorios de virus variólico situados en laboratorios de máxima seguridad de Estados Unidos y la Unión Soviética, que ahora es la Federación de Rusia. Estos repositorios de virus variólico, que se encuentran en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, de Atlanta, y en el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, de Koltsovo, son los únicos lugares oficiales donde se mantienen reservas de virus variólico infeccioso. La OMS vigila estrechamente las investigaciones que se realizan con esas muestras. 1.4 Origen del virus variolovacunal Al principio se usaba el virus de la viruela vacuna para la vacunación antivariólica. Este virus se encuentra con poca frecuencia en el ganado y causa infecciones esporádicas en los seres humanos y en varios animales, pero su reservorio natural probablemente sea los roedores salvajes. En 1939, Downie mostró que las preparaciones contemporáneas de virus de la viruela vacuna utilizadas como vacuna antivariólica contenían un virus diferente que no se encontraba en la naturaleza, al cual se lo denominó virus variolovacunal por el nombre de la vacunación (Downie, 1939). Con los años, el virus variolovacunal reemplazó al virus de la viruela vacuna como vacuna antivariólica. Tras su uso extenso para la vacunación antivariólica durante el siglo XX, el virus comenzó a infectar a animales domésticos, en particular los búfalos en la India y el ganado en Brasil. Estos animales pueden a su vez transmitir el virus a los seres humanos. No obstante, el virus variolovacunal no se considera como un agente patógeno natural para los seres humanos. 1. Vacunas antivariólicas 5 Sobre la base de los análisis de las secuencias de los genomas víricos, es improbable que el virus variolovacunal derive de un virus de la viruela vacuna o de un virus variólico. La hipótesis preferida sobre el origen del virus variolovacunal es que se trata de una especie de ortopoxvirus que había infectado anteriormente a animales en los cuales ya no es endémica. Se había señalado la posibilidad de que el virus de la viruela equina constituyera el origen del virus variolovacunal, ya que los primeros vacunadores también obtenían vacuna de poxvirosis equinas y al menos una cepa de virus variolovacunal (Ankara) se aisló de un caballo (Mayr, Hochstein‐Mintzel y Stickl, 1975; Baxby, 1981). Además, en caballos de Przewalski enfermos se aisló un ortopoxvirus cuyo pariente más cercano es el virus variolovacunal (Tulman, 2006). No se tiene constancia de las razones por las cuales el virus variolovacunal, en vez del virus de la viruela vacuna, se convirtió en la vacuna antivariólica en el siglo XX. Es posible que el virus variolovacunal tuviera una mayor prevalencia cuando se adoptaron las vacunas o que los vacunadores hayan seleccionado el virus variolovacunal porque el virus de la viruela vacuna producía una reacción más grave, en tanto que el virus variolovacunal es menos virulento. Aunque el origen y el huésped natural del virus variolovacunal siguen siendo un misterio, este virus es el más estudiado entre los poxvirus. 1.5 La vacuna utilizada para erradicar la viruela Debido a la larga trayectoria del virus variolovacunal como vacuna, se ha usado una gran variedad de cepas de este en distintas regiones del mundo (Fenner et al., 1988). En los Estados Unidos y el Canadá, así como en África occidental, se usó la cepa del Departamento de Salud Pública de la Ciudad de Nueva York (NYCBH). En Estados Unidos, los laboratorios Wyeth comercializaron la vacuna Dryvax, preparada con linfa de la piel de terneros infectados con la cepa NYCBH, después de la campaña de erradicación de la viruela. La cepa EM‐63, derivada de la cepa NYCBH, se usó en Rusia y en la India, en tanto que la cepa Lister/Elstree, obtenida en el Instituto Lister del Reino Unido, se convirtió en la vacuna más usada en todo el mundo (Rosenthal et al., 2001). También se usó mucho la cepa Templo del Cielo/Tian Tan (China). Entre otras cepas del virus variolovacunal utilizadas en el programa de erradicación se encuentran las cepas Copenhague (Dinamarca), Berna (Suiza), Dairen (Japón), Ankara (Turquía), Tashkent (Uzbekistán) y París (Francia). La mayoría de las vacunas utilizadas en el programa de erradicación de la viruela fueron elaboradas en la piel de animales vivos, principalmente terneros pero también ovejas, búfalos y conejos. Aunque la vacuna antivariólica es la que llevó a la erradicación de una enfermedad infecciosa de los seres humanos, no tiene antecedentes perfectos en lo que se refiere a seguridad. La producción de la vacuna en animales creaba el riesgo de transmisión de otras infecciones, y la vacunación tenía varios efectos adversos. Se producían infecciones accidentales como consecuencia de la transmisión del virus desde el sitio de la inoculación de las personas vacunadas o por contactos. Las infecciones oculares y generalizadas constituían el mayor motivo de preocupación. La infección grave en las personas con eczema o deficiencia inmunitaria era una complicación importante. Ambos trastornos se consideraban como contraindicaciones para la vacunación antivariólica. Un porcentaje pequeño de las personas vacunadas presentaba efectos neurales adversos graves, como encefalitis, y estos casos eran imprevisibles. Algunas cepas de vacuna producían efectos adversos tras la vacunación con más frecuencia que otras (Lane et al., 1969; Fenner et al., 1988): los pocos datos 6 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 epidemiológicos disponibles parecen indicar que las cepas NYCBH y Lister presentaban efectos adversos con menor frecuencia, en tanto que las cepas Copenhague y Tashkent eran más virulentas. En algunos estudios de elaboración de modelos se ha calculado que el número de muertes tras la vacunación con la cepa NYCBH era de una por millón de vacunaciones (Halloran et al., 2002; Kaplan et al., 2002; Porco et al., 2004). En un examen reciente de los datos epidemiológicos disponibles se calcula que el número de muertes durante una campaña de vacunación masiva asciende a decenas por millón con la cepa NYCBH y hasta a doscientas por millón con la cepa Lister (Kretzschmar et al., 2006). Durante una campaña de vacunación antivariólica en Estados Unidos que abarcó a más de 700 000 personas, la frecuencia de casos de miopericarditis relacionados con la vacunación fue mayor de la prevista, lo cual suscitó una controversia en torno al programa (Arness et al., 2004; Eckart et al., 2004). Incluso si no se producen efectos adversos, son comunes otros efectos colaterales menos graves, como una lesión cutánea, febrícula y dolores de cabeza, que pueden llevar a la gente a mostrarse reacia a la vacunación. 1.6 Vacunas antivariólicas clonales y vacunas antivariólicas preparadas en cultivos tisulares En la actualidad, la preparación de vacunas antivariólicas en animales vivos es inaceptable debido a la preocupación por el control de la calidad en relación con la contaminación microbiana. Las vacunas de nueva generación, en cambio, se preparan en cultivos tisulares o en huevos de gallina embrionados. Aunque la vacuna antivariólica se elaboraba ocasionalmente en huevos de gallina embrionados durante la campaña de erradicación, se dispone de poca experiencia con la producción de vacuna en cultivos tisulares en gran escala y no se ha documentado bien la eficacia de esta vacuna en el terreno. Se ha documentado la heterogeneidad genética de las vacunas Lister y Dryvax utilizadas en el programa de erradicación (Li et al., 2006; Osborne et al., 2007; Garcel et al., 2009). Las vacunas de nueva generación son clones víricos purificados en placas con propiedades similares a las cepas originales. Aunque se cree que son tan eficaces como las primeras vacunas utilizadas para erradicar la viruela, es posible, aunque improbable, que hayan perdido clones víricos importantes para su eficacia en los seres humanos. Utilizando la cepa Lister obtenida en cultivos celulares, Sanofi Pasteur ha producido una vacuna no clonal que se encuentra actualmente en la etapa de pruebas clínicas. En agosto de 2007 se autorizó el uso en Estados Unidos de otra vacuna antivariólica clonal de nueva generación: la ACAM2000 (Frey et al., 2009), derivada de la Dryvax mediante purificación en placas y cultivada en la línea celular símica Vero. Aunque estas vacunas se fabrican de conformidad con las normas actuales, es posible que tengan los mismos efectos adversos que las vacunas Dryvax o Lister estándar utilizadas en la campaña de erradicación de la viruela. Una minoría importante de la población presenta contraindicaciones debido a las cuales no se pueden usar estas vacunas. Debido a los efectos adversos poco frecuentes pero importantes observados tras la administración de vacunas antivariólicas preparadas con virus variolovacunal capaz de multiplicarse plenamente, las investigaciones se han concentrado en la obtención de vacunas antivariólicas a base de cepas que no se multiplican o en cepas muy atenuadas del virus variolovacunal que sean más seguras y tengan buenas propiedades 1. Vacunas antivariólicas 7 inmunógenas. Un método que se usa comúnmente para atenuar el virus variolovacunal consiste en pasarlo varias veces por cultivos tisulares, lo cual conduce a alteraciones genéticas, a una menor virulencia y a una gama de huéspedes menor. 1.7 Vacunas antivariólicas atenuadas mediante pases por cultivos tisulares o mediante recombinación genética El virus variolovacunal Ankara modificado (MVA) es una cepa derivada de virus variolovacunal cultivado en la membrana corioalantoidea a fines de los años cincuenta pasándolo 570 veces por fibroblastos de embrión de pollo (Mayr, Hochstein‐Mintzel y Stickl, 1975). Con estos pases se obtuvo un virus con una gama limitada de huéspedes que no puede multiplicarse de manera eficiente en células humanas pero que expresa la mayoría de las proteínas víricas (Sutter y Moss, 1992; Mayr, 2003). Se autorizó el uso de este virus como vacuna en Alemania y se usó sin riesgos para vacunar a más de 100 000 personas, pero no se sometió a prueba su eficacia contra la viruela. El MVA presenta grandes deleciones en las regiones terminales del genoma, que contienen genes no esenciales que suelen intervenir en la evasión de la respuesta inmunitaria del huésped o en el mantenimiento de la amplia gama de huéspedes del virus variolovacunal (Antoine et al., 1998). Como consecuencia de estas deleciones, el MVA se multiplica bien en fibroblastos de embrión de pollo y en células renales de crías de hámster pero de forma restringida en células humanas (Carroll y Moss, 1997). En la mayoría de los tipos de células, el MVA produce la mayoría de los antígenos víricos, pero se forman solo partículas víricas inmaduras y se restringe la propagación de una célula a otra. Como vacuna, el MVA se considera eficaz porque provee una dosis antigénica casi completa y se considera seguro porque no se multiplica plenamente en las células de los seres humanos ni de la mayoría de los demás mamíferos (tal como se comprobó en estudios con monos inmunodeficientes [Stittelaar et al., 2001]). Induce un perfil de anticuerpos similar al inducido por la vacuna Dryvax e inmunidad protectora contra el virus de la viruela símica en primates no humanos (Earl et al., 2004, 2008). Sin embargo, se necesita una dosis mayor o varias dosis de MVA para lograr la protección inmunitaria que se obtiene con una sola dosis de virus variolovacunal capaz de multiplicarse. Ya han concluido los ensayos clínicos de las fases I y II con el MVA y se prevé que los ensayos clínicos de la fase III comenzarán en 2011 (Vollmar et al., 2006; Wilck et al., 2010). Combinados con estudios apropiados en animales, estos ensayos podrían llevar a la autorización de la vacuna. La cepa LC16m8 del virus variolovacunal se obtuvo pasando la cepa Lister de dicho virus por células primarias del epitelio renal a baja temperatura (30 °C) y fue autorizada en Japón en 1975 (Hashizume et al. 1985, Kenner et al., 2006). El virus prende a una tasa similar a la de la cepa Lister y difiere de ella en la restricción térmica, la gama limitada de huéspedes y la gran reducción de los efectos adversos (en lo que se refiere tanto a la gravedad de estos como al número de personas que los sufren). La cepa LC16m8 no presenta grandes deleciones en el genoma, y la mayoría de los marcos de lectura abiertos funcionan. El fenotipo de placas pequeñas de la cepa LC16m8 fue atribuido a una mutación en el gen B5R, que codifica una proteína con homología para complementar las proteínas regulatorias. Esta proteína es esencial para la formación de virus extracelular con envoltura y es un antígeno que constituye un blanco importante para los anticuerpos que neutralizan el virión (Putz et al., 2006). Como esta mutación es fácil de revertir, se ha obtenido una versión estabilizada de la cepa LC16m8, en la cual se ha suprimido el gen B5R en su totalidad (Kidokoro, Tashiro y Shida, 2005). En otras partes 8 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 del genoma vírico probablemente haya otras mutaciones que causan la restricción térmica y la atenuación in vivo. Se ha comprobado que la cepa LC16m8 protege a los monos contra el virus de la viruela símica (Saijo et al., 2006). La cepa Dairen I (DI) del virus variolovacunal se obtuvo de la cepa original Dairen después de 13 pases por huevos (Tagaya, Kitamura y Sano, 1961). Contiene una gran deleción en la región terminal izquierda del genoma, que abarca genes que influyen en la gama de huéspedes del virus y en la resistencia al interferón (Ishii et al., 2002). La información disponible sobre el MVA, la cepa LC16m8 y la cepa DI del virus variolovacunal es alentadora, y es necesario continuar y ampliar esta investigación. Las técnicas de recombinación permiten insertar, suprimir o interrumpir genes en determinados sitios del genoma a fin de obtener vacunas más seguras e inmunógenas (Moss, 1996; Jacobs et al., 2009). Se pueden atenuar virus suprimiendo genes que intervienen en la modulación inmunitaria, la gama de huéspedes o el metabolismo de los nucleótidos. Uno de los mutantes atenuados del virus variolovacunal que mejor han sido caracterizados es el NYVAC, en el cual se han suprimido 18 marcos de lectura abiertos (Tartaglia et al., 1992); otro es un mutante en el cual se ha suprimido el gen E3L, que aun así puede administrarse mediante escarificación (Jentarra et al., 2008). El virus variolovacunal NYVAC muy atenuado tiene menos capacidad inmunógena que las cepas de la vacuna (Midgley et al., 2008) y posiblemente sea necesario administrar dosis más altas. La inmunidad protectora tras la vacunación podría aumentar con una desactivación más selectiva de los genes que intervienen en la evasión inmunitaria o mediante la expresión de citocinas que potencian aspectos específicos de la respuesta inmunitaria. 1.8 Vacunas antivariólicas de subunidades proteínicas y de ADN Las proteínas víricas purificadas producidas por microorganismos recombinados, o la expresión de tales proteínas por el ADN, es otra forma de inducir inmunidad protectora contra la viruela. En los últimos años se ha avanzado en la identificación de las proteínas víricas que inducen inmunidad protectora contra los ortopoxvirus (Moss, 2010). Los anticuerpos contra las proteínas del virión neutralizan la infectividad del virus en cultivos tisulares, y en algunos estudios se ha comprobado que los animales inmunizados con combinaciones de proteínas de membrana, entre ellas A33, B5, L1 y H3, quedan protegidos contra la exposición posterior a un poxvirus virulento (Fogg et al., 2004; Davies et al., 2005; Heraud et al., 2006; Xiao et al., 2007; Buchman et al., 2010). La inmunización con la proteína vírica de tipo I que se une al interferón también protegió a los ratones contra la viruela murina, que es letal. Por lo tanto, las proteínas inmunomoduladoras víricas podrían representar otra opción para las vacunas a base de proteínas (Xu et al., 2008). Las vacunas de subunidades son más seguras que el virus variolovacunal infeccioso. Sin embargo, este método de vacunación tiene una limitación: no se ha demostrado que estas vacunas sean eficaces en un brote de viruela. 1.9 La vacunación tras la exposición a la viruela La vacunación tras la exposición a la infección por el virus de la viruela podría ser eficaz para reducir a un mínimo las víctimas de la viruela (Mortimer, 2003). Se han realizado 1. Vacunas antivariólicas 9 varios estudios para evaluar esta posibilidad en modelos animales. En la mayoría se llegó a la conclusión de que, para evitar la muerte, hay que administrar la vacuna a más tardar uno o dos días después de la exposición a un poxvirus virulento (Staib et al., 2006; Samuelsson et al., 2008; Paran et al., 2009). Lo interesante es que el MVA indujo una respuesta protectora más rápida que la cepa NYCBH en un modelo de exposición a la viruela símica, probablemente debido a que en el ensayo se usó una dosis alta (Earl et al., 2008). 1.10 Retos futuros de la vacunación antivariólica Frente al riesgo de liberación deliberada de virus variólico como acto terrorista, algunos países han fabricado vacunas antivariólicas para reponer sus reservas (Rosenthal et al., 2001), y la OMS ha constituido reservas de vacuna antivariólica. En general, estas vacunas no han sido preparadas en animales sino en cultivos tisulares, a fin de que se ciñan a las normas actuales. En vista de su similitud con la vacuna antivariólica tradicional, es probable que estas vacunas fabricadas tengan la misma eficacia y la misma tasa de efectos adversos. La producción de inmunoglobulina de virus variolovacunal o el uso de otros métodos tales como anticuerpos monoclonales contra determinados componentes víricos podría ser importante para el tratamiento de efectos adversos de la vacunación. Se necesitan vacunas antivariólicas más seguras debido a la frecuencia inaceptable de efectos adversos y a la gran proporción de la población humana que presenta contraindicaciones para la vacunación antivariólica. Los virus variolovacunales muy atenuados y moderadamente atenuados que están avanzando hacia su autorización, como el MVA y la cepa LC16m8, podrían hasta cierto punto resolver esta necesidad. Además, la información obtenida con las investigaciones sobre el virus variolovacunal puede usarse para obtener cepas de virus modificadas genéticamente y atenuadas de forma racional a fin de reducir su capacidad para multiplicarse, propagarse o modular la respuesta inmunitaria del huésped. Las nuevas vacunas pueden someterse a prueba en modelos animales para determinar si confieren protección, y en ensayos clínicos para evaluar su seguridad y capacidad inmunógena en los seres humanos. Además del costo elevado, una dificultad importante para el otorgamiento de licencias es la imposibilidad de demostrar que las nuevas vacunas antivariólicas inducen inmunidad protectora contra la viruela en los seres humanos. Como la viruela se ha erradicado, no se pueden hacer pruebas de eficacia de las nuevas vacunas contra la enfermedad natural. En cambio, es necesario someter a prueba las vacunas y compararlas con vacunas antivariólicas tradicionales en modelos sustitutos de viruela tales como viruela murina en ratones o viruela símica en primates. Otro método consiste en usar la reactividad a los antígenos del virus variólico y la neutralización de la infectividad de este virus en cultivos tisulares como marcadores (Damon et al., 2009). Aunque nuestros conocimientos de los parámetros inmunológicos correlacionados con la protección contra poxvirus virulentos todavía son limitados, han aumentado en los últimos años y podrían proporcionar puntos de referencia para comparar las vacunas tradicionales con las vacunas antivariólicas de nueva generación (Putz, et al., 2006; Kennedy et al., 2009). Sin embargo, la neutralización in vitro y los estudios con virus variólico vivo en primates no humanos aumentarían la confianza en la capacidad de estas vacunas para proteger contra la viruela. 10 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Abreviaturas ADN ácido desoxirribonucleico MVA virus variolovacunal Ankara modificado NYCBH Departamento de Salud Pública de la Ciudad de Nueva York OMS Organización Mundial de la Salud 1. Vacunas antivariólicas 11 Referencias Antoine G et al. (1998). The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. 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Vacunas antivariólicas 15 2 Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) Inger Damon1, Hermann Meyer2 y Sergei Shchelkunov3 1 División de Poxvirus y Rabia, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta (Estados Unidos de América) 2 Instituto Bundeswehr de Microbiología, Munich (Alemania) 3 Departamento de Investigaciones Genómicas, Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk (Federación de Rusia) Los resultados y las conclusiones contenidos en este informe son de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. 17 Resumen de orientación Importancia para la salud pública El virus variólico es el agente causal de la viruela, enfermedad que la Asamblea Mundial de la Salud declaró erradicada en 1980. Se considera que el virus podría usarse como agente de guerra biológica o como arma terrorista porque puede causar una gran morbilidad y mortalidad y porque ahora gran parte de la población humana es susceptible debido a que en los años setenta prácticamente se dejó de administrar la vacuna antivariólica de forma sistemática (Henderson et al., 1999). En vista de las graves consecuencias de un diagnóstico de viruela, incluso si es erróneo, es necesario que la viruela se pueda detectar de forma inequívoca, rápida y fiable, para lo cual hay que distinguirla de manera igualmente fiable de otros cuadros clínicos similares. El valor predictivo de un resultado de diagnóstico positivo (denominado también valor predictivo positivo) es sumamente bajo en relación con las enfermedades de baja prevalencia, para las cuales hay que usar estrategias de diagnóstico que mejoren el valor predictivo positivo. Progreso realizado hasta la fecha Entre 2000 y 2010 se realizaron grandes avances en la capacidad de diagnóstico clínico y de laboratorio de la viruela. En este capítulo se presenta una reseña de los métodos que se han utilizado para diagnosticar la viruela y se resumen los adelantos con las pruebas de diagnóstico basadas en el ácido nucleico, las serológicas y las de detección de proteínas ideadas desde el año 2000. Los adelantos tecnológicos han influido en los métodos utilizados por muchos investigadores. Concretamente, en las estrategias de detección de ácido nucleico se están usando en medida creciente técnicas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de alto rendimiento y, en algunos casos, plataformas de matrices. Resultados e implicaciones Se han ideado muchas pruebas basadas en el ácido nucleico, pero solo unas pocas técnicas de diagnóstico inmunológico o basado en proteínas. Todas las pruebas de detección relacionadas con el virus variólico y el poxvirus, incluidas estas pruebas nuevas, son experimentales: todavía no ha concluido el proceso de examen regulatorio y aprobación de ninguna de ellas. Cuando se redactó este capítulo se estaba examinando la posible necesidad de virus variólico vivo para el examen regulatorio de las pruebas. Hay en el mercado un equipo de diagnóstico basado en el ácido nucleico, pero es experimental solamente y no se usa para el diagnóstico. 2.1 Introducción Este capítulo se centra en los procedimientos de laboratorio para el diagnóstico clínico de la viruela. No se abordan los métodos de detección en el medio ambiente. Se presentan métodos de obtención y manipulación de muestras, así como una reseña somera de pruebas de diagnóstico anteriores, y se explican las pruebas serológicas y las pruebas basadas en el ácido nucleico. Este análisis no abarca un sistema ideado recientemente de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI), técnica que se usa en muy pocos laboratorios y todavía está perfeccionándose. 18 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 El virus variólico es el agente causante de la viruela. Se considera que podría usarse como agente de guerra biológica o como arma terrorista porque puede causar una gran morbilidad y mortalidad y porque ahora gran parte de la población humana es susceptible debido a que en los años setenta prácticamente se dejó de administrar la vacuna antivariólica de forma sistemática (Henderson et al., 1999). En vista de las graves consecuencias de un diagnóstico de viruela, incluso si es erróneo, es necesario que se pueda diagnosticar la viruela de forma inequívoca, rápida y fiable, para lo cual hay que distinguirla de manera igualmente fiable de otros cuadros clínicos similares. Antes de su erradicación en 1980, la viruela era relativamente fácil de reconocer clínicamente, aunque a veces se la confundía con otras enfermedades exantemáticas (Damon y Esposito, 2003; Shchelkunov, Marennikova y Moyer, 2005). Por ejemplo, la erupción grave propia de la varicela, causada por el virus varicela‐zóster, solía diagnosticarse erróneamente como viruela. Otras enfermedades que se confundían con la etapa vesicular de la viruela eran la viruela símica, la infección generalizada por el virus variolovacunal, la infección diseminada por el virus herpes zóster, la infección diseminada por el virus herpes símplex (HSV), reacciones adversas a medicamentos (erupciones), el eritema multiforme, infecciones enterovíricas, la sífilis secundaria, la sarna, picaduras de insectos, el impétigo y el molusco contagioso. Entre las enfermedades que se confundían con la viruela hemorrágica se encuentran la leucemia aguda, la meningococemia y la púrpura trombocitopénica idiopática. A fin de contrarrestar este tipo de error de diagnóstico, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), que son un centro colaborador de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en colaboración con muchas otras organizaciones profesionales, inventaron un algoritmo para examinar a los pacientes y determinar si tienen viruela1. El valor predictivo positivo (es decir, la proporción de resultados positivos verdaderos entre el total de resultados positivos de las pruebas) varía según la prevalencia de la enfermedad, lo cual es diferente de lo que ocurre con la sensibilidad y la especificidad, que son independientes de la prevalencia de la enfermedad y reflejan las propiedades de la prueba en sí. Por lo tanto, a efectos de la confirmación del diagnóstico de casos presuntos, el valor predictivo positivo se puede mejorar haciendo pruebas de muestras obtenidas de pacientes con síntomas clínicamente pertinentes y usando varios métodos de diagnóstico con fuentes independientes de error y varios objetivos para el reconocimiento. 2.2 Obtención y manipulación de muestras Los casos presuntos de viruela deben notificarse de inmediato al departamento de salud local o estatal que corresponda. De acuerdo con las recomendaciones internacionales vigentes2, el trabajo con virus variólico debe realizarse en laboratorios con un nivel de bioseguridad 4 según lo estipulado por la OMS. En 2010, dos centros colaboradores de la OMS tenían los medios 1 Véase el algoritmo e información adicional en http://emergency.cdc.gov/agent/smallpox/diagnosis/riskalgorithm/. 2 http://www.who.int/csr/disease/smallpox/SummaryrecommendationsMay08.pdf 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 19 para manipular muestras de virus variólico vivo: uno situado en los CDC, en Atlanta (Estados Unidos), y el otro situado en el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR de Koltsovo (Federación de Rusia). En el sitio web de los CDC hay información sobre la forma de obtener y manipular muestras sin peligro, en la sección titulada «Guide D – specimen collection and transport guidelines» del plan de respuesta a la viruela3. Por lo menos de dos a cuatro escaras o material de lesiones vesiculares (o ambos) se consideran como muestras apropiadas para pruebas de laboratorio. Las escaras pueden separarse de la piel intacta subyacente con un escalpelo o una aguja de calibre 26, y cada muestra debe guardarse en un recipiente separado para evitar la contaminación cruzada. Se han observado exantemas infecciosos coexistentes, entre ellos varicela y viruela símica. Se deben obtener muestras tanto del líquido vesicular de las lesiones como de la piel suprayacente. Después de levantar la piel suprayacente y de colocarla en un recipiente para muestras, se frota vigorosamente la base de la vesícula con un aplicador de madera o una torunda de poliéster o de algodón. El material viscoso puede colocarse en un portaobjetos de vidrio limpio y secarse al aire. Se puede preparar una impronta citológica colocando un portaobjetos limpio sobre una lesión abierta y aplicando presión gradualmente. Si es factible, se puede aplicar a la lesión una serie de tres rejillas de microscopio electrónico (colocando el lado brillante sobre la vesícula descubierta), aplicando sucesivamente presión mínima, moderada y firme (Hazelton y Gelderblom, 2003). Los portaobjetos de vidrio y las rejillas de microscopio electrónico se dejan secar al aire durante unos 10 minutos y después se colocan en una gradilla para portaobjetos o en una caja para rejillas a fin de transportarlos al laboratorio. Se están evaluando otros procedimientos para el muestreo de lesiones, entre ellos el almacenamiento de material en tipos apropiados de papel de filtro. No se recomienda almacenar muestras en medios de transporte (por ejemplo, como los que se usan para los herpesvirus), principalmente porque el medio diluye la muestra. Hay recomendaciones específicamente para la obtención y el procesamiento de muestras para microscopia electrónica4. Las biopsias de lesiones también pueden proporcionar material apropiado para la evaluación directa del virus. Se puede hacer una biopsia en sacabocados de 3 a 4 mm y bisecar la muestra, colocando la mitad en formol para las pruebas inmunohistoquímicas y el resto en un recipiente para muestras. Las muestras de sangre y exudado faríngeo obtenidas de casos presuntos de viruela durante la fase febril prodrómica y al principio de la fase exantemática también son posibles fuentes de virus. Asimismo, se puede obtener suero de los pacientes para pruebas serológicas a fin de fundamentar el diagnóstico de infección vírica o inferir un diagnóstico retrospectivo. Se deben obtener de cinco a diez mililitros de suero cuanto antes en el curso de la enfermedad y otra vez entre tres y cuatro semanas después. Las muestras que contengan virus deben almacenarse a –20 °C o sobre hielo seco hasta que lleguen a su lugar de destino, excepto por las rejillas para microscopia electrónica y 3 4 20 http://emergency.cdc.gov/agent/smallpox/response‐plan/#guided http://www.bt.cdc.gov/agent/smallpox/lab‐testing/pdf/em‐rash‐protocol.pdf Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 las muestras tisulares fijadas con formol, que deben mantenerse a temperatura ambiente. Las temperaturas estándar de los refrigeradores (4 °C) son aceptables para períodos de almacenamiento de menos de siete días. Embalaje y transporte de muestras clínicas El embalaje y el transporte de muestras clínicas deben ceñirse a las normas internacionales para el embalaje y el transporte de sustancias infecciosas. Hay que usar un sistema de triple embalaje o envasado para el transporte de todas las muestras clínicas (WHO, 2008a). Las muestras clínicas deben considerarse como sustancias infecciosas de la categoría A y se deben asignar al número de las Naciones Unidas UN 2814. En el sitio web de la OMS hay consejos prácticos para cumplir las normas relativas a todas las modalidades de transporte nacional e internacional de sustancias infecciosas y muestras obtenidas de pacientes5. 2.3 Aislamiento del virus El uso de embriones de pollo para el diagnóstico de infecciones por poxvirus se describió por primera vez en 1937 y se ha convertido en un instrumento de diagnóstico útil. Los únicos poxvirus conocidos que producen infecciones en los seres humanos y pústulas en la membrana corioalantoidea de huevos de gallina son cuatro ortopoxvirus: el virus variólico, el virus de la viruela símica, el virus de la viruela vacuna y el virus variolovacunal. Las diferencias en la morfología de las pústulas observadas en embriones de 12 días incubados a una temperatura de 34,5 a 35 °C fueron útiles para distinguir las especies de ortopoxvirus. En consecuencia, la prueba de la membrana corioalantoidea se usó mucho y eficazmente durante campaña de erradicación de la viruela. A pesar de la disponibilidad de nuevas técnicas de diagnóstico, el aislamiento del virus sigue siendo la prueba de referencia. Además, el cultivo es el único método que existe actualmente para producir virus vivos para exámenes ulteriores. Aunque el virus variólico crece satisfactoriamente en embriones de pollo, el cultivo celular suele ser la opción más sencilla. El virus variólico puede cultivarse en diversas líneas de cultivos celulares afianzadas, entre ellas las siguientes: • Vero, BSC‐1 y CV‐1 (células renales de mono verde africano) • LLC‐MK2 (células renales de mono Rhesus) • Células de fibroblastos pulmonares de embrión humano • HeLa (células de cáncer ovárico humano) • Fibroblastos de embrión de pollo • MRC‐5 (fibroblastos diploides humanos) Se observa un efecto citopático en el plazo de uno o dos días, según la cantidad de material infeccioso que haya en el inóculo inicial. Si hay poco material infeccioso, es posible que no se vean placas individualizadas durante tres o cuatro días. 5 http://www.who.int/ihr/biosafety/publications/en/index.html 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 21 2.4 Microscopia electrónica La microscopia electrónica es considerada como el método de primera línea para el diagnóstico de laboratorio de poxvirosis debido a la morfología característica del virión, el gran número de partículas que generalmente están presentes en las lesiones inducidas por poxvirus y la relativa facilidad con que se obtienen muestras. La microscopia electrónica de transmisión, que se convirtió en el método estándar de diagnóstico virológico en los años cincuenta, se usó mucho durante la época de la erradicación de la viruela. Ahora, el diagnóstico clínico de una poxvirosis en los seres humanos es poco frecuente, de modo que las observaciones efectuadas por medio de microscopia electrónica pueden proporcionar uno de los primeros indicios de la causa de una enfermedad exantemática de causa desconocida (Hazelton y Gelderblom, 2003). Los ortopoxvirus tienen en común viriones en forma de ladrillo, cubiertos de manera irregular por elementos tubulares cortos parecidos a segmentos pequeños de cinta. Pueden tener de 250 nm 290 nm a 280 nm 350 nm. Aunque las distintas especies de ortopoxvirus no pueden distinguirse morfológicamente, pueden separarse fácilmente de los herpesvirus. Este diagnóstico diferencial es importante para los seres humanos afectados (por ejemplo, para descartar la varicela causada por el virus varicela‐zóster). Como los poxvirus están estrechamente asociados a la matriz celular, es necesario preparar las muestras correctamente para que se pueda examinar el virus con el microscopio electrónico. Antes eso se hacía triturando material de escaras o lesiones en un mortero con arena estéril o pulverizando la muestra después de congelarla de forma ultrarrápida en nitrógeno líquido. Los sistemas de tubos que se comercializan actualmente (matrices de lisis combinadas con homogeneizadores de tejidos o molinos mezcladores) son mejores porque permiten estandarizar el procedimiento y evitar la contaminación cruzada. Dos ciclos de congelamiento y descongelamiento o el tratamiento por vibración ultrasónica (o ambos) facilitan la rotura de las células en un sistema de tubos cerrados. Con un baño de ultrasonidos con taza en forma de cuerno se pueden liberar incluso más viriones de la matriz celular. Se necesita una concentración de 105 partículas víricas por mililitro para efectuar un diagnóstico mediante la visualización de viriones. La preparación y el examen de las muestras requieren paciencia y experiencia. Incluso cuando se encuentran partículas de poxvirus en forma de ladrillo con bastante rapidez, vale la pena seguir examinando la muestra porque podría haber también otros virus. Según el número de partículas, el examen de una muestra podría llevar 30 minutos, de modo que se puede tardar hasta dos horas en obtener resultados con la microscopia electrónica después de recibir las muestras. En internet se describen métodos de tinción negativa e imágenes de partículas con tinción negativa6. 6 22 http://www.bt.cdc.gov/agent/smallpox/lab‐testing/pdf/em‐rash‐protocol.pdf Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 2.5 Pruebas de diagnóstico basadas en el genoma o en elementos del genoma En los últimos años, gracias al rápido desarrollo de las investigaciones del ácido nucleico hay numerosas opciones en lo que se refiere a métodos de detección a base de ADN (ácido desoxirribonucleico). Las técnicas de secuenciación de nucleótidos se han automatizado y se han vuelto asequibles, lo cual significa que técnicas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), la RCP en tiempo real, las micromatrices y, en menor medida, la secuenciación de genomas ya no están restringidas a unos pocos laboratorios especializados. 2.5.1 El trabajo con el ADN del virus variólico La distribución, la síntesis y la manipulación del ADN del virus variólico se rigen por una serie de reglas (WHO, 2008b). Fuera de los dos centros colaboradores de la OMS para la viruela y otras poxvirosis, está estrictamente prohibido conservar clones que contengan más de 20% del genoma del virus variólico en un momento dado. Para manipular ADN del virus variólico con una longitud de más de 500 nucleótidos se debe presentar una solicitud por medio de la sede de la OMS, y el laboratorio receptor no puede distribuir ADN del virus variólico a terceros. Tampoco se puede insertar ADN del virus variólico en virus variolovacunal ni en cualquier otro poxvirus y no se pueden manipular otros ortopoxvirus en laboratorios donde haya ADN del virus variólico. Sin embargo, se puede usar ADN del virus variólico que no tenga más de 500 pares de bases como testigo positivo en equipos de diagnóstico mediante RCP sin necesidad de pedir permiso, aunque en esos casos conviene avisar a la OMS. Asimismo, se pueden producir micromatrices de ADN sin permiso de la OMS. En estas micromatrices, los oligonucleótidos (menos de 80 pares de bases) se unen de forma covalente y, por lo tanto, son difíciles de reconstituir por medio de ligaduras. Estos oligonucleótidos, combinados, podrían abarcar el genoma completo. 2.5.2 Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción El método del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (PLFR) se basa en el hecho de que los genomas de los agentes patógenos, incluso los que están estrechamente relacionados, se definen por variaciones en la secuencia. En la práctica, este método consiste en aislar el virus de interés, extraer el ADN y después digerirlo con una endonucleasa de restricción o varias. Después, los fragmentos de ADN digerido se separan individualmente según el tamaño, utilizando electroforesis en gel, y se examinan visualmente. En condiciones ideales, cada cepa revela un perfil único (su huella genética). Para establecer un protocolo nuevo se pueden usar muchas enzimas de restricción diferentes. De esta forma se producen varias huellas moleculares que pueden analizarse a fin de determinar la mejor combinación posible de enzimas para distinguir entre cepas o aislamientos. Se han usado polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción generados con la enzima de restricción HindIII para distinguir entre especies de ortopoxvirus (Mackett y Archard, 1979; Esposito y Knight, 1985). Sin embargo, este método requiere un cultivo prolongado del virus para generar una cantidad suficiente de ADN de buena calidad. 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 23 2.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa La RCP produce grandes cantidades de una secuencia deseada de ADN a partir de una mezcla compleja de secuencias heterogéneas. Todo producto de la RCP tiene, por definición, un tamaño característico. Su identidad generalmente se confirma utilizando sondas de hibridación de ADN o productos de digestión obtenidos con endonucleasa de restricción, o más comúnmente mediante la secuenciación directa. La sensibilidad de una RCP se puede aumentar utilizando otro segmento cebador para amplificar un subfragmento del primer producto de la RCP. Sin embargo, esta técnica de RCP anidada lleva mucho tiempo y puede conducir a resultados positivos falsos. Por consiguiente, debería evitarse para el diagnóstico corriente. La RCP no distingue entre virus viables y no viables ni entre segmentos completos e incompletos del ADN genómico, lo cual puede complicar la interpretación de los resultados. Asimismo, al usar la RCP es importante incluir testigos positivos y negativos para validar los resultados. El uso de un testigo positivo ayuda a eliminar los resultados negativos falsos (es decir, si la RCP completa no ha funcionado correctamente), en tanto que el uso de un testigo negativo ayuda a eliminar los resultados positivos falsos (es decir, si todas las muestras se contaminan con el ADN o el molde de un virus). Si se toman estas precauciones, la RCP puede ser una opción realista para el profesional que efectúa el diagnóstico. Hoy en día, sus ventajas en lo que se refiere a rapidez, sensibilidad y especificidad compensan con creces el costo del equipo necesario, y existen procedimientos para evitar el peligro de la contaminación que produce resultados positivos falsos. Actualmente, la RCP es el método preferido para la identificación diagnóstica del virus variólico. Hay protocolos de la RCP para identificar y distinguir especies de ortopoxvirus sobre la base de las secuencias de la hemaglutinina (Ropp et al., 1995), el modificador B de la respuesta a la citocina (CrmB) (Loparev et al., 2001) y los genes de las proteínas de inclusión de tipo A (Meyer, Ropp y Esposito, 1997). En estas pruebas, la RCP se hace con cebadores que se prevé que amplificarán un segmento del ADN que estaría presente en cualquier ortopoxvirus. El amplicón obtenido mediante la RCP se digiere con una endonucleasa de restricción apropiada y después se separa mediante electroforesis en gel para distinguir entre especies comparando los perfiles de los fragmentos con los perfiles de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción del virus de referencia. Sin embargo, cuando se analizó un conjunto grande de aislamientos de una especie de ortopoxvirus, se puso de manifiesto la heterogeneidad del perfil de los fragmentos de restricción resultantes, que condujo a una interpretación bastante ambigua de los resultados (Meyer et al., 1999). A fin de distinguir especies de ortopoxvirus con una prueba de un solo paso, recientemente se ideó una prueba de RCP múltiple, en la cual se usan cebadores de oligonucleótidos singulares para identificar ortopoxvirus a nivel de especie. Utilizando cuatro pares de cebadores (tres pares para la identificación de especies, es decir, el virus variólico, el virus de la viruela símica y el virus de la viruela vacuna, y uno para la identificación del género), se produjeron amplicones de diversas longitudes específicamente para cada especie de ortopoxvirus (Shchelkunov, Gavrilova y Babkin, 2005). El par para la identificación del género sirve de testigo interno de la RCP a fin de determinar si hay ADN de ortopoxvirus en la muestra. La especificidad y sensibilidad de este método se evaluaron usando ADN de 57 cepas de ortopoxvirus, incluido ADN 24 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 preparado a partir de escarificaciones obtenidas de lesiones cutáneas de casos de viruela infectados entre 1970 y 1975, que formaban parte de la colección rusa de virus variólico. 2.5.4 Reacción en cadena de la polimerasa–polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción A fin de tener una idea general de la totalidad del genoma vírico sin determinar su secuencia completa, se ha empleado un método modificado de PLFR. La RCP se usa como paso preliminar para amplificar regiones que abarcan el genoma completo. Los amplicones se usan como molde de ADN para la técnica del PLFR. Esta técnica modificada, conocida como RCP–PLFR, presenta una gran sensibilidad para la identificación de agentes patógenos y se ha usado para distinguir entre varias especies de ortopoxvirus, entre ellas el virus variólico (Li et al., 2007). Este análisis se aplicó a 45 virus variólicos conservados en los CDC y 21 del Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR (Babkina et al., 2004a, b; Li et al., 2007) que fueron seleccionados teniendo en cuenta la diversidad de su distribución geográfica y los años transcurridos desde el momento en que fueron aislados. Se usaron 20 pares de cebadores consenso para producir 20 amplicones superpuestos que abarcaban el 99,9% del genoma del virus variólico. Por medio de un dendrograma compuesto de todos los perfiles de los amplicones obtenidos mediante la técnica de PLFR, se distinguieron las cepas del virus variólico mayor de las cepas del virus variólico menor y se agruparon las cepas según su ubicación geográfica o su historial epidemiológico (o ambos). A pesar de los avances impresionantes realizados con las técnicas del PLFR, posiblemente dejen de ser útiles dentro de poco debido a la celeridad del progreso en la secuenciación del ADN. 2.5.5 RCP en tiempo real Los métodos convencionales de RCP ahora se están reemplazando con pruebas de RCP en tiempo real. A diferencia de la RCP convencional, la RCP en tiempo real combina la amplificación y detección del ADN de interés en un recipiente, lo cual elimina los procedimientos posteriores a la RCP, que llevan mucho tiempo, y disminuye el riesgo de contaminación cruzada. Además, la RCP en tiempo real proporciona información cuantitativa. La fabricación reciente de máquinas portátiles para RCP en tiempo real y de reactivos liofilizados (Aitichou et al., 2008) plantea la perspectiva interesante de que el diagnóstico rápido (es decir, que lleve menos de dos horas) de brotes de enfermedad en el terreno se convierta en realidad. Las numerosas ventajas de la RCP en tiempo real llevaron a su introducción en el campo del diagnóstico de poxvirus, en el cual se puede usar para identificar la viruela con rapidez y sin ambigüedades y distinguirla de otras enfermedades exantemáticas. Sin embargo, es indispensable analizar grandes colecciones de cepas de ortopoxvirus para demostrar la utilidad de las pruebas obtenidas con estos métodos y conocer las características de su desempeño. Por lo general, en toda prueba se muestrea menos del 0,1% del genoma para obtener el resultado. En un informe se señaló que los apareamientos erróneos en las sondas permitían distinguir el virus variólico de otros ortopoxvirus por medio de un análisis de la curva de fusión (Espy et al., 2002). Sin embargo, si se agregan secuencias nuevas de ortopoxvirus provenientes del GenBank, las sondas muestran la identidad del virus de la viruela de los camellos y algunas cepas del virus de la viruela vacuna, lo cual significa que no se puede identificar el virus variólico de manera fiable. Cuando se disponga de información adicional sobre la secuencia de virus 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 25 conexos, será importante examinar periódicamente los diversos cebadores y sondas utilizados en la RCP (por medios informáticos si no se pueden hacer pruebas prácticas de laboratorio) para determinar su especificidad y sensibilidad reales. Se ideó una prueba de tamizaje para la identificación del ADN del virus variólico mediante RCP en tiempo real con LightCycler, que se combinó en un estuche en condiciones de prácticas adecuadas de fabricación, con reactivos normalizados (Olson et al., 2004). Se usó un solo apareamiento erróneo de nucleótidos, que produjo la sustitución de un aminoácido único en un total de 64 cepas del virus variólico, para diseñar un par de sondas de hibridación con una sonda sensora específica que permite distinguir el virus variólico de otros ortopoxvirus por medio del análisis de la curva de fusión. Se demostró la aplicabilidad de este método mediante la amplificación de 180 cepas de varias especies de ortopoxvirus (virus variólico, virus de la viruela símica, virus varicela‐zóster, virus variolovacunal, virus de la viruela de los camellos y virus de la ectromelia), y la temperatura de fusión del virus variólico difería mucho de la temperatura de fusión de las otras cepas de ortopoxvirus. En muestras obtenidas de donantes de sangre con trazadores (Schmidt et al., 2005), por medio de una prueba que permite detectar como máximo 11 copias de ADN por procedimiento se puede detectar de manera fiable el ADN de ortopoxvirus en muestras virémicas. Por lo tanto, con la detección temprana del virus variólico, la sensibilidad de esta prueba podría ayudar a evitar la dispersión de agentes víricos mediante la transfusión de sangre tras un acto de bioterrorismo. Hay otra prueba sumamente sensible y específica para la detección rápida de ADN del virus variólico en la cual se utilizan las plataformas SmartCycler y LightCycler (Kulesh et al., 2004). La prueba se basa en las características químicas de las sondas TaqMan y se usa el gen de la hemaglutinina de los ortopoxvirus como secuencia objetivo. La prueba fue evaluada en un estudio ciego con 322 muestras codificadas entre las cuales se encontraba ADN genómico de 48 aislamientos diferentes de virus variólico y 25 cepas diferentes que no eran de virus variólico. En otro método (Nitsche, Ellerbrok y Pauli, 2003) se usa la detección simultánea de regiones del genoma indicadoras del género de los ortopoxvirus y de la especie del virus variólico, lo cual podría facilitar el análisis de mezclas víricas que contengan virus variólico. En esta prueba, el virus variólico presenta la temperatura de fusión más elevada, y toda variante presenta una temperatura de fusión más baja. Se han publicado pruebas adicionales de RCP en tiempo real y se están ideando otras en diversos laboratorios internacionales. Cabe destacar que se puede producir una inhibición de la RCP, lo cual conduce a resultados negativos falsos. Sin embargo, eso se puede verificar con mecanismos internos de control apropiados. El cuadro 2.1 presenta un resumen de obras publicadas recientemente sobre pruebas de RCP en tiempo real para la identificación del virus variólico y su validación. Huelga decir que un resultado positivo de la RCP que indique la presencia de virus variólico debe confirmarse amplificando otras partes del genoma. El uso de varias pruebas dirigidas a diversas partes del genoma, además de pruebas de detección y diagnóstico que no estén basadas en el ácido nucleico, aumentará la confianza en el diagnóstico de la viruela en laboratorio, especialmente en vista de la ausencia actual de casos naturales de la enfermedad, que conduce necesariamente a un valor predictivo positivo cercano a cero. 26 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 2.1. Pruebas de RCP en tiempo real para la detección de virus variólico Referencia Espy et al., 2002 Gen objetivo (virus variolovacunal según la nomenclatura de Copenhague) HA/A56R Método LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico de otros ortopoxvirus. Ibrahim et al., 2003 HA/A56R Panning et al., 2004 HA/A56R Nitsche, Ellerbrok y Pauli, 2004 Prueba 1: Rpo 18 Prueba 2: VETF Prueba 3: A13L (virus variólico) Prueba 4: A13L (nVAR-OPX) Kulesh et al., 2004 Prueba 1: B10R Prueba 2: B9R Prueba 3: HA/A56R Sondas TaqMan utilizadas específicamente para el virus variólico. Olson et al., 2004 14kD/A27L LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico de otros ortopoxvirus. Sí. Carletti et al., 2005 CrmB LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distinguen los ortopoxvirus y los herpesvirus. Sí. Sin embargo, los datos presentados usan fragmentos del virus variólico obtenidos artificialmente. Fedele et al., 2006 CrmB Dos sondas TaqMan; una sonda se usa específicamente para el virus variólico. No. Se usó un constructo artificial. Escisión con sondas TaqMan específicamente para el virus variólico. LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico de otros ortopoxvirus. LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico de otros ortopoxvirus. ¿Validación mediante la secuencia genómica del virus variólico? No. Para la validación se usa un fragmento clonado del ADN del virus variólico. Sí. No. Se usó un constructo artificial. Sí. Sin embargo, los datos presentados usan fragmentos del virus variólico sintetizados artificialmente. Sí. Observaciones Varias cepas de virus de la viruela vacuna y de la viruela de los camellos tienen una temperatura de fusión idéntica a la del virus variólico. — Varias cepas de virus de la viruela vacuna tienen una temperatura de fusión idéntica a la del virus variólico. — Pruebas 1 y 2: Se amplifican algunas cepas del virus de la viruela vacuna. Prueba 3: El ácido nucleico objetivo es el mismo de la prueba descrita por Ibrahim et al. (2003), pero con una sonda ligeramente acortada. La prueba está disponible en el mercado: RealArt Orthopoxvirus LC Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La identificación específica del virus variólico debe efectuarse por medio del análisis de enzimas de restricción de los amplicones obtenidos mediante RCP. — 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 27 Referencia Scaramozzino et al., 2007 Gen objetivo (virus variolovacunal según la nomenclatura de Copenhague) 14 kDa/A27L Método Dos sondas TaqMan; una sonda se usa específicamente para el virus variólico. Dos sondas TaqMan; una sonda se usa específicamente para el virus variólico. Aitichou et al., 2008 HA/A56R Putkuri et al., 2009 HA/A56R LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico de otros ortopoxvirus. Loveless et al., 2009 B9R/B10R LightCycler con sondas de hibridación; con el análisis de la curva de fusión se distingue el virus variólico del virus variólico menor. ¿Validación mediante la secuencia genómica del virus variólico? Sí. Observaciones No. Para la validación se usa un fragmento clonado del ADN del virus variólico. No. Para la validación se usan fragmentos del ADN del virus variólico obtenidos artificialmente. No. Para la validación se usan fragmentos del ADN del virus variólico obtenidos artificialmente. — — — CrmB: modificador B de la respuesta a la citocina; HA: hemaglutinina; nVAR-OPX: ortopoxvirus no variólico; RCP: reacción en cadena de la polimerasa; VETF: factor de transcripción temprana del virus. 2.5.6 Análisis de micromatrices de oligonucleótidos Muchos de los problemas antedichos que surgen durante la detección de los virus a nivel de especie pueden resolverse con la hibridación de moléculas de ADN en micromatrices de oligonucleótidos, que con frecuencia se denominan microchips. El primer método se basa en la hibridación de una muestra de ADN amplificada, marcada de manera fluorescente, con sondas de ADN de oligonucleótidos inmovilizadas en un microchip tridimensional de gel de poliacrilamida (micromatrices de compuestos inmovilizados en gel [MAGIChip]). Las sondas identifican sitios específicos de especies determinadas en el gen vírico CrmB. Se analizaron en total 59 muestras de ADN de ortopoxvirus que representaban seis especies diferentes y no se observaron discrepancias entre los resultados de la hibridación y los obtenidos con la identificación convencional (Lapa et al., 2002). Se ideó otro método de micromatrices de oligonucleótidos con portaobjetos de vidrio y la cepa India del virus variólico. El gen objetivo es el G3R, que codifica una proteína que se une a las quimiocinas (Laassri et al., 2003). Este método basado en micromatrices permite detectar y diferenciar simultáneamente cuatro especies de ortopoxvirus que son patógenas para los seres humanos y distinguirlas del virus varicela‐zóster. Los autores sometieron a prueba 49 muestras conocidas y ciegas de ADN de ortopoxvirus que representaban diferentes especies de ortopoxvirus y dos cepas de virus varicela‐zóster. Con las micromatrices de oligonucleótidos se identificaron todas las muestras de manera correcta y fiable. 28 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 A fin de lograr redundancia y solidez, el microchip contiene varias sondas de oligonucleótidos singulares específicas para cada especie de virus. El nuevo procedimiento lleva solo tres horas y puede usarse para hacer pruebas paralelas de varias muestras. El análisis simultáneo de varios genes puede aumentar aun más la fiabilidad de la prueba. Se ha ideado otro método basado en micromatrices para la detección e identificación simultáneas de seis especies de ortopoxvirus (virus variólico, virus de la viruela símica, virus de la viruela vacuna, virus de la viruela de los camellos, virus variolovacunal y virus de la ectromelia), que también permite distinguir las especies de ortopoxvirus de los virus varicela‐zóster HSV‐1 y HSV‐2 (Ryabinin et al., 2006). Se usaron las secuencias de los genes B29R y B19R de la cepa de virus variolovacunal Copenhague para facilitar la identificación de los genes correspondientes en distintas cepas de ortopoxvirus, que a su vez se usaron para diseñar sondas para micromatrices de oligonucleótidos de especies determinadas. Se identificó el gen B29R, que codifica una proteína que se une a las quimiocinas CC, en 86 cepas de ortopoxvirus, y el gen B19R, que codifica una proteína de tipo I que se une al interferón, en 72 cepas de ortopoxvirus. La micromatriz contenía también varias oligosondas para la identificación de los virus varicela‐zóster HSV‐1 y HSV‐ 2. 2.5.7 Secuenciación La secuenciación de diversos amplicones obtenidos mediante RCP para fines de diagnóstico permite asignar una muestra a virus emparentados conocidos después de compararla con la base de datos respectiva. Se conocen las secuencias del gen de la hemaglutinina de más de 200 ortopoxvirus, que han resultado útiles en estudios filogenéticos. Estos estudios confirman el concepto actual de especies de ortopoxvirus establecidas, que antes se basaba en los distintos fenotipos de las respectivas especies. Entre 1940 y 1977 se determinó la secuencia de 45 aislamientos de virus variólico, diferentes desde el punto de vista epidemiológico (Esposito et al., 2006). El genoma es un ADN lineal de alrededor de 186 pares de kilobases, con los extremos cerrados de forma covalente. La poca diversidad de la secuencia indica que probablemente haya muy poca diferencia en el contenido de genes funcionales de los aislamientos. Eso aumenta la probabilidad de identificar de manera eficiente una cepa reemergente de virus variólico utilizando métodos de detección basados en la secuencia. Además, la poca diversidad de la secuencia es tranquilizadora e importante desde el punto de vista de la biodefensa porque indica una gran probabilidad de que se identifiquen infecciones por el virus variólico al dar seguimiento a brotes de una sola fuente o de varias. La posibilidad de rastrear el virus podría servir en sí de factor de disuasión para prevenir su uso deliberado. Además de los métodos descritos, se ha ideado una prueba con códigos de barra biológicos, en la cual se utilizan técnicas de secuenciación, para detectar agentes patógenos, entre ellos el virus variólico. Esta prueba se evaluó utilizando un fragmento sintetizado de virus variólico de 30 nucleótidos de longitud (He et al., 2008). Existe la preocupación de que la biotecnología posibilite la construcción de agentes patógenos peligrosos a partir del material genético de microorganismos naturales. Sobre la base de la comparación de la secuencia, el virus de la viruela de los camellos y el taterapox virus son los parientes más cercanos del virus variólico, y con unos pocos miles 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 29 de mutaciones el ADN de este ortopoxvirus podría convertirse en ADN del virus variólico (Sanchez‐Seco et al., 2006). Las secuencias de los genomas de poxvirus pueden verse en internet7. Están representados los ocho géneros de la subfamilia Chordopoxvirinae, incluidas las secuencias de 49 virus variólicos. Con los avances en la secuenciación, estas técnicas ciertamente se convertirán en un instrumento forense útil en caso de resurgimiento de la viruela, ya que la secuenciación es una forma de verificar claramente la cepa del virus. La interpretación del análisis forense basado en la secuencia deberá realizarse en el contexto de las mutaciones que puedan haberse acumulado como consecuencia de diversas técnicas de propagación (por ejemplo, multiplicación en animales, membrana corioalantoidea o cultivo tisular). 2.6 Pruebas de diagnóstico basadas en proteínas Aunque varios laboratorios están evaluando diversas preparaciones de anticuerpos para la detección de ortopoxvirus mediante captura de antígenos (Czerny, Meyer y Mahnel, 1989), los CDC han obtenido un anticuerpo monoclonal que parece actuar específicamente contra el virus variólico. Actualmente hay una sola prueba de diagnóstico basada en proteínas, en la cual se usan sueros policlonales contra el virus variolovacunal, para la detección de ortopoxvirus. La caracterización de esta prueba ha sido limitada, pero podría ser interesante utilizarla y evaluarla para la detección de ortopoxvirosis en el terreno a fin de determinar su sensibilidad y especificidad clínica. Los miembros del género de los ortopoxvirus son los únicos poxvirus que producen un antígeno de la hemaglutinina que se puede detectar con pruebas de hemadsorción o hemaglutinación utilizando eritrocitos de pollo apropiados. La inhibición de la hemaglutinación y la hemadsorción por el suero del paciente es un indicador de infección por ortopoxvirus. Estas pruebas, junto con las de difusión en gel y fijación del complemento, eran componentes clásicos de los métodos utilizados para diagnosticar la viruela antes de su erradicación (es decir, antes de los años setenta). Estos métodos no se usan mucho ni regularmente en la actualidad, pero sería conveniente evaluar su utilidad como métodos auxiliares. 2.7 Pruebas de diagnóstico serológico Si no se dispone de muestras de virus, la evaluación de los anticuerpos mediante la prueba de neutralización u otros métodos podría ser la única forma de definir la causa de la enfermedad. Otro tipo de prueba, solicitada con frecuencia en el marco de la respuesta al bioterrorismo, consiste en evaluar la protección residual que subsiste tras la vacunación. Sin embargo, no hay una prueba inmunológica sistemática única que permita determinar el grado de protección de que goza una persona contra una poxvirosis. Para que haya protección se necesita un conjunto coordinado de respuestas inmunitarias celulares y humorales. La presencia de anticuerpos neutralizantes 7 30 http://www.poxvirus.org Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 generalmente indica que la persona se ha recuperado de una infección, y no siempre que goza de protección prolongada contra una infección futura. Se pueden detectar anticuerpos neutralizantes contra el virus variólico, el virus de la viruela símica, el virus de la viruela vacuna o el virus variolovacunal tan solo seis días después de la infección o la vacunación; la eficacia de la prueba de neutralización con suero de animales o seres humanos infectados es de 50% a 95%. Se han detectado anticuerpos neutralizantes más de 20 años después de la vacunación antivariólica o de la infección natural con otro ortopoxvirus de los seres humanos (Putz et al., 2005). En la prueba de neutralización, la cuadruplicación del título de anticuerpos entre muestras de suero obtenidas en la fase aguda y en la convalecencia generalmente se considera como un diagnóstico de poxvirosis. Más recientemente se han caracterizado mejor los efectos neutralizantes de los anticuerpos contra las dos formas infecciosas del virus (virus maduro y virus extracelular), que difieren en cuanto a la estructura de la membrana y a las proteínas de la membrana que son reconocidas por el sistema inmunitario. Se han caracterizado las respuestas neutralizantes a varias de las proteínas del virus maduro; en cambio, hay una sola proteína del virus extracelular (B5) que, según se ha comprobado, es reconocida por una respuesta de anticuerpos neutralizantes. Entre los métodos serológicos que se usan actualmente para la detección de anticuerpos se encuentran pruebas de anticuerpos contra ortopoxvirus humanos tales como la prueba de neutralización del virus, la prueba de inhibición de la hemaglutinación, la prueba de inmunosorción enzimática (ELISA) y pruebas de inmunoelectrotransferencia (Putz et al., 2006). La descripción reciente de una prueba de inmunoglobulina M (IgM) para detectar ortopoxvirus podría mejorar la investigación de brotes de estas infecciones, a menudo en forma semirretrospectiva (Karem et al., 2005). Esta técnica tiene la ventaja de que mide la infección o enfermedad reciente causada por un ortopoxvirus. Su sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de una infección reciente por ortopoxvirus (determinadas durante el brote de viruela símica en Estados Unidos) son de alrededor de 95% cuando se evalúan entre los 4 y 56 días siguientes al inicio del exantema. Con una vigilancia epidemiológica apropiada, estas pruebas podrían ser útiles para evaluar la incidencia de la enfermedad; sin embargo, debido a que los anticuerpos presentan reactividad cruzada entre miembros de cada género de poxvirus, los resultados de las pruebas serológicas no son específicos para una especie de virus dada (Trojan et al., 2007). Para las respuestas serológicas de neutralización de virus se dispone de pruebas adicionales de inmunovaloración enzimática basadas en cultivos celulares, pruebas de reducción de microplacas y análisis basados en la celómica y en la separación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Eyal et al., 2005; Earl, Americo y Moss, 2003; Borges et al., 2008; Johnson et al., 2008). Aunque las respuestas inmunitarias celulares desempeñan una función importante en las poxvirosis y se cree que son cruciales para la inmunidad duradera, la prueba corriente que se usa para determinar la respuesta de los linfocitos T no es fiable ni reproducible. Una prueba de RCP en tiempo real reciente que determina la respuesta de los linfocitos T CD8+ tras la vacunación con el virus variolovacunal podría constituir otra forma de medir la infección. Sin embargo, por el momento esta prueba no presenta especificidad, ni siquiera para los ortopoxvirus, ya que simplemente mide una respuesta al interferón gamma. 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 31 2.8 Reflexiones sucintas Las pruebas de diagnóstico basadas en el ácido nucleico para identificar ortopoxvirus, incluido el virus variólico, se han multiplicado de forma notable, en tanto que el número de técnicas de diagnóstico inmunológico o basado en proteínas o en virus enteros ha aumentado poco. Todas las pruebas ideadas hasta la fecha son experimentales: todavía no ha concluido el proceso de examen regulatorio y aprobación de ninguna de ellas. Actualmente se está examinando la posible necesidad de virus variólico vivo para el examen regulatorio de las pruebas. En el mercado se consigue un estuche de diagnóstico basado en el ácido nucleico, pero es experimental solamente y no se usa para el diagnóstico; asimismo, se expende un estuche para la identificación genérica de ortopoxvirus mediante captura de antígenos, que también es experimental. Entre los instrumentos para la investigación cabe señalar las pruebas de RCP, seguidas de la identificación de especies de ortopoxvirus mediante la secuenciación o el PLFR. Las pruebas serológicas que evalúan las respuestas inmunitarias humorales (IgG, IgM, neutralización y otras) son todas experimentales y es posible que los reactivos no se consigan fácilmente. Un número determinado de centros colaboradores de la OMS que trabajan en el campo de los poxvirus y la viruela, así como otros laboratorios especializados (académicos y gubernamentales), podrían contar actualmente con medios y pericia para el diagnóstico de poxvirosis y la identificación del virus variólico. Se aconseja realizar un examen comparativo riguroso de las pruebas ideadas. Asimismo, hay que examinarlas a fin de que puedan considerarse como métodos de diagnóstico clínico. Se necesitará ácido nucleico derivado del virus variólico para evaluar la sensibilidad y especificidad de las pruebas basadas en el ácido nucleico, especialmente a medida que las plataformas de diagnóstico actuales se vuelvan obsoletas. Es necesario determinar cuál es el mejor material (por ejemplo, genoma completo, amplicones o plásmidos) para ello. La revisión y el desarrollo de métodos de diagnóstico clínico requerirán estudios con virus infecciosos para determinar cuáles son las mejores técnicas de preparación y extracción (especialmente en el caso de las pruebas por captura de antígenos y las basadas en el ácido nucleico). Algunos de estos estudios podrían hacerse con otros ortopoxvirus infecciosos. Abreviaturas 32 CDC Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades HSV virus herpes símplex OMS Organización Mundial de la Salud PLFR polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción RCP reacción en cadena de la polimerasa Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Referencias Aitichou M et al. (2008). Dual‐probe real‐time PCR assay for detection of variola or other orthopoxviruses with dried reagents. Journal of Virological Methods, 153:190– 195. Babkina IN et al. (2004a). 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Weekly Epidemiological Record, 83:393–395. 2. Métodos de diagnóstico de laboratorio de la viruela (virus variólico) 35 3 Genómica del virus variólico Grant McFadden1, David Evans2, Sergei Shchelkunov3 e Inger Damon4 1 Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Florida, Gainesville (Estados Unidos de América) 2 Escuela de Ciencias Clínicas y de Laboratorio, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta (Canadá) 3 Departamento de Investigaciones Genómicas, Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk (Federación de Rusia) 4 División de Poxvirus y Rabia, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta (Estados Unidos de América) Los resultados y las conclusiones contenidos en este informe son de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. 37 Resumen de orientación Importancia para la salud pública La nueva tecnología ha mejorado radicalmente nuestra comprensión de la genómica del virus variólico, lo que ha conducido a nuevas formas de detectar y diagnosticar la viruela y a una profundización del conocimiento de la historia evolutiva de la infección y de las razones de su gravedad. Sin embargo, las nuevas técnicas de biología sintética también han suscitado problemas imprevistos para el control del acceso al material genético del virus variólico. En este capítulo se presenta una reseña de los últimos descubrimientos en el campo de la genómica del virus variólico y se analiza la forma en que las nuevas técnicas de síntesis del genoma podrían causar confusión en las estrategias de contención del virus. Progreso realizado hasta la fecha A principios de los años noventa se publicó la secuencia completa del ADN (ácido desoxirribonucleico) de dos genomas de virus variólicos estrechamente relacionados. Como consecuencia de la intensificación de la agenda de investigaciones sobre la viruela, aprobada por la Secretaría de la Organización Mundial de la Salud (OMS) e iniciada en el año 2000, se ha publicado información casi completa sobre el genoma de 48 aislamientos de virus variólico provenientes de lugares diferentes. Estos datos pueden usarse para comprender mejor la evolución del virus variólico, mejorar el diagnóstico y (con estudios bioestructurales) profundizar los conocimientos de la sensibilidad de los virus a los medicamentos. Como resultado del trabajo con genes clonados del virus variólico, los investigadores también comprenden mejor las interacciones y las actividades de las distintas proteínas del virus. Eso proporciona conocimientos importantes sobre la forma en que el virus causa enfermedad en los seres humanos. En este capítulo se resume la información reunida sobre el genoma del virus variólico y se muestra la forma en que se ha aplicado al estudio de la relación del virus con otros poxvirus de animales, al estudio de la evolución del virus durante epidemias humanas y a la obtención de pruebas de diagnóstico. Asimismo, se analiza el uso futuro del material genómico del virus variólico a la luz de las nuevas técnicas de síntesis de ADN. Resultados e implicaciones A escala internacional, muchos científicos han utilizado la información publicada sobre el genoma para idear métodos de diagnóstico del virus sumamente sensibles. La nueva información sobre la relación entre el virus variólico y otros ortopoxvirus también es importante para comprender la utilidad y las limitaciones de los modelos animales para estudiar la viruela humana. Como consecuencia de los adelantos notables en las técnicas de síntesis de ADN, secuenciación y clonación, ahora es técnicamente posible sintetizar el genoma completo del virus variólico partiendo de cero, usando solamente la información publicada sobre la secuencia, y reconstituir virus infecciosos con las técnicas actuales de biología molecular. En las estrategias de biodefensa será necesario incorporar nuevas ideas sobre la mejor forma de controlar el uso de estas técnicas de biología sintética. 38 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 3.1 El genoma del virus variólico A principios de los años noventa se publicó la secuencia completa del ADN (ácido desoxirribonucleico) de dos genomas de virus variólicos estrechamente relacionados. En un estudio sistemático realizado en 2006 se compararon las secuencias genómicas completas de varios aislamientos de virus variólico provenientes de lugares diferentes de todo el mundo (Esposito et al., 2006). En la figura 3.1 se muestran las características generales del genoma genérico del virus variólico, en tanto que en la figura 3.2 se presenta un análisis de las relaciones de clades entre los aislamientos secuenciados. Técnicamente, se ha determinado la secuencia completa del genoma de una sola cepa de virus variólico (Bangladesh‐1975); esta es la única cepa cuyas secuencias terminales de los extremos del genoma se han dado a conocer formalmente (Massung et al., 1994). Las secuencias terminales, configuradas en forma de horquilla, están estrechamente relacionadas con las secuencias ortólogas en forma de horquilla del virus variolovacunal. Por «secuencias genómicas completas del virus variólico» entendemos aquellas que incluyen la totalidad del genoma, aparte de cualquier diferencia entre cepas que pueda estar relacionadas con las horquillas terminales y la secuencia contigua. Aunque no se ha demostrado formalmente, se supone que la única secuencia publicada de las horquillas terminales del virus variólico es idéntica a las secuencias terminales de las demás cepas del virus o podría sustituirlas plenamente. [LEYENDAS] concatemer resolution sequences = secuencias de la resolución del concatémero tandem repeat (TR) arrays = matrices con repeticiones en tándem palindromic end = extremo palindrómico Hindlll map (BSH75_banu) = mapa Hindlll (BSH75_banu) coding region sequences = secuencias de la región codificante (896 bp involves ORF‐9) = (896 bp abarca el ORF‐9) (626 bp area involves ORFs 184.5, 185.7, 185) = (el área 626 bp abarca los ORF 184.5, 185.7 y 185) inserts in alastrim and West African VARVs = insertos en virus variólico alastrim y de África occidental varied Ts affect lysine repeat codon in ORF‐16 = T variadas afectan al codón con repeticiones de lisina en el ORF‐ 16 varied AT repeats near ORF‐192 = repeticiones de AT variadas cerca del ORF‐192 3. Genómica del virus variólico 39 Figura 3.1. Genoma del virus variólico bp = par de bases; ORF = marco de lectura abierto. Fuente: Esposito JJ et al. (2006). Reproducido con autorización. [LEYENDAS] substitutions per site = sustituciones por sitio Figura 3.2. Relaciones de clades entre los aislamientos del virus variólico de secuencia conocida Relaciones filogenéticas entre aislamientos del virus variólico secuenciados. A) Un filograma de consenso desarraigado de una alineación de 65 pares de kilobases de las secuencias de la región codificante central de 45 virus variólicos revela tres clades de alto nivel que representan conglomerados de aislamientos originarios de África occidental (clade A, anaranjado), América del Sur (clade B, verde) y Asia (clade C, violeta). El clade asiático contiene un subgrupo de variantes africanas que no son de África occidental (violeta) y que divergen en tipos víricos con una tasa de letalidad baja o mediana. Se indican las tasas de letalidad (rojo) relacionadas con algunos aislamientos, y algunas se examinan en el texto explicativo. B) Árbol de consenso arraigado por medio de las secuencias de la región codificante central del CMLV (virus de la viruela de los camellos)-CMS70 y el TATV (taterapox virus)-DAH68 alineado con virus variólicos representativos del árbol del diagrama A. Fuente: Esposito JJ et al. (2006). Reproducido con autorización. La base de datos sobre secuencias genómicas del virus variólico creció rápidamente durante el decenio pasado debido a los avances tecnológicos continuos en la secuenciación del ADN y la bioinformática. Una de las dos primeras secuencias publicadas del genoma del virus variólico se determinó con el método químico de Maxam y Gilbert (Shchelkunov, Blinov y Sandakhchiev, 1993a, b; Shchelkunov et al., 1993), pero para las demás se utilizó el método de Sanger de secuenciación automatizada al azar (Massung et al., 1993, 1994) o técnicas de paseo con cebador (Esposito et al., 2006). Los genochips también han sido útiles para la resecuenciación rápida y la identificación de cepas del virus variólico (Sulaiman et al., 2007; Sulaiman, 40 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Sammons y Wohlhueter, 2008). Estos adelantos tecnológicos han mejorado considerablemente la exactitud y la celeridad de la secuenciación y han reducido drásticamente su costo. Por ejemplo, con la tecnología actual se puede secuenciar cualquier genoma con una redundancia de lectura de 25, en unos días, a un costo inferior a US$ 1.000. Estas secuencias genómicas constituyen una rica fuente de conocimientos nuevos sobre la genética y la evolución del virus variólico, sus relaciones con otros ortopoxvirus y las interacciones coevolutivas con el huésped humano (Gubser et al., 2004; Shchelkunov, Marennikova y Moyer, 2005). También se han usado para idear instrumentos de diagnóstico a fin de distinguir el virus variólico de otros ortopoxvirus que pueden detectarse en muestras biológicas (Li et al., 2007b; Sulaiman et al., 2007; Sulaiman, Sammons y Wohlhueter, 2008). Las secuencias, junto con las secuencias conocidas de los genes y la sensibilidad de otros ortopoxvirus a los medicamentos, constituyen prueba de que todas las cepas del virus variólico deberían ser sensibles a tratamientos medicamentosos tales como el ST‐246 y el derivado del cidofovir CMX001. Los adelantos en el campo de los métodos de diagnóstico y los medicamentos antivíricos se abordan en el capítulo 6 del presente informe. Como consecuencia de los notables adelantos recientes en las técnicas de secuenciación del ADN, clonación y síntesis de genes, ahora es técnicamente posible, como se describe más adelante, sintetizar el genoma completo del virus variólico partiendo de cero, usando solamente la información publicada sobre la secuencia, y reconstituir un virus variólico infeccioso con las técnicas actuales de biología molecular. Por consiguiente, tal vez ya no se pueda eliminar la amenaza de un resurgimiento del virus variólico vivo como entidad biológica, incluso si se destruyen las reservas de virus que se encuentran en los centros colaboradores de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en Estados Unidos y la Federación de Rusia. Los genomas de todos los aislamientos de virus variólico secuenciados hasta la fecha están estrechamente relacionados entre sí, en parte porque la deriva evolutiva es más lenta en los poxvirus que en muchos otros virus (particularmente los virus de ARN [ácido ribonucleico], como el virus de la inmunodeficiencia humana y el de la gripe). Todos los genomas de virus variólico de secuencia conocida, que tienen alrededor de 185 kilobases de longitud, contienen unos 200 marcos de lectura abiertos. Estos marcos expresan proteínas que se asemejan en grados diversos a las proteínas expresadas por otros ortopoxvirus, como el virus de la viruela de los camellos, el taterapox virus, el virus de la viruela símica, el virus de la viruela vacuna y el virus variolovacunal (la vacuna utilizada para erradicar la viruela). Igual que en todos los poxvirus, el genoma vírico es ADN bicatenario, con terminales en horquilla y secuencias con repeticiones terminales invertidas. A diferencia de lo que ocurre con la mayoría de los otros poxvirus, las secuencias de virus variólico con repeticiones terminales invertidas no codifican proteínas víricas; en consecuencia, todos los marcos de lectura abiertos del virus variólico están presentes en una sola copia. Se cree que la función de las terminales en horquilla está estrictamente relacionada con la multiplicación genómica y consiste en lograr la síntesis completa de todas las secuencias del ADN vírico durante el ciclo biológico del virus. Por lo tanto, es probable que las terminales en horquilla sean intercambiables entre poxvirus en lo que se refiere a su función. 3. Genómica del virus variólico 41 En la región central del genoma del virus variólico hay grupos de alrededor de 90 genes muy conservados que son ortólogos de genes que se encuentran en los genomas de otros Chordopoxvirus (Gubser et al., 2004). Se cree que estos genes conservados codifican los elementos esenciales para la multiplicación de los poxvirus, la expresión de los genes y la morfogénesis de los viriones. Los genes que codifican los aspectos biológicos singulares del virus variólico, como la virulencia, los determinantes antiinmunitarios y los marcadores de la patogenia, tienden a agruparse más hacia los extremos del genoma. La mayor variación de las secuencias de ADN entre cepas del virus variólico con tasas de letalidad diferentes se encuentra en las regiones del genoma más próximas a las secuencias con repeticiones terminales invertidas (Shchelkunov, Massung y Esposito, et al., 1995; Massung et al., 1996; Shchelkunov et al., 2000; Esposito et al., 2006). Alrededor de 90% de los genes del virus variólico tienen ortólogos claros en los genomas de otros poxvirus, mientras que se pueden encontrar versiones truncadas del resto al menos en otro ortopoxvirus. Desde el punto de vista genético, los dos ortopoxvirus más estrechamente relacionados con el virus variólico, con un 98% de la identidad de los nucleótidos en las 110 kilobases centrales de los genomas, son el virus de la viruela de los camellos y el taterapox virus, agente patógeno de los jerbos. Las distancias genéticas entre el virus variólico y el virus de la viruela símica, el virus de la viruela vacuna y el virus variolovacunal son mucho mayores (Shchelkunov et al., 2001; Gubser et al., 2004; Meyer et al., 2005; Shchelkunov, Marennikova y Moyer, 2005). Entre los 48 aislamientos de virus variólico cuya secuencia se ha determinado y almacenado en bases de datos públicas8, los pares individuales de genomas del virus variólico pueden diferir hasta en 700 polimorfismos de un solo nucleótido y hasta en 90 inserciones y deleciones (indels). Se ha documentado la gama completa de variaciones genómicas del virus variólico, que consiste en más de 1.700 polimorfismos de un solo nucleótido y 4.800 indels. Sin embargo, en general las secuencias son más notables por su gran similitud. Estos aislamientos de secuencia conocida (uno de ellos fue secuenciado dos veces, con un total de 49 registros en la base de datos) figuran al final de este capítulo (cuadro 3.1). Los aislamientos de virus variólico seleccionados para la secuenciación del genoma representan una amplia muestra transversal de cepas archivadas, con lugar de procedencia y propiedades clínicas diferentes. Probablemente se descubran más variaciones genéticas si se secuencia el genoma del resto de los aislamientos de virus variólico archivados. Hay alrededor de 550 aislamientos de ese tipo en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, de Estados Unidos, y en el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, de la Federación de Rusia. Esta información adicional sobre la variación de la secuencia podría ser útil en los estudios de epidemiología molecular más detallados o estudios «forenses» del virus. Sin embargo, es improbable que tal secuenciación adicional sea útil específicamente para la obtención de vacunas o de métodos de diagnóstico. Si las secuencias de las proteínas víricas específicas a las cuales están dirigidos los medicamentos y tratamientos actualmente en desarrollo son más diversas que las contenidas en la base de datos actual, la información adicional sobre las secuencias podría indicar si es posible que haya polimorfismos de 8 42 http://www.poxvirus.org; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 farmacorresistencia en las reservas de virus variólico que todavía no se han secuenciado. Sin embargo, la investigación sobre obtención de medicamentos ha estado dirigida en gran medida a genes víricos que están relativamente bien conservados entre virus variólicos y otros ortopoxvirus, de modo que la información adicional sobre las secuencias probablemente tenga solo una utilidad científica intrínseca moderada. Se ha aprendido más sobre las características biológicas del virus variólico con el estudio de proteínas del virus variólico expresadas individualmente, teniendo en cuenta la información sobre la secuencia del ADN (Dunlop et al., 2003). Por ejemplo, las proteínas codificadas por varios genes del virus variólico, que han sido expresadas o sintetizadas en el laboratorio, interactúan con elementos específicos del sistema inmunitario humano, como el complemento del suero, la interleucina 18, el interferón gamma, el factor de necrosis tumoral, las quimiocinas y diversas vías de señalización celular (Seregin et al., 1996; Rosengard et al., 2002; Esteban, Nuara y Buller, 2004; Kim et al., 2004; Alejo et al., 2006; Gileva et al., 2006; Liszewski et al., 2008; Yadav et al., 2008). Recientemente, a fin de comprender la forma en que varias proteínas diferentes del virus variólico podrían interactuar físicamente con el conjunto completo de proteínas humanas, los investigadores usaron un sistema de doble híbrido en levadura para comparar sistemáticamente todas las proteínas propias del virus variólico que no se encuentran en el virus variolovacunal con las del proteinoma humano completo. Este estudio reveló muchas interacciones nuevas entre las proteínas humanas y las del virus variólico, en particular una nueva familia de inhibidores, encontrada en el virus variólico, de una importante cascada de señales inflamatorias mediada por el factor nuclear kappa B (Mohamed et al., 2009). Es muy probable que en los estudios ulteriores de proteínas del virus variólico expresadas individualmente se lleguen a comprender mejor los procesos fundamentales de señalización de la respuesta inmunitaria innata en las células humanas y se descubran más interacciones con el huésped. 3.2 Evolución de la viruela Todos los poxvirus continúan divergiendo entre sí por medio de mecanismos genéticos entre los cuales se encuentran mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, diversas recombinaciones y la pérdida o adquisición de genes enteros (Smith, Chan y Howard, 1991; Shchelkunov y Totmenin, 1995; McLysaght, Baldi y Gaut, 2003; Gubser et al., 2004; Babkin y Shchelkunov 2008). Los datos conocidos sobre la secuencia del genoma muestran varios grupos diferentes de virus variólicos. Según el método de análisis, estos grupos pueden considerarse como tres clades bien definidos o como dos clades principales, uno de los cuales contiene dos subgrupos (Esposito et al., 2006; Li et al., 2007a). El primer grupo abarca aislamientos de virus variólico mayor provenientes de Asia que están asociados a una mortalidad elevada y aislamientos provenientes de África (especialmente de las regiones oriental, central y meridional) que están asociados a diferentes tasas de mortalidad. El segundo grupo consiste en virus variólico menor (alastrim) de Sudamérica, que presenta tasas de letalidad más bajas. Los aislamientos estrechamente relacionados entre sí del tercer grupo provienen de África occidental y están asociados a una enfermedad de mediana gravedad. Estos estudios de la secuencia proporcionan indicios importantes sobre la propagación de la viruela en todo el mundo y sobre la forma en que el virus variólico mayor y el virus variólico menor estaban comenzando a divergir uno del otro cuando fueron erradicados con la campaña de vacunación de la OMS en 1977. 3. Genómica del virus variólico 43 Según la forma en que se correlacione la información sobre la secuencia con estudios de casos y registros históricos, se calcula que el virus variólico divergió de un poxvirus ancestral, probablemente de roedores en África, en algún momento entre 16 000 y 68 000 años atrás (Li et al., 2007a). Los primeros casos clínicos se notificaron en China y posiblemente en la India. Después, la enfermedad se propagó por la cuenca del Mediterráneo y Europa, y finalmente apareció en el Nuevo Mundo en el siglo XVI. Aunque los registros históricos no contienen una fecha exacta de los primeros brotes de viruela en poblaciones humanas, se ha usado un enfoque analítico de la evolución del virus variólico para calcular el momento de su surgimiento, utilizando casos cuya fecha y lugar de aparición están documentados (Babkin y Shchelkunov 2006; Shchelkunov, 2009). Con este enfoque, se analizó la región conservada central extendida del genoma de los ortopoxvirus (alrededor de 102 kilobases), junto con ocho genes de multisubunidades de la ARN polimerasa de diversos géneros de Poxviridae. Usando las fechas conocidas de la introducción de la viruela de África occidental a América Latina (siglos XVI a XVIII) y los datos sobre las estrechas relaciones filogenéticas entre los aislamientos modernos de virus variólico de África occidental y América Latina, se calculó que la tasa media de acumulación de mutaciones en estos virus de ADN era de 10–6 sustituciones de nucleótidos por sitio al año. Suponiendo que esta tasa se haya mantenido relativamente constante con el tiempo, los ortopoxvirus divergieron de un virus ancestral, convirtiéndose en los géneros reconocidos actualmente, hace por lo menos 130 000 años. Según este cálculo, el virus variólico comenzó a evolucionar de forma independiente hace 3 400 (±800) años, probablemente en la época en que pasó por primera vez de un roedor desconocido a los seres humanos (Babkin y Shchelkunov, 2008). Todavía no se conoce el virus ancestral original del cual evolucionaron los actuales ortopoxvirus. Los mejores indicios señalan que las cepas actuales del virus de la viruela vacuna están más estrechamente relacionados con el virus ancestral original del cual supuestamente derivan los actuales ortopoxvirus, porque el virus de la viruela vacuna contiene el mayor número de genes variables, algunos de los cuales están estrechamente relacionados con ortólogos en el virus variólico (Shchelkunov et al., 1998). También es interesante observar que los genomas de todos los otros ortopoxvirus conocidos, entre ellos el virus variólico, contienen varios genes fragmentados o inactivados en comparación con el genoma del virus de la viruela vacuna, que es más extenso. No se sabe si la primera cepa de virus variólico que apareció en poblaciones humanas fue de virus variólico mayor o menor, pero es evidente que estas cepas estaban apartándose evolutivamente unas de otras cuando se erradicó la viruela (Esposito et al., 2006; Li et al., 2007a). El ritmo de evolución de los poxvirus tiende a ser mucho más lento que el de muchos otros virus, probablemente debido a la gran fidelidad de la enzima ADN‐polimerasa poxvírica que se encarga de copiar la información genética del virus durante el ciclo de multiplicación vírica. En general, los virus de ARN evolucionan con mayor rapidez debido a que la frecuencia de las mutaciones es mucho mayor que la de los virus de ADN o de los organismos eucariotas, y carecen de una actividad de corrección de lectura dependiente de exonucleasas. Sin embargo, como es difícil calcular el ritmo de la deriva genética del virus variólico con el transcurso del tiempo, en la actualidad recurrimos más a las relaciones filogenéticas derivadas de las semejanzas entre secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de virus que fueron aislados en el siglo XX. Todavía no comprendemos bien la forma en que el virus variólico se convirtió en un agente 44 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 patógeno específicamente para los seres humanos. Sus primos genéticos más cercanos (el taterapox virus y el virus de la viruela de los camellos) también tienen una gama pequeña de huéspedes, mientras que los poxvirus con los genomas más extensos (como el virus de la viruela vacuna) tienden a presentar las gamas más amplias de huéspedes naturales. 3.3 Técnicas del genoma del poxvirus Aunque las comparaciones de genomas aportan información importante sobre los productos de genes codificados por poxvirus a los cuales podría atribuirse la virulencia del virus variólico, estos estudios por sí solos no pueden explicar qué es lo que causa la enfermedad. Las técnicas más nuevas de manipulación y síntesis de genes han permitido obtener conocimientos más recientes de las propiedades biológicas del virus variólico y los genes codificados por este virus. Por ejemplo, las pequeñas proteínas de control del complemento del virus variolovacunal y el virus variólico difieren solamente en 11 residuos de aminoácidos, diferencia suficientemente pequeña como para que el gen del virus variolovacunal pueda convertirse en su contraparte del virus variólico mediante mutagénesis específica del emplazamiento (Rosengard et al., 2002). Sin embargo, este método lleva más trabajo que la síntesis química del gen del virus variólico, procedimiento que está al alcance de cualquier laboratorio por un pago moderado. Una ventaja especial de la síntesis de genes es que la secuencia del ADN puede modificarse de la forma que se desee. La modificación más común consiste en optimizar la selección de codones en el gen modificado a fin de aumentar la eficiencia de la expresión de proteínas recombinadas en sistemas de expresión utilizados comúnmente. Una consecuencia imprevista de esta actividad ha sido la creación de clones de ADN que podrían estar fuera del alcance de las normas nacionales relativas a la posesión y manipulación de ADN del virus variólico. Eso se debe a que, aunque estos genes siguen codificando una proteína del virus variólico, desde un punto de vista formal (y probablemente también en el plano jurídico) el ADN ya no es del virus variólico. El costo de la síntesis de genes continúa bajando con rapidez, lo cual refleja las mejoras continuas de la capacidad para formar constructos largos y sin errores (Czar et al., 2009). Según algunos cálculos, el costo está reduciéndose a la mitad y la longitud que puede obtenerse está duplicándose cada dos o tres años. La síntesis de genes se ha usado, por ejemplo, para sintetizar poliovirus infecciosos de novo y revivir la cepa de virus de la gripe pandémica de 1918 (Cello, Paul y Wimmer, 2002; Tumpey et al., 2005). La posibilidad de sintetizar cualquier gen a pedido plantea la preocupación de que cualquiera que domine el arte de la síntesis de ADN pueda reconstruir un ortopoxvirus vivo utilizando los mismos métodos. Eso no sería tan sencillo como lo fue con el poliovirus (que tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo), ya que el ADN desnudo de los poxvirus no es infeccioso y los genomas de ortopoxvirus son alrededor de 25 veces más largos. Sin embargo, ya existen todos los métodos técnicos necesarios para sintetizar un genoma de poxvirus íntegro y usarlo para crear un virus vivo. En 2002 se recuperó virus variolovacunal infeccioso de un genoma vírico completo convertido por clonación en un cromosoma bacteriano artificial (Domi y Moss, 2002). Asimismo, se pudieron ensamblar y reactivar virus variolovacunales usando mezclas de fragmentos de ADN transfectados en células que habían sido infectadas anteriormente por un leporipoxvirus auxiliar (Yao y Evans, 2003). En este último estudio, el ADN consistía en una mezcla de fragmentos obtenida mediante la reacción en cadena de la polimerasa y fragmentos de restricción del virus variolovacunal; sin embargo, aunque 3. Genómica del virus variólico 45 hay varios problemas técnicos que complican estos experimentos (especialmente las mutaciones accidentales), no hay ninguna razón insoslayable para creer que no se puedan usar fragmentos totalmente sintéticos para revivir un virus variólico. El costo de la síntesis de todos los clones necesarios ascendería actualmente a menos de US$ 200 000 y probablemente sea más bajo en el futuro. La síntesis de novo de un virus variólico íntegro no es la única forma en que se podría crear un virus variólico o de un tipo similar. Aunque las OMS recomendaciones de la OMS prohíben la ingeniería genética del virus variólico, no cabe duda de que los numerosos métodos empleados para la modificación genética de poxvirus podrían usarse para modificar la virulencia de cualquier ortopoxvirus, en particular el virus variólico. Por ejemplo, los genomas de ortopoxvirus pueden modificarse fácilmente mediante recombinación homóloga y se pueden introducir fácilmente marcadores de farmacorresistencia en cepas normalmente sensibles a los medicamentos. De manera análoga, con la inserción de genes inmunorreguladores del huésped se puede modificar la virulencia poxvírica o la sensibilidad de la infección a la vacunación anterior. Los virus híbridos también constituyen un peligro y serían mucho más fáciles de ensamblar que el virus variólico salvaje. Hace casi 50 años se comprobó que los ortopoxvirus obtenidos mediante recombinación son viables y que se puede producir un virus recombinado mediante la coinfección de células con virus variólico y virus de la viruela del conejo (una cepa de virus variolovacunal) (Bedson y Dumbell, 1964a) o virus de la viruela vacuna (Bedson y Dumbell, 1964b). No se sabe ni se puede comprobar si estos híbridos de laboratorio serían patógenos para los seres humanos. El virus maligno del conejo, obtenido mediante recombinación de leporipoxvirus inocuos (fibroma de Shope) y virulentos (mixoma), conserva gran parte de la virulencia del virus del mixoma original (Opgenorth et al., 1992). De hecho, en un análisis se señala que la cepa alastrim del virus variólico podría ser un híbrido natural derivado de la recombinación de cepas del virus variólico de África occidental y de Asia (Esposito et al., 2006). No hay ninguna barrera técnica o biológica evidente que impida la sustitución de un gen de ortopoxvirus con otro, la incorporación de un gen exclusivo de ortopoxvirus patógenos en el virus variolovacunal, el reemplazo de partes homólogas de un genoma con segmentos sintéticos copiados de otro virus o la generación de virus híbridos (por ejemplo, un híbrido del virus de la viruela símica y el virus de la viruela de los camellos) con perfiles de virulencia potencialmente nuevos que puedan imitar los del virus variólico. La posibilidad de combinar genes víricos con ortopoxvirus recombinados ciertamente da que pensar, especialmente si los alelos de los genes objetivo causantes de la farmacorresistencia se introdujeran en un virus reconstruido. 3.4 Directrices para los genomas del virus variólico Los adelantos de la tecnología genómica examinados anteriormente requieren una revaluación y actualización de las estrategias actuales de contención del virus variólico, que fueron formuladas en los años ochenta y revisadas posteriormente con frecuencia. La posibilidad de recuperar poxvirus de ADN clonado utilizando métodos de reactivación es el motivo por el cual no se permite que ningún laboratorio (excepto los dos centros colaboradores de la OMS) conserve más de 20% del genoma del virus variólico y toda manipulación de ADN de este virus debe efectuarse en un lugar que esté aislado y alejado del trabajo de almacenamiento o propagación de otros poxvirus. Las medidas de control actuales se centran atinadamente en el control físico y administrativo del acceso a virus vivos o fragmentos clonados del genoma del virus variólico. Ciertamente, siguen 46 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 siendo pertinentes y es necesario mantenerlas, junto con la prohibición de realizar actividades tales como la introducción deliberada de genes del virus variólico en otros poxvirus. Sin embargo, cuando se establecieron estos procedimientos y directrices, nadie preveía que, 25 años después, con los adelantos en la secuenciación del genoma y la síntesis de genes, partes considerables del virus variólico estarían al alcance de cualquiera que tuviera conexión con internet y acceso a un sintetizador de ADN. Ese «cualquiera» podría ser incluso un investigador con buenas intenciones que no conozca la viruela ni comprenda las normas especiales que rigen el acceso a genes del virus variólico. Varios autores han abordado este problema, en particular investigadores que trabajan en el campo de la «biología sintética». En 2007 se describieron muchas de las cuestiones relacionadas con los adelantos en las técnicas de síntesis de ADN y se expuso una propuesta para el manejo de la seguridad biológica (Bügl et al., 2007). Según el leal saber y entender de los autores de este capítulo, ningún Estado Miembro ha adoptado esas propuestas como política oficial. No obstante, algunas de las empresas comerciales que realizan actividades de ese tipo han adoptado las propuestas como principios operativos. Por ejemplo, GENEART, líder del sector en el campo de la síntesis de genes en gran escala, realiza búsquedas con BLAST para filtrar todos los pedidos de servicios que recibe, comparándolos con las listas de agentes patógenos sujetos a fiscalización, entre ellos el virus variólico y el virus de la viruela símica, señalados por el Grupo Australia9. A los clientes que solicitan servicios de síntesis comprendidos en estas listas se les exige que se identifiquen y que proporcionen los documentos necesarios para la importación y la exportación. Los autores de este capítulo recomiendan enfáticamente que las compañías e instituciones que ofrecen servicios de ese tipo se ciñan a las directrices para la vigilancia. Sin embargo, este tipo de vigilancia no abarca a los científicos que sintetizan genes con equipo propio. Valdría la pena examinar la posibilidad de introducir mecanismos físicos en los dispositivos comerciales para la síntesis de genes a fin de evitar tales actividades, de la misma forma en que muchas de las fotocopiadoras de papel que se usan en la actualidad tienen microcircuitos integrados que impiden el fotocopiado de papel moneda. Por último, la tecnología genómica también nos ha ayudado a comprender mucho mejor las relaciones evolutivas entre ortopoxvirus, lo cual tiene implicaciones para la contención de virus estrechamente relacionados con el virus variólico. La mayoría de los aspectos de las políticas actuales de contención del virus fueron formulados en un entorno en el cual la relación genética entre el virus variólico y otros poxvirus zoonóticos (como el virus de la viruela símica) todavía no se conocía con certeza y era motivo de preocupación práctica principalmente para las autoridades sanitarias. Hace mucho tiempo que se reconoce que el virus de la viruela símica es un agente patógeno zoonótico de los seres humanos que merece una atención regulatoria especial. Sin embargo, en la actualidad se sabe que el taterapox virus y el virus de la viruela de los camellos son en realidad los parientes más cercanos del virus variólico, y la genómica 9 http://www.australiagroup.net 3. Genómica del virus variólico 47 permite determinar con precisión las diferencias genéticas. Por ejemplo, el virus variólico (cepa Congo) codifica alrededor de ocho genes que no se encuentran en el virus de la viruela de los camellos, en tanto que este codifica alrededor de 16 genes que no se encuentran en aquel. Hay pocos indicios de que el tipo salvaje del taterapox virus y del virus de la viruela de los camellos constituyan en sí un gran peligro para la salud humana. No obstante, a medida que las investigaciones continúan aportando conocimientos nuevos sobre las funciones de estos genes, en el futuro sería aconsejable examinar las políticas de biocontención e investigación aplicables a los ortopoxvirus estrechamente relacionados con el virus variólico. 48 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 3.1 Secuencias genómicas de cepas del virus variólico en las bases de datos públicas Origen de la muestra Benin Botswana Botswana Región del Congo Región del Congo Etiopía Etiopía Guinea Níger Sudáfrica Sudáfrica Sierra Leona Secuencias conocidas 187 070 185 931 185 931 186 553 186 652 186 648 186 648 186 883 186 942 186 050 185 881 187 014 Secuencias de la región codificante 185 591 184 186 184 126 184 140 184 093 184 152 184 152 185 579 185 707 184 315 184 148 185 763 Supuestos marcos de lectura abiertos 205 203 201 203 200 202 201 204 205 200 202 204 Número de acceso al GenBank DQ441416 DQ441417 DQ441418 DQ437583 DQ441423 DQ441424 DQ441425 DQ441426 DQ441434 DQ441435 DQ441436 DQ441437 3. Genómica del virus variólico 47 Virus variólico BEN68_59 BOT72_143 BOT73_225 CNG70_46 CNG70_227 ETH72_16 ETH72_17 GUI69_005 NIG69_001 SAF65_102 SAF65_103 SLN68_258 Descripción del repositorio V68-59, Dahomey V72-143 V73-225 V70-46 Kinshasa V74-227 Gispen Congo 9 Eth16 R14-1X-72 Addis Eth17 R14-1X-72 Addis V69-005 Guinea Importado de Nigeria 102 Natal, Ingwavuma 103 T'vaal, Nelspruit V68-258 Año de aislamiento 1968 1972 1973 1970 1970 1972 1972 1969 1969 1965 1965 1969 SOM77_ali V77-2479 último caso 1977 Somalia 186 231 184 155 202 DQ437590 SOM77_1252 SOM77_1605 SUD47_jub SUD47_rum TAN65_kem AFG70_vlt4 BSH74_nur BSH74_shz BSH74_sol BSH75_banu CHN48_horn IND53_mad IND53_ndel IND64_vel4 IND64_vel5 IND67_mah V77-1252 V77-1605 Juba (fenotipo alastrim) Rumbec Kembula Variolator-4 Nur Islam Shahzaman Solaiman V75-550 resecuenciación China Horn Sabin lab Kali-Muthu-Madras Nueva Delhi 7124 Vellore 7125 Vellore Vector Maharastra E6 1977 1977 1947 1947 1965 1970 1974 1974 1974 1975 1948 1953 1953 1964 1964 1967 Somalia Somalia Sudán Sudán Tanzaníaa Afganistán Bangladesh Bangladesh Bangladesh Bangladesh China India India India India India 184 191 184 170 186 284 186 415 185 826 185 855 186 293 186 293 186 293 185 976 186 668 186 108 186 662 186 677 186 127 185 578 — — 184 208 — 184 085 184 062 183 534 183 534 183 534 183 562 184 188 184 173 184 178 184 051 184 058 184 151 — — 201 — 198 203 196 197 197 201 204 201 201 205 202 198 DQ441438 DQ441439 DQ441440 DQ441441 DQ441443 DQ437580 DQ441420 DQ441421 DQ441422 DQ437581 DQ437582 DQ441427 DQ441428 DQ437585 DQ437586 NC_001611 48 Cuadro 3.1 Secuencias genómicas de cepas del virus variólico en las bases de datos públicas (continuación) Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Virus variólico JAP46_yam JAP51_hrpr JAP51_stwl KOR47_lee KUW67_1629 NEP73_175 PAK69_lah SUM70_222 SUM70_228 SYR72_119 GER58_hdlg UNK44_harv UNK46_hind UNK47_hig UNK52_but YUG72_164 BRZ66_39 BRZ66_gar a La Descripción del repositorio Yamada MS-2A Tokio Harper Masterseed Stillwell Masterseed Lee Masterseed K1629 V73-175 Rafiq Lahore V70-222 V70-228 V72-119 Heidelberg, de la India Harvey Middlesex Hinden Higgins Staffordshire Butler alastrim Yugoslavia, de Iraq V66-39 alastrim Garcia alastrim actual República Unida de Tanzanía. No se sabe el nombre actual del país. c La actual República Árabe Siria. b Año de aislamiento 1946 1951 1951 1947 1967 1973 1969 1970 1970 1972 1958 1944 1946 1947 1952 1972 1966 1966 Origen de la muestra Japón Japón Japón Coreab Kuwait Nepal Pakistán Sumatra Sumatra Siriac Alemania Reino Unido Reino Unido Reino Unido Reino Unido Yugoslaviab Brasil Brasil Secuencias conocidas 186 662 186 180 186 115 186 383 185 853 185 654 185 865 185 449 185 405 185 853 184 900 185 771 186 096 185 026 188 251 185 851 188 062 186 986 Secuencias de la región codificante 184 178 184 179 184 798 184 102 184 060 183 517 184 072 184 197 184 564 184 060 184 168 184 184 184 093 184 225 185 845 184 058 185 725 185 846 Supuestos marcos de lectura abiertos 203 202 201 203 199 202 203 202 199 203 201 203 198 200 207 201 207 207 Número de acceso al GenBank DQ441429 DQ441430 DQ441431 DQ441432 DQ441433 DQ437588 DQ437589 DQ437591 DQ441442 DQ437592 DQ437584 DQ441444 DQ441445 DQ441446 DQ441447 DQ441448 DQ441419 Y16780 Abreviaturas ADN ácido desoxirribonucleico ARN ácido ribonucleico indels inserciones y deleciones OMS Organización Mundial de la Salud 3. Genómica del virus variólico 51 Referencias Alejo A et al. (2006). A chemokine‐binding domain in the tumor necrosis factor receptor from variola (smallpox) virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:5995–6000. Babkin IV, Shchelkunov SN (2006). [The time scale in poxvirus evolution]. Molekuliarnaia biologiia, 40:20–24. Babkin IV, Shchelkunov SN (2008). [Molecular evolution of poxviruses]. Genetika, 44:1029–1044. Bedson HS, Dumbell KR (1964a). Hybrids derived from the viruses of alastrim and rabbit pox. The Journal of Hygiene, 62:141–146. Bedson HS, Dumbell KR (1964b). Hybrids derived from the viruses of variola major and cowpox. The Journal of Hygiene, 62:147–158. Bügl H et al. (2007). DNA synthesis and biological security. Nature Biotechnology, 25:627–629. Cello J, Paul AV, Wimmer E (2002). Chemical synthesis of poliovirus cDNA: generation of infectious virus in the absence of natural template. Science, 297:1016–1018. Czar MJ et al. 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High‐frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus‐infected cells. Journal of Virology, 77:7281–7290. 54 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 4 Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS Evgeny Stavskiy1, Christine Hughes2 e Inger Damon2 1 Departamento de Investigaciones Genómicas, Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk (Federación de Rusia) 2 División de Poxvirus y Rabia, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta (Estados Unidos de América) Los resultados y las conclusiones contenidos en este informe son de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. 55 Resumen de orientación En este capítulo se resume la situación (a enero de 2010) de las reservas de virus variólico vivo y de ADN (ácido desoxirribonucleico) del virus variólico, así como el uso y la distribución, en los casos en que corresponda, de fragmentos de genes del virus, de acuerdo con las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS). En 1976, en vista del éxito creciente de la campaña para erradicar la viruela, la Unidad de Erradicación de la Viruela, de la OMS, comenzó a tratar de reducir el número de reservas de virus variólico mantenidas en laboratorios. En consecuencia, el número de laboratorios que notificaban sus reservas a la Comisión Mundial para la Certificación de la Erradicación de la Viruela disminuyó de 75 a 7 para diciembre de 1979 y posteriormente a 4 en 1981. Las reservas restantes estaban en la Federación de Rusia, Sudáfrica, el Reino Unido y Estados Unidos. En 1982, las reservas de virus variólico de Porton Down, en el Reino Unido, fueron transferidas a Estados Unidos, a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), situados en Atlanta, Georgia. Las reservas de virus de Sudáfrica, que se conservaban en el Instituto Nacional de Virología, en Sandringham, fueron destruidas en 1983 (aunque Sudáfrica todavía conserva fragmentos clonados no infecciosos de virus variólico). En mayo de 1996, mediante la resolución WHA33.4, la Asamblea Mundial de la Salud refrendó las recomendaciones para la era posterior a la erradicación de la viruela. En la resolución se especificaba que las reservas restantes de virus variólico debían conservarse en un número limitado de sitios. La colección se redujo posteriormente y en la actualidad se limita a dos laboratorios: el Centro Colaborador de la OMS sobre la Viruela y Otras Poxvirosis, que funciona en los CDC, y el Centro Colaborador de la OMS para el Diagnóstico de Ortopoxvirosis y Repositorio de Cepas y ADN del Virus Variólico, que funciona en el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, situado en Koltsovo, en la región de Novosibirsk de la Federación de Rusia. Ambos laboratorios presentan informes anuales a la Secretaría de la OMS sobre el uso de virus variólico vivo y la situación de los repositorios. Desde 2000, estos informes se han presentado también en persona en las reuniones anuales del Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico, que se convocan para examinar el trabajo con virus variólico vivo. En el sitio web de la OMS hay resúmenes de los informes presentados10. 4.1 Introducción En 1976, en vista del éxito creciente de la campaña para erradicar la viruela, la Unidad de Erradicación de la Viruela, de la Organización Mundial de la Salud (OMS), comenzó a tratar de reducir el número de reservas de virus variólico mantenidas en diversos laboratorios. El número de laboratorios que notificaban sus reservas a la Comisión 10 56 http://www.who.int/csr/disease/smallpox/research/en/index.html Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Mundial para la Certificación de la Erradicación de la Viruela disminuyó de 75 en 1976 a 7 para diciembre de 1979 y posteriormente a 4 en 1981. Las reservas restantes estaban en la Federación de Rusia, Sudáfrica, el Reino Unido y Estados Unidos. En 1982, las reservas de virus variólico de Porton Down, en el Reino Unido, fueron transferidas al Centro Colaborador de la OMS sobre la Viruela y Otras Poxvirosis en Estados Unidos, que funciona en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), en Atlanta, Georgia. En 1983 se destruyeron las reservas de virus de Sudáfrica, que se conservaban en el Instituto Nacional de Virología, en Sandringham (aunque Sudáfrica todavía conserva fragmentos clonados no infecciosos de virus variólico). En mayo de 1996, mediante la resolución WHA33.4, la Asamblea Mundial de la Salud refrendó las recomendaciones para la era posterior a la erradicación de la viruela. En las recomendaciones se especificaba que las reservas restantes de virus variólico debían conservarse en un número limitado de sitios. La colección se redujo posteriormente y en la actualidad se limita a dos repositorios: 4.2 • el Centro Colaborador de la OMS sobre la Viruela y Otras Poxvirosis, que funciona en los CDC, en Atlanta, Georgia (Estados Unidos); y • el Centro Colaborador de la OMS para el Diagnóstico de Ortopoxvirosis y Repositorio de Cepas y ADN del Virus Variólico, que funciona en el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, situado en Koltsovo, en la región de Novosibirsk (Federación de Rusia). Situación de los repositorios de cepas del virus variólico y de ácidos nucleicos en el centro colaborador de la OMS en la Federación de Rusia 4.2.1 Situación de la colección de cepas del virus variólico y de su repositorio La colección de virus variólico de la Federación de Rusia se creó a mediados de los años cincuenta en el Instituto Mechnikov de Investigaciones sobre Vacunas y Sueros, en Moscú, y posteriormente fue trasladada al Instituto de Investigaciones sobre Preparaciones Víricas, donde comenzó a funcionar el Centro Colaborador de la OMS para la Viruela e Infecciones conexas en 1967. La colección se usó para estudios de diagnóstico del Programa de Erradicación Mundial de la Viruela durante toda su existencia. Más de la mitad de las 120 cepas y aislamientos de virus variólico de la colección fueron estudiados en detalle por medio de marcadores biológicos clásicos entre 1960 y 1975; los demás fueron identificados como virus variólico en el momento de su aislamiento pero no fueron estudiados de forma detallada. El traslado de la colección de cepas del virus variólico del Instituto de Investigaciones sobre Preparaciones Víricas al Centro VECTOR fue organizado y realizado de conformidad con la orden conjunta 187/123/105/71 del Ministerio de Salud e Industrias Médicas, el Ministerio de Educación y Ciencias, la Comisión Estatal de Vigilancia Sanitaria y Epidemiológica (Goskomsanepidnadzor), todos ellos de la Federación de Rusia, y la Academia Rusa de Ciencias Médicas, expedida el 8 de septiembre de 1994. Dicho traslado fue confirmado por medio de la Declaración conjunta sobre el traslado de la 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 57 colección de virus variólico del Instituto de Investigaciones sobre Preparaciones Víricas, de la Academia Rusa de Ciencias Médicas, al Centro VECTOR, organización sin fines de lucro del Centro Estatal de Investigaciones de la Federación de Rusia, del 27 de septiembre de 1994. De conformidad con el decreto 725–47 del Gobierno de la Federación de Rusia, del 24 de junio de 1996, la colección de microorganismos del Centro VECTOR, incluida la colección de cepas del virus variólico, se incluyó en la lista de colecciones oficiales del país. Esta situación fue confirmada mediante la orden departamental 33 del Ministerio de Salud e Industrias Médicas, del 21 de agosto de 1996. El 19 de junio de 1997 se dejó constancia oficial en la OMS del establecimiento del Centro Colaborador de la OMS para el Diagnóstico de Ortopoxvirosis y Repositorio de Cepas y ADN del Virus Variólico en el Centro VECTOR (carta de la OMS, LTS S2/180/4, LTS S2/286/3, del 19 de junio de 1997). Esta medida, de carácter nacional en la Federación de Rusia, fue tomada de conformidad con la orden 300 del Ministerio de Salud, del 9 de octubre de 1997, y confirmada posteriormente por el Servicio Federal de Rusia para la Vigilancia de la Protección de los Derechos del Consumidor y el Bienestar Humano (Rospotrebnadzor) mediante la disposición 772 del 16 de noviembre 2005. A nivel internacional, el derecho a almacenar la colección de cepas del virus variólico en el Centro VECTOR fue reconocido por la Asamblea Mundial de la Salud mediante la decisión WHA49.10, y confirmado posteriormente en las decisiones WHA52.10, 55.15 y 60.1. La organización de la colección de virus variólico y los experimentos con este virus en el centro colaborador de la OMS se ciñen a los requisitos nacionales e internacionales y a las recomendaciones de la Comisión Mundial para la Certificación de la Erradicación de la Viruela. Se han formulado directrices para la investigación, el mantenimiento y los procedimientos de control, basadas en los documentos antedichos, así como planes de control de epidemias y respuesta a accidentes, y se han establecido equipos de emergencia que están listos para entrar en acción en caso de accidentes y situaciones de emergencia. Entre 1995 y 2009, los expertos de la OMS hicieron seis visitas de inspección al Centro VECTOR a fin de evaluar la seguridad biológica y física del trabajo con el virus variólico. Los expertos confirmaron que las condiciones en que se realizaba dicho trabajo se ceñían a los requisitos internacionales. Los funcionarios a cargo de la colección de virus variólico en el Centro VECTOR fueron nombrados por el Director General del Centro. Cuando se reemplazaron estos funcionarios en el marco de cambios del personal directivo, el traspaso de la responsabilidad por la colección fue efectuado por la comisión a cargo del inventario, con declaraciones de traspaso aprobadas por el Director General. A la fecha de la redacción del presente capítulo en 2010, la colección de virus variólico consistía en 120 cepas (cuadro 4.1) originarias de Asia, África, las Américas, el Mediterráneo Oriental y Europa. 58 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 4.1. Distribución geográfica del origen de las cepas del virus variólico conservadas en el Centro VECTOR Distribución geográfica del aislamiento de las cepas por región de la OMS Asia Sudoriental África Américas Mediterráneo Oriental Europa País donde se aisló la cepaa Bangladesh India Indonesia Nepal Botswana Burundi Congo Etiopía Kenya Rwanda Somalia Sudán Tanzaníab Zairec Brasil Kuwait Omán Pakistán URSSd Reino Unido Total: Número de cepas 3 13 10 8 7 1 6 12 4 6 3 1 8 1 8 3 4 14 7 1 120 OMS = Organización Mundial de la Salud. a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. b La actual República Unida de Tanzanía. c La actual República Democrática del Congo. d La actual Federación de Rusia. En el Centro VECTOR se realizan investigaciones con virus variólico vivo en un edificio separado especializado, de cuatro plantas, con una superficie total de 6 330 m2. El edificio se encuentra en un predio vigilado y el ingreso está controlado las 24 horas por guardias armados, personal de servicio y sistemas de seguridad. La colección de virus variólico está almacenada permanentemente en un repositorio vigilado del edificio, designado específicamente para el trabajo con el virus. El acceso al repositorio es restringido y se rige por instrucciones y normas específicas, de acuerdo con las cuales debe haber dos empleados presentes en todo momento. El repositorio y los congeladores a –70 °C donde está almacenada la colección están vigilados continuamente y dotados de sistemas de alarma apropiados. Los sistemas y el equipo cuentan con la redundancia del caso. Los cultivos de cepas del virus variólico están almacenados de distintas formas: • congelados – en la membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados, – en homogeneizados de membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados, y – en lisados celulares infectados por el virus variólico; 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 59 • liofilizados; y • en escaras de pacientes de viruela. Los tubos herméticos con las cepas congeladas, las ampollas herméticas con cultivos liofilizados y los tubos herméticos con escaras de pacientes de viruela están almacenados en recipientes herméticos de metal guardados en congeladores a –70 °C. Todo el trabajo con virus variólico se realiza en el edificio designado con ese fin, en instalaciones con nivel de bioseguridad 4. En 2009, a fin de aumentar la seguridad de las condiciones de trabajo, se redujo al mínimo el número de frascos de vidrio que contenían cepas del virus variólico y se trasvasó su contenido a criotubos de polipropileno. La colección de la Federación de Rusia consiste en 120 cepas. Se hicieron análisis de la viabilidad de 59 cepas del virus variólico de esta colección y se determinó que 32 eran viables (véase el cuadro 4.2). Se propone analizar la viabilidad de los 61 aislamientos restantes. Se ha almacenado ADN (ácido desoxirribonucleico) completo de 39 de las cepas del cuadro 4.2 (32 viables y 6 no viables) y de una cepa adicional (Ind‐70). El ADN de la cepa Ind‐70 se extrajo de material congelado, sin previa recuperación del virus en la membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados (véase el cuadro 4.3). El virus variólico se aisló de estos cultivos almacenados diluyendo el material en un medio nutriente, preparando diluciones en serie de 1 en 10 y aplicándolas a la membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados de 12 días de edad. Al cabo de tres días de incubación a 34,5 °C (±0,5 °C), se abrieron los huevos de gallina embrionados y se contó el número de lesiones específicas (pústulas) en la membrana corioalantoidea para determinar la actividad (título) del cultivo. No se detectó virus variólico viable después de infectar huevos de gallina embrionados con material preparado a partir de membrana corioalantoidea homogeneizada almacenada en la colección rusa de virus variólico en estado de congelación. Se intentaron pases acumulativos en una monocapa de cultivo celular Vero pero no se detectó virus variólico viable, ni siquiera después de tres pases «ciegos» sucesivos, seguidos de la inoculación de estos homogeneizados de cultivo celular en la membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados. No obstante, se guardó tanto el material inicial de la colección como el material de trabajo para estudios futuros (por ejemplo, con métodos de genética molecular). Los resultados parecen indicar que algunos de los cultivos almacenados en estado de congelación podrían haber perdido su actividad biológica (es decir, su infectividad). Se encontró virus variólico viable en todo el material liofilizado (véase el cuadro 4.2). Estos cultivos se hicieron en una monocapa de cultivo celular Vero, a fin de obtener el material de virus variólico necesario para el trabajo subsiguiente de aislamiento de ADN. Para este procedimiento se usó material de pases anteriores almacenado en la colección, a fin de evitar pases adicionales del virus variólico. 60 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 4.2. Viabilidad de las cepas del virus variólico conservadas en el Centro VECTOR N.o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Cepa del virus variólico M-Аbr-60 Aziz M-Sok-60 M-Sur-60 Semat 12/62 Ind-4а Helder Rw-18 M-N-60 22/62 Mary М-А-60 M-Bl-60 Butler 6–58 Ngami Kuw-5 Ind-3а Congo-2b Congo-9b Taj Barin Wsim Ahmed 13/62 M-Gavr-60 India 378 Khateen India 71 Brasil 128 Brasil 131 Aslam Zaire 1028 Forma de almacenamiento del materiala Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Liofilizado Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Dub-1 Dub-3 Dub-4 Dub-5 Kuw-28 Kuw-29 Indon-1 Indon-2 Indon-3 Indon-4 Indon-5 Indon-6 Indon-7 Indon-8 Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Título (UFP/ml) 1,5 × 106 0,9 × 106 1,2 × 106 2,5 × 106 1,0 × 106 9,6 × 105 1,5 × 107 1,8 × 106 1,3 × 105 8,1 × 104 3,0 × 106 2,0 × 106 1,0 × 103 3,0 × 106 8,0 × 105 7,0 × 105 6,1 × 107 2,9 × 106 7,2 × 107 8,8 × 107 8,7 × 107 5,5 × 105 4,4 × 105 1,3 × 106 9,6 × 105 0,8 × 103c 5–10c 5–10c 5–10c 5–10c 1,5 × 103c Material aislado en el segundo pase en cultivo celular Vero Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 61 N.o 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Cepa del virus variólico Indon-9 Indon-10 Nepal 21 India 164 India 294 Nepal 89 Rais Etiopía 142 Etiopía 182 Abd. Jalil Abid 58 59 Nep-67 Nepal-53 Forma de almacenamiento del materiala Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras Escaras Membrana corioalantoidea congelada Homogeneizado de membrana corioalantoidea Membrana corioalantoidea congelada Membrana corioalantoidea congelada Título (UFP/ml) Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Material no aislado Todo el material, independientemente de la forma de almacenamiento, está guardado en recipientes herméticos a –70 ºC. El cultivo fue preparado en 1996 tras el primer pase del virus aislado de escaras de pacientes por membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados. c La concentración biológica se indica en unidades formadoras de pústulas (UFP) por miligramo. a b A pesar de que todos los aislamientos primarios de pacientes (escaras) estaban almacenados en condiciones equivalentes a –70 °C, se obtuvo virus viable solamente de siete de los 14 aislamientos estudiados. A diferencia de lo que se hizo con el material liofilizado, se efectuaron pases acumulativos de varias cepas en una monocapa de cultivo celular Vero a fin de aislar material de escaras. Se trituraron las escaras después de macerarlas durante 12 horas en 0,5 ml de medio RPMI‐1640 a una temperatura de 4 °C. Con el homogeneizado obtenido de esta forma se infectó la monocapa celular. Las monocapas infectadas se incubaron a 34,5 °C (±0,5 °C) hasta que se observaron signos del efecto citopático característico del virus variólico. Ese efecto por lo general se observó dos días después de la infección. El tercer día, las células fueron extraídas mediante raspado, resuspendidas en una pequeña cantidad de medio, destruidas por congelación y descongelación, suplementadas con una solución de glicerol al 10% y congeladas. Con este procedimiento se obtuvo la cantidad necesaria de material vírico y se aislaron preparaciones de ADN de 27 cepas del virus variólico en cantidad suficiente para realizar una reacción en cadena de la polimerasa larga. Por consiguiente, el almacenamiento de la colección de virus variólico y el trabajo con cepas del virus en el Centro VECTOR se realizaron de conformidad con los requisitos nacionales e internacionales, así como las recomendaciones de la OMS. En resumen, se estudiaron 59 de las 120 cepas del virus variólico almacenadas en el centro colaborador de la OMS a fin de determinar su viabilidad y se observó que 32 cepas eran viables. Todavía no se han hecho estudios de la viabilidad de las 61 cepas restantes. El almacenamiento controlado y el trabajo con la colección de virus aprobado por la OMS se realizan en un edificio diseñado específicamente para el trabajo con virus variólico. 4.2.2 Situación de la colección de ADN del virus variólico y de su repositorio en el Centro VECTOR En el Centro VECTOR se realizan estudios de la organización estructural y funcional de genomas de ortopoxvirus desde 1991. En 1992 concluyó el trabajo de secuenciación del 62 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 genoma completo (sin contar las horquillas terminales) de la cepa del virus variólico India‐1967, que es muy virulenta. Con este primer mapa genético completo del virus variólico se hizo un análisis exhaustivo de la estructura del genoma. Entre 1993 y 1995, el Centro VECTOR, en colaboración con los CDC, secuenció el genoma de la cepa Garcia‐ 1966 del virus variólico, que es poco virulenta. Desde 2001 se está trabajando en el aislamiento de ADN del genoma del virus variólico utilizando la colección de cepas del virus variólico. En los últimos años se creó en el Centro VECTOR una colección de 39 preparaciones de ADN de distintas cepas del virus variólico. En 1986, en la cuarta reunión del Comité Especial de la OMS sobre Ortopoxvirosis, se decidió eliminar todas las colecciones de cepas del virus variólico y de ADN de su genoma. Sin embargo, era necesario conservar el material genético de distintos aislamientos de virus variólico en una forma fiable y biológicamente segura porque es muy importante para investigaciones futuras. Actualmente, el repositorio de ADN del virus variólico abarca tres tipos de colecciones: • ADN del genoma del virus variólico; • colecciones de amplicones (cada una de las cuales corresponde a una cepa diferente del virus variólico y tiene un código corto con un número de serie); y • colecciones de plásmidos recombinados (a cada una de las cuales se le asigna un código con un número de serie). La unidad de contabilización que se usa en el repositorio internacional de ADN del virus variólico del Centro VECTOR es un microvial de plástico con etiqueta. El repositorio está en un edificio vigilado, designado para el trabajo con virus variólico, con guardia y equipado con un sistema de alarma y de monitoreo automático de la temperatura. En este repositorio se guardan 5438 viales, entre ellos: • 197 viales de ADN del genoma completo del virus variólico (de 39 cepas diferentes) en forma de solución, almacenados a +4 °C; • Un total de 1446 viales con 17 colecciones de amplicones con fragmentos de ADN del virus variólico, almacenados a –70 °C; cada colección contiene amplicones con fragmentos genómicos de una sola cepa del virus variólico, en tres juegos repetidos: • – el primer juego en forma de precipitado de alcohol; – el segundo juego en forma de precipitado de alcohol; y – el tercer juego en forma de solución en mezcla obtenida mediante RCP larga; Un total de 3795 viales con 16 colecciones de plásmidos recombinados con ADN de fragmentos de virus variólico, almacenados a –70 °C; cada colección contiene plásmidos recombinados con fragmentos del genoma de una sola cepa del virus variólico, en tres juegos repetidos: – el primer juego en forma de solución en tampón Tris‐EDTA (ТЕ); – el segundo juego en forma de precipitado de alcohol; y – el tercer juego en forma de precipitado de alcohol. No se han transferido fragmentos de ADN del virus variólico a ninguna organización externa. 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 63 Aislamiento de ADN del virus variólico en cultivos celulares Las preparaciones de ADN completo del virus variólico se almacenan a +4 °C en el repositorio del Centro VECTOR en microviales de plástico con etiqueta. Actualmente, hay preparaciones de ADN de 39 cepas del virus variólico de distintas regiones geográficas, almacenadas en 197 viales, como se señala en el cuadro 4.3. Cuadro 4.3. Inventario de ADN completo del virus variólico N.o Cepa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Brasil 128 Brasil 131 Congo-2 Congo-9 Butler Ind-4a Ind-3a Ind-70 India 164 India 71 India 378 Indon-3 Indon-9 Kuw-29 Kuw-5 Nepal 89 6–58 Wsim Ahmed Rais Khateen Taj Barin Aslam Aziz Rw-18 Mary 13/62 Helder 22/62 12/62 Semat Ngami M-Gavr-60 M-Bl-60 M-Sok-60 M-Abr-60 M-N-60 M-Sur-60 M-A-60 Zaire 1028 Distribución por región de la OMS AMR AMR AFR AFR EUR SEAR SEAR SEAR SEAR SEAR SEAR SEAR SEAR EMR EMR SEAR EMR EMR EMR EMR EMR EMR EMR AFR AFR AFR AFR AFR AFR AFR AFR EUR EUR EUR EUR EUR EUR EUR AFR País de origen de la cepaa Brasil Brasil Congo Congo Gran Bretañab India India India India India India Indonesia Indonesia Kuwait Kuwait Nepal Pakistán Pakistán Pakistán Pakistán Pakistán Pakistán Pakistán Rwanda Tanzaníac Tanzaníac Tanzaníac Tanzaníac Tanzaníac Tanzaníac Tanzaníac URSSd URSSd URSSd URSSd URSSd URSSd URSSd Zairee Año de aislamiento No se sabe No se sabe 1970 1970 1952 1967 1967 1975 1975 1975 1975 1971 1971 1967 1967 No se sabe 1958 1970 1970 1970 1970 1970 1970 1970 1962 1962 1962 1962 1962 1962 1962 1960 1960 1960 1960 1960 1960 1960 No se sabe AFR = Región de África; AMR = Región de las Américas; EMR = Región del Mediterráneo Oriental; EUR = Región de Europa; SEAR = Región de Asia Sudoriental. 64 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. actual Reino Unido. c La actual República Unida de Tanzanía. d La actual Federación de Rusia. e La actual República Democrática del Congo. b El Conservación de material genético de distintas cepas del virus variólico de la colección de la Federación de Rusia Repositorio de las colecciones de amplicones de ADN del virus variólico Con el método de RCP larga se pudo crear el repositorio de amplicones de genomas completos del virus variólico y la colección de plásmidos híbridos que tienen fragmentos de ADN del virus variólico, con la finalidad de conservar material genético del virus. Las secuencias del genoma del virus variólico que figuran en el cuadro 4.3 pueden almacenarse durante mucho tiempo en una forma biológicamente segura. Eso posibilita el estudio de la organización genética de las cepas del virus variólico y la obtención de métodos modernos de diagnóstico rápido de infecciones por el virus variólico y otros ortopoxvirus. Las colecciones certificadas de amplicones de ADN del virus variólico consisten actualmente en preparaciones de 17 cepas (véase el cuadro 4.4). Los datos sobre el número de viales que integran las colecciones de amplicones de ADN del virus variólico se resumen en el cuadro 4.5. No se ha estudiado la degradación del ADN en las colecciones de amplicones. Cuadro 4.4. ADN del virus variólico utilizado para crear colecciones de amplicones Región de la OMS donde se aisló la cepa AFR AFR AFR AFR AFR AFR AMR País donde se aisló la cepaa Cepa Año de aislamiento Número en la colección del repositorio Tipo epidemiológico del virus Rwanda Tanzaníab Tanzaníab Tanzaníab Tanzaníab Tanzaníab Brasil Rw-18 13/62 12/62 Helder Mary Ngami Brasil 131 1970 1962 1962 1962 1962 1962 No se sabe MA 13 MA 9 MA 10 MA 12 MA 15 MA 16 MA 6 EMR EMR EMR EMR EUR EUR EUR EUR EUR SEAR Pakistán Pakistán Pakistán Pakistán URSSc URSSc URSSc URSSc URSSc India Aziz 6–58 Taj Barin Wsim Ahmed M-A-60 M-Abr-60 M-Bl-60 M-Gavr-60 M-N-60 India 71 1970 1958 1970 1970 1960 1960 1960 1960 1960 1975 MA 8 MA 11 MA 14 MA 17 MA 1 MA 2 MA 3 MA 4 MA 5 MA 7 Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor AFR = Región de África; AMR = Región de las Américas; EMR = Región del Mediterráneo Oriental; EUR = Región de Europa; SEAR = Región de Asia Sudoriental. a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. b La actual República Unida de Tanzanía. c La actual Federación de Rusia. 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 65 Creación de genotecas de ADN del genoma completo de cepas del virus variólico Una de las desventajas de mantener información genética en forma de colección de amplicones es la posibilidad de degradación de productos de la RCP larga como consecuencia del almacenamiento prolongado y la imposibilidad de mantener una colección completa de amplicones ante la falta de ADN del genoma del virus variólico. Para resolver estos problemas, la información genética puede almacenarse en forma de colecciones de plásmidos recombinados que contienen fragmentos de ADN del virus variólico, que en este documento se denominan «genotecas». Se propuso un sistema que consiste en la escisión de amplicones mediante RCP larga por ciertas endonucleasas de restricción y la clonación subsiguiente de fragmentos resultantes de ADN en Escherichia coli en vectores plasmídicos. Eso permitiría crear genotecas de ADN del virus variólico con las cuales se podría construir de manera fácil y rápida la cantidad necesaria de cualquier tipo de plásmidos. El uso de cepas de E. coli con un sistema de reparación defectuoso reduce al mínimo la acumulación de errores durante la multiplicación del ADN. Aunque este método lleva más trabajo que los métodos convencionales, permitiría almacenar fragmentos de ADN del virus variólico de manera segura y fiable durante períodos prolongados. De esta forma, las secuencias del genoma del virus podrían almacenarse en forma de plásmidos recombinados en una forma biológicamente segura durante un período indefinido. Asimismo, como se explicó anteriormente, eso posibilitaría la investigación de la organización genética de las cepas del virus variólico y la obtención de métodos modernos de diagnóstico rápido de infecciones por el virus variólico. Tales plásmidos también podrían servir de fuente de genes del virus. Actualmente, las colecciones certificadas de plásmidos que contienen fragmentos de ADN consisten en 16 cepas del virus variólico (véase el cuadro 4.6). Los datos sobre el número de viales de las colecciones se resumen en el cuadro 4.5. Cuadro 4.5. Inventario de cepas del virus variólico cuyo ADN se usó para la conservación de material genético Cepa País donde se aisló la cepaa Año de aislamiento Tipo epidemiológico del virus Congo-2 Región de la OMS donde se aisló la cepa AFR Congo 1970 Variólico mayor Rw-18 AFR Rwanda 1970 Variólico mayor 84 AFR Tanzaníab 1962 Variólico mayor 84 AFR Tanzaníab 1962 Variólico mayor 84 Helder AFR Tanzaníab 1962 Variólico mayor 84 Mary AFR Tanzaníab 1962 Variólico mayor 99 Ngami AFR Tanzaníab 1962 Variólico mayor 87 Brasil 128 AMR Brasil No se sabe Brasil 131 AMR Brasil No se sabe Garcia-1966 AMR Brasil 1966 6–58 EMR Pakistán 1958 Variólico menor (alastrim) Variólico menor (alastrim) Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Aziz EMR Pakistán 1970 Variólico mayor 84 Taj Barin EMR Pakistán 1970 Variólico mayor 84 12/62 13/62 66 Número de viales en el repositorio de amplicones Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Número de viales en el repositorio de genotecas 261 288 273 231 285 84 45 84 282 288 Cepa Región de la OMS donde se aisló la cepa EMR País donde se aisló la cepaa Año de aislamiento Tipo epidemiológico del virus Pakistán 1970 Variólico mayor EUR Gran Bretañac 1952 EUR URSSd 1960 Variólico menor (alastrim) Variólico mayor 84 M-Abr-60 EUR URSSd 1960 Variólico mayor 84 M-Bl-60 EUR URSSd 1960 Variólico mayor 84 288 M-Gavr-60 EUR URSSd 1960 Variólico mayor 84 276 EUR URSSd 1960 Variólico mayor M-N-60 EUR URSSd 1960 Variólico mayor Ind-3a SEAR India 1967 Variólico mayor India 71 SEAR India 1975 Variólico mayor India-1967 SEAR India 1967 Variólico mayor Wsim Ahmed Butler M-A-60 M-Sur-60 Número de viales en el repositorio de amplicones 84 Número de viales en el repositorio de genotecas 213 213 246 279 84 222 84 105 AFR = Región de África; AMR = Región de las Américas; EMR = Región del Mediterráneo Oriental; EUR = Región de Europa; SEAR = Región de Asia Sudoriental. a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. b La actual República Unida de Tanzanía. c El actual Reino Unido. d La actual Federación de Rusia. Cuadro 4.6. Lista del ADN del virus variólico utilizado para crear el repositorio de plásmidos recombinados Región de la OMS donde se aisló el virus variólico AFR AFR AFR AFR AMR País donde se aisló el virus variólicoa Cepa del virus variólico Año de aislamiento Número en la colección del repositorio Tipo epidemiológico del virus Tanzaníab Congo Rwanda Tanzaníab Brasil Ngami Congo-2 Rw-18 13/62 Brasil 128 P1 P7 P 11 P 16 P4 AMR Brasil Garsia - 1966 1962 1970 1970 1962 No se ha determinado 1966 EMR EMR EMR EUR Pakistán Pakistán Pakistán Gran Bretañac Taj Barin Wsim Ahmed 6-58 Butler 1970 1970 1958 1952 P3 P6 P 13 P8 EUR EUR EUR EUR SEAR SEAR URSSd URSSd URSSd URSSd India India M-Sur-60 M-Bl-60 M-A-60 M-Gavr-60 Ind-3a India - 1967 1960 1960 1960 1960 1967 1967 P2 P 12 P 14 P 15 P5 P9 Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico menor (alastrim) Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor P 10 AFR = Región de África; AMR = Región de las Américas; EMR = Región del Mediterráneo Oriental; EUR = Región de Europa; SEAR = Región de Asia Sudoriental. 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 67 Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. La actual República Unida de Tanzanía. c El actual Reino Unido. d La actual Federación de Rusia. a b Como resultado de este trabajo se creó un repositorio que contiene lo siguiente: • preparaciones de ADN del genoma de 39 cepas del virus variólico; • colecciones de amplicones de ADN de 17 cepas del virus variólico; y • colecciones de plásmidos que contienen fragmentos de ADN del genoma completo de 16 cepas del virus variólico de la colección de la Federación de Rusia, de dos tipos epidemiológicos, aisladas en regiones diferentes. Los autores de este capítulo creen que cada una de las colecciones de plásmidos y amplicones debería representar como mínimo seis cepas del virus variólico de distintos subtipos biológicos (seis cepas de virus variólico mayor, seis de virus variólico menor y seis de virus variólico menor alastrim, que en total son 18 cepas) a fin de lograr la representatividad y la cobertura de la biodiversidad del virus. También sería razonable tener muestras del ADN original, completo o parcial, de todas las cepas del virus variólico de la colección, que podrían conservarse sin peligro en un banco de material genético del virus. Eso se justifica porque los repositorios de la Federación de Rusia y de Estados Unidos comprenden cultivos naturales de virus variólico cuyos análogos sintéticos probablemente no puedan reproducir plenamente la gama completa de propiedades de los virus que no han sido sometidos anteriormente a experimentación. Se colocaron colecciones certificadas en el Repositorio Internacional de ADN del Virus Variólico del Centro VECTOR, el cual realiza un inventario anual de cepas del virus y de ADN y lo presenta a la OMS en un formato acordado con la Organización. El Centro también presenta informes anuales a la OMS en calidad de centro colaborador, con secciones sobre el trabajo con las colecciones de cepas del virus variólico y de ADN. En todo el trabajo con las colecciones de cepas y ADN se usan los siguientes métodos: 4.3 • presentación regular de propuestas al Subcomité Científico del Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico a fin de recibir autorización para trabajar con las colecciones; • realización del trabajo aprobado por el Subcomité; • presentación verbal del informe anual sobre el trabajo realizado en la reunión anual del Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico; y • presentación a la Secretaría de la OMS de un informe anual escrito sobre dicho trabajo. Situación de los repositorios de cepas del virus variólico y de ácidos nucleicos en el centro colaborador de la OMS en Estados Unidos El repositorio del centro colaborador de la OMS en Estados Unidos, en los CDC, contiene colecciones de virus variólico de laboratorios de Japón, los Países Bajos, el Reino Unido y la División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos (USAMRIID), así como colecciones que antes conservaban los 68 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 CDC y American Type Culture Collection. Se mantienen muestras de inventario de 451 aislamientos o muestras en su forma original, en lugares seguros. Se cree que todo el material se obtuvo dentro de los 50 años precedentes a la erradicación de la viruela. El inventario consiste principalmente en aislamientos de pacientes humanos y réplicas de muestras de cepas de referencia del virus variólico. Sin embargo, el repositorio contiene también algunos virus «híbridos» obtenidos experimentalmente por recombinación del virus de la viruela vacuna o el virus de la viruela del conejo con el virus variólico, así como material donado por laboratorios externos que no contiene virus variólico, incluidas muestras de inmunoglobulina de virus variolovacunal. En 2000 se generó una base de datos electrónica para vincular datos tales como el año y el lugar donde se descubrió el aislamiento de virus variólico, información clínica y epidemiológica sobre el paciente, y el brote del cual se obtuvo el aislamiento. En la base de datos también se vinculan datos sobre el historial de pases de la muestra con el nombre que figura en la etiqueta del recipiente de la muestra, a fin de orientar la selección de diversos aislamientos con objeto de estudiarlos mejor. Esa información se obtiene de las siguientes fuentes: • • un examen de – los documentos escritos proporcionados con las muestras, – los informes presentados anteriormente a la OMS sobre la situación del material, – los archivos de la OMS en Ginebra, y – publicaciones; pedidos de información del laboratorio del país donante. Se llegó a disponer de información sobre unas 360 muestras de material variólico no idéntico derivado de las diversas colecciones originales. Se logró vincular 142 muestras con el país y el año de aislamiento, y se incluyó el historial de pases del material; se vincularon 8 muestras con el país y el año de aislamiento (pero no se incluyó el historial de pases del material proporcionado); y en el caso de 163 muestras no se logró vincularlas con el país o el año de aislamiento. Este último material incluía 19 escaras primarias de pacientes y tres reservas de variolizadores. Desde el año 2000, con la aprobación del Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico, se realizó un análisis del genoma completo de un subconjunto del material conservado en el repositorio de los CDC. Se seleccionaron 46 aislamientos a fin de secuenciar el genoma. Entre ellos se encontraban muestras obtenidas de los mismos brotes o de brotes vinculados epidemiológicamente, además de brotes que no parecían estar vinculados (Esposito et al., 2006; Li et al., 2007). Se secuenciaron estas muestras en particular porque se consideraba que representaban la principal fuente de diversidad vírica (reflejada en el país y el año de aislamiento y en el reducido historial de pases) en la colección de los CDC. Entre el material secuenciado se encontraban aislamientos de casos descritos desde el punto de vista clínico o epidemiológico como «viruela mayor» o «viruela menor» y descritos desde el punto de vista biológico o epidemiológico como alastrim. La mayor parte del material cuya secuencia se determinó provenía de aislamientos descritos como virus variólico mayor. La variabilidad genética de estos aislamientos estaba correlacionada con la ubicación geográfica del aislamiento y 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 69 no presentaba una correlación temporal. Por ejemplo, las muestras aisladas con un intervalo de 30 años en el Cuerno de África estaban agrupadas con los aislamientos que no provenían de África occidental. Se secuenciaron dos de los virus híbridos a fin de evaluar la capacidad de la RCP larga y el polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción para identificar eventos de recombinación. Posteriormente se hizo la caracterización biológica complementaria de los aislamientos de virus variólico (Olson et al., 2009) a fin de proporcionar información genética y biológica pertinente para el análisis científico y la evaluación de posibles tratamientos o medidas de prevención de la infección por el virus variólico. Las reservas de virus variólico de los CDC que no se apartan más de un pase de la cepa madre de secuencia conocida son las que se han usado desde el año 2000 en las propuestas aprobadas por la OMS de investigaciones esenciales en el campo de la salud pública con virus variólico vivo. Cuadro 4.7. Distribución geográfica del origen de las cepas del virus variólico conservadas en los CDC Región geográfica donde se aisló la cepa África Asia América del Norte América del Sur 70 País donde se aisló la cepaa Botswana África central (país no especificado) Dahomeyb Djibouti Etiopía Gabón Ghana Guinea Kenya Malí Níger Nigeria Sierra Leona Somalia Sudáfrica Sudán Tanzanía Togo Uganda Alto Voltac África occidental (país no especificado) Zaired Bangladesh China India Indonesia Japón Coreae Nepal Estados Unidos Brasil Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Número de cepas 6 2 2 1 11 1 2 1 12 3 2 5 4 7 9 2 10 2 2 1 1 9 20 4 25 12 3 3 5 1 15 Región geográfica donde se aisló la cepa Europa Oriente Medio País donde se aisló la cepaa Alemania Países Bajos Italia Reino Unido Yugoslaviae Irán Kuwait Pakistán Siriaf No se sabe Total Número de cepas 1 2 1 30 1 3 3 12 1 214 451 Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. El actual Benin. c La actual Burkina Faso. d La actual República Democrática del Congo. e No se sabe el nombre actual del país. f La actual República Árabe Siria. a b Una parte pequeña del material contenido en el repositorio se ha usado para experimentación. El cuadro 4.8 contiene una lista de las cepas del virus variólico que se han utilizado en estudios y que, por consiguiente, se han multiplicado en cultivos tisulares. La mayor parte del material que fue sometido a pruebas era viable, aunque con algunas cepas fue necesario efectuar pases «ciegos» para rescatar virus variólico viable. Antes de 2000, en la mayor parte del trabajo experimental se habían usado cuatro cepas, que habían sido propagadas a fin de mantenerlas como cultivos de reserva, como reservas de trabajo y para la producción de ácido nucleico para la evaluación de medicamentos antivíricos y el trabajo de secuenciación. De 2000 a 2010, la cantidad almacenada de cultivos de reserva, material de trabajo y material recogido de placas (expresada en número de «tubos») aumentó en un factor de 22. Estos materiales se han usado o se están usando para la evaluación de medicamentos antivíricos in vitro, pruebas de provocación en animales, estudios comparativos de la eficacia in vitro de vacunas y secuenciación. Asimismo, hay 4209 muestras almacenadas de seis pruebas de provocación de animales con virus variólico cuya finalidad era evaluar la eficacia de medicamentos antivíricos. Estas muestras se conservarán hasta que se hayan abordado de manera satisfactoria todas las preguntas e inquietudes pertinentes de los organismos regulatorios (por ejemplo, la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos). El 46% de ese aumento de los cultivos de reserva, el material de trabajo y el material recogido de placas se debe a la creación de alícuotas desechables para la evaluación de medicamentos antivíricos o estudios de la eficacia de vacunas. Estas alícuotas desechables de bajo título permiten lograr una mayor uniformidad entre experimentos y limitan los ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento de virus. El acceso a este material está limitado a un grupo de empleados de los CDC que han recibido capacitación apropiada en medidas de bioseguridad y bioprotección. El acceso al repositorio está más restringido aún. Se hace un inventario anual del material y, una vez concluido, se coloca un sello de seguridad en las cajas. 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 71 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 71 Cuadro 4.8. Selección de los cultivos de trabajo de los CDC: identificación del material variólico viable Aislamiento Minnesota 124 Cepa Yamada MS-2(A) Tokyo Kim E-316 (2), cepa madre Hinden Harvey Lee, cepa madre Juba Rumbec Higgins Horn (Sabin Lab) Harper, cepa madre Stillwell, cepa madre BUT (Butler) Kali-Muthu M 50 Laboratorio original USAMRIID USAMRIID Fecha de aislamiento 5 de febrero de 1939 1946 USAMRIID 1946 Coreab Asia Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido USAMRIID 1946 Reino Unido Europa Historial de pases originales 123 CAM (Nelson), Deterick 1 CAM = 124 CAM (26 de marzo de 1958) 2 CAM (Hahon), Detrick 2 CAM = 4 CAM (3 de nov. de 1958) 2 CAM (Kempe), Detrick 1 CAM = 3 CAM (18 de febrero de 1958) E2 1946 Reino Unido, importado Coreab Europa E1 Asia 1947 Paísa Estados Unidos Región América del Norte Japón Asia Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido USAMRIID 7 de octubre de 1947 1947 Sudán África 2 CAM (Kempe), Detrick 2 CAM = 4 CAM (15 de septiembre de 1958) E8 Sudán África E7 5 de abril de 1947 Antes de 1948 Staffordshire, Reino Unido China Europa No se sabe Asia USAMRIID Antes de 1951 Japón Asia USAMRIID Antes de 1951 Japón Asia 2 (?) CAM (Shabel), Detrick 2 CAM = 4 CAM (4 de junio de 1959) 3 CAM (Hahon) , 2 CAM Detrick = 5 CAM (25 de julio de 1958) 6CAM (Hahon) Porton Down, Reino Unido USAMRIID 1952 Reino Unido Europa E8 5 de sept. de 1953 India Asia #2228 material original en la costra homogeneizada de Locke del 13 de enero de 1958 Situación actual Cultivo de reserva (E124;BSC40p2) Cultivo de reserva (E4;BSC40p2) No es viable Cultivo de reserva (E2;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1; BSC40p2) Cultivo de reserva (E4;BSC40p2) Cultivo de reserva (E8;BSC40p2) Cultivo de reserva (E7;BSC40p2) Cultivo de reserva (?;BSC40p2) Cultivo de reserva (E4;BSC40p2) Cultivo de reserva (E5;BSC40p2) Cultivo de reserva (E6, BSC40p2) Cultivo de reserva (E8;BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p3) 72 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 4.8. Selección de los cultivos de trabajo de los CDC: identificación del material variólico viable (continuación) Aislamiento Nueva Delhi Nigeria – Kudano 696 Madrás DJB 7125 7124 102 103 Kembula Garcia, Brasil (menor) Laboratorio original USAMRIID Fecha de aislamiento 1953 Paísa India Región Asia Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido CDC Junio de 1961 Nigeria 1963 v66–39 CDC K1629 Porton Down, Reino Unido CDC V68–59 Rafiq Lahore Porton Down, Reino Unido CDC V68–258 África Historial de pases originales 2 CAM (Kempe), Detrick 3 CAM= 5 CAM (23 de junio de 1959) Costra Situación actual Cultivo de reserva (E5;BSC40p2) No es viable India Asia Costra No es viable 1964 India Asia E4 1964 India Asia E4 12 de abril de 1965 14 de abril de 1965 Sept. de 1965 Sudáfrica África E1 Sudáfrica África E1 Tanzaníac África Costra 1966 Brasil América del Sur E3 1.00E-01 Cultivo de reserva (E4; BSC40p2) Cultivo de reserva (E4; BSC40p2) Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1, BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p2) Cultivo de trabajo (E3;BSC40p3) 5 de junio de 1966 6 de mayo de 1967 10 de abril de 1968 3 de marzo de 1969 2 de enero de 1969 Brasil América del Sur Kuwait Oriente Medio E1 de S Silva/J Noble, aislamiento de exantema obtenido el cuarto día E5 Dahomeyd África E1 Pakistán Asia Costra Sierra Leona África E4 1.00E-01 Cultivo de reserva (E1; BSC40p2) Cultivo de reserva (E5;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p3) Cultivo de reserva (E4;BSC40p2) 4. Situación de los repositorios de virus variólico y de ácidos nucleicos en los centros colaboradores de la OMS 73 Cuadro 4.8. Selección de los cultivos de trabajo de los CDC: identificación del material variólico viable (continuación) Aislamiento Congo V70–46 Laboratorio original CDC Fecha de aislamiento 12 de marzo de 1970 Variolizador afgano 4 Porton Down, Reino Unido V70–222 CDC V70–228 CDC V72–119 CDC V72–143 CDC Eth16 R14–1X-72 Eth17 R14–1X-72 V73–225 Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido CDC V73–175 CDC Nur Islam Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido Porton Down, Reino Unido CDC Shahzaman Solaiman BSH V75–550 ‘Bangladesh’ País Región Historial de pases originales Situación actual Zairee África E1 1.00E-01 Cultivo de trabajo (E1;BSC40p3) 18 de marzo de 1970 Afganistán Oriente Medio Costra Cultivo de reserva (BSC40p2) 17 de octubre de 1970 26 de octubre de 1970 6 de abril de 1972 26 de abril de 1972 29 de agosto de 1972 29 de agosto de 1972 8 de octubre de 1973 26 de julio de 1973 1974 Indonesia Asia E1 1.00E-01 Indonesia Asia E1 1.00E-01 Siriaf Oriente Medio E1 1.00E-01 Botswana África E1 1.00E-01 Etiopía África Costra Etiopía África Costra Botswana África E1 1.00E-01 Nepal Asia E1 1.00E-01 Bangladesh Asia Costra 1974 Bangladesh Asia Costra 1974 Bangladesh Asia Costra 24 de nov. de 1975 Bangladesh Asia E1 1.00E-01 Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1; BSC40p2) Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (E4; BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p3) Cultivo de reserva (BSC40p3) Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1; BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p2) Cultivo de reserva (BSC40p3) Cultivo de reserva (BSC40p2) Cultivo de trabajo (BSC40p6) 74 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Cuadro 4.8. Selección de los cultivos de trabajo de los CDC: identificación del material variólico viable (continuación) Aislamiento V77–1252 Laboratorio original CDC V77–1605 CDC V77–2479 (Ali Maow Maalin) ‘Somalia’ AR1, recombinación de alastrim y viruela de los conejos VC13, recombinación de virus variólico y de la viruela vacuna Heidelberg CDC Congo 9 (Gispen) V74–227 India septentrional, cepa madre Irán 2602 Fecha de aislamiento 19 de mayo de 1977 9 de agosto de 1977 10 de nov. de 1977 País Región Historial de pases originales Situación actual Somalia África E1 1.00E-01 Somalia África E1 1.00E-01 Somalia África E2 1.00E-02 Cultivo de reserva (E1, BSC40p2) Cultivo de reserva (E1; BSC40p2) Cultivo de trabajo (E2; BSC40p3) Porton Down, Reino Unido Datos publicados en 1964 Cepa de laboratorio N/C No se sabe Extractos de ácido nucleico Porton Down, Reino Unido Datos publicados en 1964 Cepa de laboratorio N/C No se sabe Extractos de ácido nucleico USAMRIID No se sabe Alemania Europa CDC 1974 Zairee África Detrick aislamiento de costra, 1 cultivo CAM, 24 de mayo de 1960 E1 1.00E-01 Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) Cultivo de reserva (E1;BSC40p2) USAMRIID No se sabe India septentrional Asia 30 CAM (Nelson), Detrick 3 CAM = 33 CAM (14 de julio de 1958) No es viable Porton Down, Reino Unido No se sabe Irán Oriente Medio E5 Cultivo de reserva (E5;BSC40p2) CAM = membrana corioalantoidea; CDC = Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, Georgia; N/C = no corresponde; USAMRIID = División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos. a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. b No se sabe el nombre actual del país. c La actual República Unida de Tanzanía. d El actual Benin. e La actual República Democrática del Congo. f La actual República Árabe Siria. Actualmente, los CDC mantienen ácido nucleico de virus variólico representativo de los genomas cuya secuencia se ha determinado y de algunos otros virus. El material, que se describe en los cuadros 4.9 y 4.10, se conserva en forma de material genómico completo y en un subconjunto de colecciones de plásmidos o amplicones obtenidos mediante RCP. Se hace referencia a este material en una base de datos segura, protegida con contraseña, y el acceso al material está restringido a unos pocos participantes en el programa. Se conservan plásmidos o amplicones obtenidos mediante RCP larga que representan nueve de las cepas de secuencia conocida de la colección del centro colaborador de la OMS en Estados Unidos. Cabe señalar que los 47 virus de secuencia conocida de la colección se han usado para validar diagnósticos basados en el ácido nucleico. Posiblemente sea necesario producir fragmentos del genoma adicionales basados en plásmidos u obtenidos por RCP larga o por otros métodos que representen los genomas en preparación para la destrucción de las reservas de virus variólico y ADN genómico íntegro. Al buscar las mejores formas de conservar este material, se deberían considerar las tasas de mutación introducidas por las estrategias de RCP, la estabilidad de los distintos métodos de conservación del genoma y el trabajo que requiera cada uno. Cuadro 4.9. Inventario del ADN completo del virus variólico almacenado en los CDC N.o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Cepa 102 103 66–39 68–59 68–258 69–1 69–5 70–222 70–228 7124 7125 72–119 72–143 72–164 73–175 73–225 74–227 77–1252 77–1605 Variolizador afgano 4 AR1 Ashiq Aslam BSH Bombay Brasil Garcia Butler Congo V70–46 Djib ETH 16 Región África África América del Sur África África África África Asia Asia Asia Asia Oriente Medio África Europa Asia África África África África Oriente Medio N/C Oriente Medio Oriente Medio Asia Asia América del Sur Europa África África África País de origena Natal, Ingwavuma, Sudáfrica Transvaal, Nelspruit, Sudáfrica Brasil Dahomeyb Sierra Leona Níger Guinea Indonesia Indonesia India India Siriac Botswana Yugoslaviad Nepal Botswana Zairee Somalia Somalia Afganistán Cepa de laboratorio Pakistán Pakistán Bangladesh India Brasil Reino Unido Zairee Djibouti Etiopía Año de aislamiento 1965 1965 1966 1968 1969 1969 1969 1970 1970 1964 1964 1972 1972 1972 1973 1973 1974 1977 1977 1970 Publicado en 1964 1969 1969 1975 1958 1966 1952 1970 1971 1972 N.o 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 Cepa ETH 17 Farid Harper Harvey Heidelberg Higgins Hinden Horn Irán 2602 Juba Kembula K1629 Kali Mathu A. Mannan Minnesota 124 Misba M.S. Lee Nueva Delhi Nigeria Kudano Nur Islam Parker Parvin Rafiq Lahore Ramjan Rafiq Shahzaman Solomain Somalia Stillwell VC13 Yamada Región África Oriente Medio Asia Europa Europa Europa Europa Asia Oriente Medio África África Oriente Medio Asia Asia América del Norte Oriente Medio Asia Asia África Asia Europa Asia Oriente Medio Oriente Medio Oriente Medio Asia Asia África Asia N/C Asia País de origena Etiopía Pakistán Japón Reino Unido Alemania Reino Unido Reino Unido China Irán Sudán Tanzaníaf Kuwait India Bangladesh Estados Unidos Pakistán Coread India Nigeria Bangladesh Reino Unido Bangladesh Pakistán Pakistán Pakistán Bangladesh Bangladesh Somalia Japón Cepa de laboratorio Japón Año de aislamiento 1972 1969 1951 1946 No se sabe 1947 1947 Antes de 1948 No se sabe 1947 1965 1967 1953 1974 1939 1970 1947 1953 1961 1974 1978 1974 1969 1970 1969 1974 1974 1977 1951 Publicado en 1964 1946 N/C = no corresponde. a Los nombres de los países son los que se usaban en el momento en que se aisló la cepa. b El actual Benin. c La actual República Árabe Siria. d No se sabe el nombre actual del país. e La actual República Democrática del Congo. f La actual República Unida de Tanzanía. Cuadro 4.10. Lista de los CDC de cepas del virus variólico utilizadas para crear colecciones de amplicones y plásmidos Región geográfica donde se aisló la cepa Asia Europa África País donde se aisló la cepa Cepa Año de aislamiento Tipo epidemiológico Tipo de colección Número de viales Bangladesh Reino Unido BSH Butler 1974 1952 Plásmidos Plásmidos 250 110 República Democrática del Congo Congo 1970 Variólico mayor Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Plásmidos 180 Región geográfica donde se aisló la cepa América del Sur País donde se aisló la cepa Cepa Año de aislamiento Tipo epidemiológico Tipo de colección Número de viales Brasil 1966 135 Reino Unido China India Nepal Somalia Variólico menor (alastrim) Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Variólico mayor Plásmidos Europa Asia Asia Asia África Brasil Garcia Harvey Horn 7124 73–175 Somalia Plásmidos Amplicones Amplicones Amplicones Plásmidos 100 48 134 127 100 1946 pre-1948 1964 1973 1977 Los CDC han proporcionado fragmentos de virus variólico a varios investigadores externos, como se señala en el cuadro 4.11, utilizando protocolos aprobados por la OMS y los CDC (Departamento de Salud y Servicios Sociales de Estados Unidos) para la distribución de ácido nucleico de virus variólico y siguiendo las recomendaciones de la OMS con respecto a su uso11. Cuadro 4.11. Fragmentos de virus variólico proporcionados a investigadores externos Institución y país Aprobación de la OMS Cepa Gen o genes Fecha del pedido Ejecutado plenamente Enviado RAP94 RPO147 20 de enero de 2008 15 de mayo de 2008 n.d. G1R 24 de abril de 2007 10 de junio de 2008 24 de junio 2008 Universidad Cornell, Estados Unidos Sí Universidad de Florida, Estados Unidos Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos Universidad de California, Estados Unidos Sí BSH75 Horn Heidelberg V73–175 102 Nur Islam Shahzaman Solaiman Bangladesh Sí Bangladesh D9R 12 de julio de 2006 n.d. 30 de enero de 2008 Sí Bangladesh D1L E7L A27L A39L B2L B3L B4L B9R B10R B14R B19R B20R B22R 3 de agosto de 2006 Octubre de 2006 23 de octubre de 2006 11 http://www.who.int/csr/disease/smallpox/research/en/index.html Institución y país Aprobación de la OMS Cepa NIH, Estados Unidos Instituto Cantonal de Microbiología, Suiza Sí Sí Bangladesh USAMRIID, Estados Unidos Sí Bangladesh Garcia Universidad de Pensilvania, Estados Unidos Sí Bangladesh Myriad Genetics, Inc., Estados Unidos Sí Bangladesh Centro Nacional de Biotecnología, España Sí Bangladesh Finlandia Sí Bangladesh AFIP, Washington, DC, Estados Unidos Sí Bangladesh USAMRIID, Estados Unidos Sí Bangladesh Bangladesh Garcia Gen o genes Fecha del pedido Ejecutado plenamente Enviado A24R 20 de abril de 2005 29 de abril de 2005 16 de agosto de 2005 1 de junio de 2006 n.d. 2 de agosto de 2004 1 de junio 2006 Agosto de 2006 26 de enero de 2005 n.d. n.d. 8 de diciembre de 2004 Junio de 2006 23 de octubre de 2006 23 de julio de 2003 22 de sept. de 2004 20 de julio de 2006 7 de sep. de 2001 n.d. n.d. Noviembre de 2001 19 de febrero de 2002 n.d. 8 de enero de 2002 22 de febrero de 2002 n.d. Enero de 2005 Junio de 2006 Agosto de 2006 J9R B10R B11R M1R B6R A36R A31L A31L A18L A36R B6R F8L I3L M1R C13L B8L C18L A27L A39L B4L B9R B11R:B10R B12R:B11R B14L B22R:B19R C13L:B20R B22R G3R:G1R, G2R B8R B17R D7L G2R G3R A44L P1L D4R D15L A41L D12R B7R L2R B8R G2R J7R E9L L6R A25R D8L-D10L D16L-D18L C7L M1R I5R F8L A14L A26L-A28L A34R 26 de julio de 2006 Institución y país Aprobación de la OMS Cepa Gen o genes A36R-A37R A40R A47-A48L J6R-J7R B3L B9L-B10L B19L-B20L B22R G1R G3R-G4R B6R L2R B8R G2R J7R E9L L6R A25R A31L D4R C9L A46R J7R B6R Fecha del pedido Ejecutado plenamente Enviado Noviembre de 2001 Enero de 2002 n.d. Instituto del Cáncer DanaFarber, Facultad de Medicina Harvard, Estados Unidos Universidad Estatal de San José, Estados Unidos AFIP, Estados Unidos Sí Bangladesh Sí Bangladesh A41-A44 15 de agosto de 1996 Agosto de 1997 n.d. Sí Bangladesh Enero de 1999 Febrero de 1999 n.d. DSTL, Porton Down, Reino Unido Sí V74–227 (Congo) Solaiman Butler Octubre de 2001 n.d. 29 de abril de 2003 Facultad de Medicina de Harvard, Estados Unidos INSERM, Francia Sí Bangladesh J7R E9L G1R P1L (homólogo de BSH) C3L (homólogo de BSH) A14L (homólogo de BSH) A36R A38R B6R B17R Gen TK Enero de 2003 n.d. 8 de mayo de 2003 Sí Bangladesh Abril de 2003 Agosto de 2004 27 de agosto de 2004 Sí Bangladesh Garcia Julio de 2003 Octubre de 2003 Febrero de 2004 CRSSA Emile Pardé, Francia Fragmento Sacl Fragmento BstEll D A31L K9R C9L E9L Universidad de Sí Bangladesh Mayo de Mayo de 24 de agosto Alberta, Canadá 2004 2004 de 2004 23 laboratorios Sí Bangladesh 2 <500 insertos de n.d. n.d. n.d. nucleótidos de Estados Unidos AFIP = Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas; DSTL = Laboratorio de Ciencias y Tecnología de Defensa; INSERM = Instituto Nacional de Salud e Investigaciones Médicas; n.d. = no disponible; NIH = Institutos Nacionales de Salud; USAMRIID = División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos. Se presentaron informes escritos oficiales a la OMS sobre los repositorios, su uso y su situación en junio de 1997 (sobre el uso de 1979 a 1997) y en 1998. A partir de 1999, estos informes se han presentado regularmente en forma resumida, en bases de datos electrónicas, y anualmente en la reunión ad hoc de la OMS sobre ortopoxvirus (1999) y posteriormente en las reuniones anuales del Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico (2000–2008). Los informes resumidos más recientes están disponibles en el sitio web de la OMS12. Todo el trabajo con virus variólico vivo en los CDC se realiza en instalaciones con nivel de bioseguridad 4 que son inspeccionadas regularmente por autoridades locales y federales (del Programa de Agentes Especiales y Productos Tóxicos, del Departamento de Salud y Servicios Sociales, a nivel federal), así como por autoridades internacionales (OMS), a fin de velar por la aplicación de las normas más estrictas de bioseguridad y bioprotección. Abreviaturas ADN ácido desoxirribonucleico CDC Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades OMS Organización Mundial de la Salud 12 http://www.who.int/csr/disease/smallpox/research/en/index.html Referencias Esposito JJ et al. (2006). Genome sequence diversity and clues to the evolution of variola (smallpox) virus. Science, 313:807–812. Li Y et al. (2007). On the origin of smallpox: correlating variola phylogenics with historical smallpox records. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104:15787–15792. Olson VA et al. (2009). Smallpox virus plaque phenotypes: genetic, geographical and case fatality relationships. The Journal of General Virology, 90:792–798. 5 M o d e l o s a n i m a l e s y pa t o g e n i a Peter B Jahrling1 1 Centro de Investigaciones Integradas, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Frederick (Estados Unidos de América) 83 Resumen de orientación Importancia para la salud pública La posibilidad de que el virus variólico se use como arma bioterrorista es clara. Además, con el resurgimiento de la viruela símica como motivo de preocupación en el ámbito de la salud pública en la República Democrática del Congo, se ha vuelto más urgente mejorar las medidas para combatirla, como las vacunas y los medicamentos antivíricos, para estos ortopoxvirus. Como en general se reconoce que se necesitarán modelos animales para demostrar la eficacia de estas medidas, este capítulo se centra en modelos animales útiles para las enfermedades causadas por ortopoxvirus. Progreso realizado hasta la fecha Los modelos en animales pequeños infectados con el virus de la ectromelia (que causa la viruela murina), el virus de la viruela vacuna, el virus de la viruela del conejo o el virus variolovacunal han permitido comprender mejor la patogenia y las características inmunológicas de las poxvirosis y, de esa forma, diseñar estudios cruciales en los que se utilizan primates. Los modelos en primates infectados con virus variólico o virus de la viruela símica son los más pertinentes para adoptar medidas seguras y eficaces contra la viruela en los seres humanos. Retos actuales Diversas combinaciones de dosis de virus variólico y vías de exposición en primates (macacos de Java) causan una afección previsible que reproduce algunas características de la viruela humana, pero no todas. Aunque es necesario perfeccionar los modelos, han sido suficientes para demostrar la eficacia de varios medicamentos antivíricos experimentales, entre ellos el cidofovir y el ST‐246. Es probable que ninguna combinación de condiciones resulte en un modelo que se ciña simultáneamente a todos los criterios establecidos en las normas de la Administración de Alimentos y Medicamentos, de Estados Unidos, relativas a las pruebas con animales (US 21CRF310.610). Posiblemente se requieran modelos diferentes para evaluar distintas indicaciones. A fin de mejorar los modelos en primates, podrían utilizarse datos de estudios fisiopatológicos en los que se haya usado telemetría e imaginología médica. También se debería prestar especial atención a la búsqueda de características de biomarcadores que puedan usarse en un medio clínico para desencadenar una intervención temprana, aumentando de esa forma la probabilidad de éxito de la intervención y facilitando la autorización de medidas contra la enfermedad. Aunque gran parte de este trabajo de desarrollo puede realizarse con ortopoxvirus sustitutos en roedores y primates, la única forma de aumentar la confianza en las medidas contra el virus variólico es realizar pruebas de eficacia con modelos en primates utilizando este virus. 5.1 Introducción A pesar de que se ha erradicado la viruela, el virus variólico sigue siendo motivo de preocupación en el ámbito de la salud pública debido a la posibilidad de que haya reservas clandestinas en manos de bioterroristas (Henderson et al., 1999). El impacto de un ataque con virus variólico en la población humana en la actualidad sería incluso más catastrófico que en el siglo pasado, ya que los programas de vacunación se acabaron en 84 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 todo el mundo en 1976, aproximadamente, las poblaciones inmunodeprimidas son más prevalentes y la movilidad creciente de la gente (incluidos los viajes aéreos intercontinentales) ha acelerado el ritmo de propagación de virus en todo el mundo. Por estas razones, se están realizando inversiones considerables en la mejora de las medidas contra la viruela, entre ellas nuevas vacunas y medicamentos antivíricos (LeDuc y Jahrling, 2001). La obtención y autorización de medidas de ese tipo dependerá de la demostración de su eficacia protectora en modelos animales. Estos modelos deberían asemejarse fielmente a la enfermedad humana y, en condiciones ideales, usar el agente causal real (el virus variólico) en vez de un sustituto. Aunque gran parte de este trabajo de desarrollo puede realizarse con ortopoxvirus sustitutos en roedores y primates, la única forma de aumentar la confianza en las medidas contra el virus variólico es realizar pruebas de eficacia con modelos en primates utilizando este virus. 5.2 Modelos animales El hecho de que el virus variólico infecta de forma natural solamente a los seres humanos frustra la obtención de modelos animales de la viruela humana. Se puede infectar experimentalmente a diversos animales de laboratorio con este virus, pero esta infección no produce una enfermedad general letal (Fenner et al., 1988), excepto en estudios recientes con monos (Jahrling et al., 2004). Sería conveniente mejorar el modelo del virus variólico en primates, en particular la vía de exposición aerógena (USFDA, 2009). En este capítulo se abordan modelos animales de enfermedades causadas por ortopoxvirus que prometen ser útiles para la adopción de medidas contra la viruela. Los modelos en primates con virus variólico o de la viruela símica son los más pertinentes con este fin y también podrían facilitar la comprensión de las características fisiopatológicas de la viruela en los seres humanos. Sin embargo, los estudios con primates son costosos y para usar virus variólico se necesita el nivel más alto de bioseguridad (nivel 4) y bioprotección. El virus se encuentra solamente en los dos centros colaboradores pertinentes de la Organización Mundial de la Salud (OMS): los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), en Atlanta (Estados Unidos), y el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, en la Federación de Rusia. Aunque el uso del virus de la viruela símica está menos restringido, así se requieren medidas de biocontención de nivel de bioseguridad 3. Además, es un agente especial (US Department of Health and Human Services, 2005), lo cual significa que su uso está restringido. Debido a estas restricciones, es procedente usar modelos en animales pequeños de enfermedades causadas por ortopoxvirus, utilizando virus de la ectromelia, de la viruela vacuna, de la viruela del conejo o variolovacunal, a fin de comprender y adoptar medidas contra los agentes patógenos de los seres humanos. En los modelos animales de enfermedades causadas por ortopoxvirus se debe abordar el equilibrio crucial entre la interacción vírica directa con las células afectadas del huésped y la respuesta inmunitaria protectora. Los poxvirus, más que la mayoría de los demás virus patógenos, expresan diversas proteínas inmunomoduladoras e inhibidores de la apoptosis, lo cual puede inclinar la balanza a favor de la virulencia. Algunas de estas interacciones entre el virus y el huésped son específicas de especies determinadas y es posible que no se presten a generalizaciones fiables en modelos en otras especies. 5. Modelos animales y patogenia 85 Gran parte de lo que se sabe sobre la patogenia del virus variólico se ha inferido de estudios con el virus de la ectromelia en ratones (Buller y Palumbo, 1991). El virus de la ectromelia es un agente patógeno natural de los ratones y, después de su descubrimiento en los años treinta, Fenner usó el modelo para dilucidar el concepto de viremia primaria y secundaria, que es análoga a la afección exantemática en los seres humanos (Fenner, 1948). En los años setenta, se usaron modelos del virus de la ectromelia en ratones para demostrar la función de los linfocitos T y los macrófagos en la inmunidad celular y la recuperación de una enfermedad aguda. En los años ochenta se usaron estirpes de ratones consanguíneos infectados por el virus de la ectromelia a fin de identificar los determinantes genéticos de la resistencia y la susceptibilidad (Buller, 1985; Buller y Palumbo, 1991). En fecha más reciente, la disponibilidad de varias estirpes genéticamente deficientes de ratones consanguíneos ha facilitado la investigación de las relaciones entre el virus y el huésped. Una descripción detallada de las características inmunobiológicas de las ortopoxvirosis rebasa el alcance de este capítulo. La susceptibilidad al virus de la ectromelia está determinada genéticamente, y las características genéticas son complejas. La estirpe de ratones C57BL/6 es relativamente resistente: la dosis letal mediana (DL50) es más de 106 unidades formadoras de placas (UFP) mediante inoculación en la almohadilla plantar. En cambio, la DL50 para la estirpe de ratones A/J es de menos de 0,01 UFP (Buller, 1985). La resistencia genética está relacionada en parte con la vía de exocitosis de los gránulos de los linfocitos T efectores (Müllbacher et al., 1999). Los ratones de las estirpes BALB/c y DBA/2 son, igual que los ratones A/J, muy susceptibles tanto por vía cutánea como por aerosol. La resistencia y la susceptibilidad pueden variar también según la cepa del virus de la ectromelia. Las infecciones de ratones susceptibles por el virus de la ectromelia se inician por medio de abrasiones cutáneas. El virus se multiplica localmente y después migra a las vísceras por medio de los vasos linfáticos aferentes, los ganglios linfáticos de drenaje y la corriente sanguínea (viremia primaria). El virus se multiplica en las vísceras principales, especialmente el hígado y el bazo, produciendo viremia secundaria en un plazo de 4 o 5 días. Según la estirpe de ratones, la multiplicación en la piel puede causar exantema apenas 6 días después de la exposición. En los ratones A/J, la muerte se produce antes del exantema, como consecuencia de una necrosis hepática grave. La exposición por aerosol lleva a una neumonía primaria grave. Hace poco se usó el modelo con el virus de la ectromelia en la estirpe de ratones A/J para evaluar la eficacia de diversos análogos del medicamento antivírico contra la infección letal (Buller et al., 2004). En este estudio, el octadeciloxietilo derivado del cidofovir, administrado por vía oral, protegió al 100% de los ratones que recibieron una dosis letal de 2,3 × 104 UFP en aerosol y bloqueó completamente la multiplicación vírica en el bazo y el hígado. En las mismas condiciones, el cidofovir sin modificaciones fue ineficaz. El virus variolovacunal también infecta a los ratones; el desenlace depende de las características genéticas del ratón, las cepas del virus variolovacunal, las dosis y las vías de exposición. La infección de ratones C57BL/6 por la cepa de virus variolovacunal Western Reserve (WR) por vía intranasal con dosis superiores a 104 UFP es letal (Brandt y Jacobs, 2001). Este modelo se usó para demostrar que el gen E3L del virus variolovacunal, que causa la resistencia in vitro al interferón, debe estar presente para 86 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 que el animal sano enferme. Los ratones BALB/c son un poco más resistentes al virus variolovacunal, aunque no se ha informado sobre estudios comparativos directos. En los ratones BALB/c, la letalidad depende de la dosis: en un estudio, una dosis de 107 UFP de virus variolovacunal de la cepa WR fue 100% letal, mientras que una dosis de 104 UFP mató al 20% de los ratones (Alcami y Smith, 1992). También se usaron ratones BALB/c para clasificar las cepas del virus variolovacunal según su virulencia. La cepa del Departamento de Salud Pública de la Ciudad de Nueva York (NYCBH), a una DL50 por vía intranasal de 104,0 UFP, fue más virulenta que la cepa WR a una DL50 de 104,8 UFP. Ninguna de las dos cepas fue letal administrada por medio de escarificación de la cola o por vía subcutánea u oral (Lee et al., 1992). El virus variolovacunal derivado de la vacuna Wyeth fue menos virulento con la exposición intranasal (DL50 >107 UFP). Se han usado ratones lampiños SKH‐1 para provocar infecciones cutáneas por el virus variolovacunal. El número de lesiones cutáneas indica la gravedad de la infección sistémica. Este modelo se ha usado para demostrar la eficacia de la aplicación tópica de cidofovir al 5% para reducir las lesiones cutáneas y la carga vírica en los pulmones, los riñones y el bazo (Quenelle, Collins y Kern, 2004). La infección intranasal de ratones BALB/c con virus variolovacunal WR causa neumonía, pérdida de peso y la muerte. La administración de cidofovir (100 mg/kg por vía intraperitoneal) a partir del primer día después de la provocación intranasal protegió a todos los ratones tratados; en cambio, todos los testigos que recibieron placebo murieron dentro de los 8 días siguientes a la exposición. El cidofovir mejoró notablemente los puntajes de consolidación pulmonar y redujo la carga vírica en el hígado, el bazo y el encéfalo; los títulos máximos fueron entre 30 y 1000 veces menores que en los testigos que recibieron placebo (Smee, Bailey y Sidwell, 2001). Se han hecho estudios similares con la cepa Brighton Red del virus de la viruela vacuna, que es letal para los ratones BALB/c en ciertas condiciones (Bray et al., 2000). Las características de la enfermedad y de la letalidad tras la exposición intranasal o por aerosol varían según la edad y el peso de los ratones: 100% de los ratones de 4 semanas de edad infectados con 2 × 106 UFP murieron, con una media del tiempo hasta la muerte de 8 días, mientras que solo 50% de los ratones de 7 semanas de edad sucumbieron. Los ratones infectados murieron de neumonía intersticial vírica bilateral, con una carga vírica de más de 109 UFP/g en los pulmones. Este modelo se ha usado a fin de poner a prueba la eficacia de diversos tratamientos para proteger contra la enfermedad general. Los ratones tratados con una sola dosis de cidofovir administrada por vía intraperitoneal (100 mg/kg) quedaron protegidos en un 100% contra la exposición intranasal (2–5 × 106 UFP) cuando se administró el medicamento 4 días antes y hasta 4 días después de de la exposición. Cinco días o más después de la exposición, el cidofovir fue menos eficaz (Robbins et al., 2005). En cambio, la inmunoglobulina de virus variolovacunal fue totalmente ineficaz para reducir la mortalidad. El interferón‐α administrado dos veces al día (5 × 107 U/kg) fue eficaz antes de la provocación y un día después, pero no más tarde. Cuando se vacunó a los ratones mediante escarificación de la cola, quedaron protegidos cuando el procedimiento se realizó 8 días antes de la provocación; la vacunación fue menos eficaz cuando se redujo ese intervalo y fue ineficaz cuando se inició 2 días después de la provocación. Esta observación no concuerda con los datos epidemiológicos que indican que la vacuna es eficaz hasta 4 días después de la exposición en los seres humanos. La diferencia podría indicar que la dosis de provocación es más elevada en el 5. Modelos animales y patogenia 87 modelo animal y muestra el peligro de extrapolar a los seres humanos los resultados obtenidos con modelos en roedores. Aunque los modelos en ratones pueden aportar conocimientos importantes sobre la virulencia y la respuesta inmunitaria protectora, las interacciones entre el virus y el huésped deben evaluarse individualmente y no se pueden generalizar (Müllbacher et al., 2004). Por ejemplo, el virus de la ectromelia y el virus variolovacunal difieren en cuanto a la necesidad de interferón‐γ tras la infección. En los ratones infectados por el virus de la ectromelia, la transferencia de esplenocitos inmunes de ratones genéticamente deficientes en interferón‐γ es sumamente eficaz para reducir el título del virus en el hígado y el bazo; en un experimento análogo, los esplenocitos inmunes al virus variolovacunal no resultaron eficaces (Müllbacher y Blanden, 2004). Por consiguiente, a pesar de la similitud de estos dos modelos de ortopoxvirosis, la recuperación implica respuestas inmunitarias diversas y un tanto imprevisibles en el huésped. Las funciones citolíticas de los linfocitos T pueden ser beneficiosas, perjudiciales o neutrales (Müllbacher et al., 2004), y este equilibrio es diferente en cada sistema virus–huésped. Este tipo de dificultad es una consideración importante al estudiar agentes patógenos especializados, como los ortopoxvirus, fuera de sus huéspedes naturales. Los conejos expuestos por aerosol al virus de la viruela del conejo presentan un síndrome similar al de los seres humanos con viruela (Lancaster et al., 1966; Westwood et al., 1966). En estos estudios, la cepa Utrecht del virus de la viruela del conejo era un poco más virulenta que la cepa del Instituto Rockefeller y produjo una infección letal en conejos blancos de Nueva Zelandia, que murieron entre 7 y 12 días después de la exposición. En dosis más altas, el curso de la enfermedad fue más fulminante, pero con poco más de una partícula de virus bastó para causar infección. Los conejos generalmente permanecieron sanos durante un período de incubación de 4 a 6 días, seguido de fiebre, debilidad, pérdida rápida de peso y exudado ocular y nasal purulento profuso. Les salió un eritema de color fuerte en los labios y en la lengua, que coincidió con un exantema generalizado caracterizado por lesiones cuyo número iba de unas pocas a una confluencia de lesiones. Algunos murieron antes de que apareciera el exantema. Las lesiones comenzaron en forma de pápulas rojas, que se convirtieron en seudopústulas con contenido caseoso. Por lo general sobrevino la muerte, presagiada por una rápida caída de la temperatura corporal, antes que pudieran formarse escaras propiamente dichas. Se detectaron cargas elevadas del virus de la viruela del conejo en todos los tejidos viscerales, que alcanzaron el nivel máximo entre los días 5 y 8, con títulos de 108 UFP/g en los pulmones y 107 UFP/g en el bazo y en las glándulas suprarrenales. En algunos casos, la muerte temprana de los conejos se correlacionó con un defecto de la coagulación sanguínea (Boulter, Maber y Bowen, 1961), análogo a la forma hemorrágica de la viruela humana (Martin, 2002). También hay indicios de que los conejos infectados se volvieron más contagiosos solo en las etapas tardías de la enfermedad, a pesar de la presencia de virus en el exudado nasofaríngeo en las primeras etapas, tal como ocurre en la viruela humana. En estudios más recientes, la inoculación intradérmica de conejos produjo una enfermedad con características similares (Adams, Rice y Moyer, 2007). Una dosis vírica de 1 × 102 UFP administrada por vía intracutánea causa una infección general, pero la dosis debe ser mayor (5 × 103 UFP) para que sea letal. Al principio, el punto de inyección se hincha, y 5 días después de la infección se produce necrosis. La fiebre comienza el día 3, seguida de un aumento de la frecuencia respiratoria para el día 4. A más tardar el día 7 88 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 aparecen lesiones secundarias, incluso exudado ocular y nasal, acompañadas de pérdida de peso. Poco antes de la muerte, la frecuencia respiratoria disminuye y la frecuencia cardíaca aumenta. Para el día 7 u 8, el animal presenta dificultad respiratoria. La infección del conejo por el virus de la viruela del conejo presenta semejanzas con la viruela humana. La falta de reactivos y de estirpes de conejos consanguíneos obstaculiza el análisis complejo de estos fenómenos inmunitarios, razón por la cual se prefieren los estudios con modelos en ratones. Sin embargo, en la actualidad los genes que determinan la virulencia pueden evaluarse mediante la manipulación genética del virus de la viruela del conejo y pruebas de esas cepas modificadas en conejos (McFadden, 2005a). Asimismo, se podría perfeccionar el modelo de la infección por el virus en el conejo a fin de usarlo para someter a prueba tratamientos y vacunas experimentales contra la viruela humana, lo cual serviría de punto de partida para priorizar las pruebas de estos agentes en los modelos conocidos en primates. Es importante distinguir entre el virus de la viruela del conejo, que es una cepa de virus variolovacunal del género Ortopoxvirus, y el virus del mixoma, que es de un género diferente (Lepovipoxvirus). Aunque el virus del mixoma produce una enfermedad letal en conejos blancos de Nueva Zelandia que presenta muchas semejanzas con la enfermedad causada por el virus de la viruela del conejo, es un pariente más distante de los agentes patógenos de los seres humanos y, por consiguiente, menos pertinente para la viruela humana que los modelos animales de ortopoxvirus que se examinan en este capítulo. El virus de la viruela símica es un agente patógeno importante de los seres humanos que produce muchos de los signos y síntomas de la viruela, aunque no se transmite con tanta facilidad de una persona a otra (Fine et al., 1988; Jezek et al., 1988). Hay indicios de que las cepas originarias de África occidental son menos virulentas que las que surgen de forma esporádica en África central, concretamente en la República Democrática del Congo (McFadden, 2005b). El nombre «viruela símica» tal vez sea erróneo, ya que los reservorios naturales de este virus son roedores, como las ardillas (Khodakevich, Jezek y Kinzanzka, 1986; Charatan, 2003). En 2003 se importó accidentalmente virus de la viruela símica a Estados Unidos en un envío de roedores procedente de la República de Ghana que incluía una rata gigante gambiana infectada (Perkins, 2003; Ligon, 2004). Esa rata infectó a varios perritos llaneros (Cynomys) que estaban en el mismo local y de esa forma se desencadenó una transmisión que afectó a cientos de perritos llaneros y produjo más de 75 casos en seres humanos en 11 estados. Este brote de viruela símica reactivó el interés en el virus, no solo como sustituto de la viruela sino también como enfermedad en sí. Según se informó, la infección experimental de ardillas terrestres con la cepa Estados Unidos del virus de la viruela símica mató, en un plazo de 6 a 9 días, a todas las ardillas expuestas a 105,1 UFP por vía intraperitoneal o a 106,1 UFP por vía intranasal (Tesh et al., 2004). Se notificaron infecciones generalizadas con una carga vírica elevada. Entre los principales signos histológicos cabe señalar necrosis centrolobulillar del hígado, necrosis esplénica e inflamación intersticial en los pulmones. Con la infección de las ardillas por el virus de la viruela símica se podría obtener un modelo animal útil para poner a prueba medidas contra la viruela símica y la viruela. Los perritos llaneros afectados por el brote de viruela símica en Estados Unidos presentaban consolidación pulmonar, adenomegalia y placas multifocales en la pared del tubo digestivo (Langohr et al., 2004). Se han 5. Modelos animales y patogenia 89 notificado avances recientes en la obtención de modelos de viruela símica humana en perritos llaneros (Knight, 2003; Hutson et al., 2009) y en otros roedores, entre ellos el lirón africano (Graphiurus sp.) (Schultz et al., 2009). La disponibilidad comercial de estirpes de ratones ha ampliado las opciones para poner a prueba distintas medidas contra las virosis mencionadas. Recientemente se informó que los ratones C57BL/6 deficientes en STAT1 eran susceptibles a dosis bajas de virus de la viruela símica administradas por vía intranasal, y estos ratones fueron útiles para demostrar la eficacia de dos medicamentos antivíricos (CMX001 o HDP‐cidofovir y ST‐ 246) administrados el día de la infección (Stabenow et al., 2010). En fecha más reciente aun, se comprobó que la estirpe de ratones consanguíneos CAST/EiJ, que se consigue en el mercado, es susceptible a la infección por el virus de la viruela símica por vía intranasal, con una DL50 de 680 UFP (Americo, Moss y Earl, 2010). Estos ratones fueron más sensibles aun (DL50 de 14 UFP) cuando se los inoculó por vía intraperitoneal. Los ratones CAST/EiJ son inmunocompetentes y presentan grandes ventajas para poner a prueba posibles medidas contra las ortopoxvirosis: son genéticamente homogéneos y se consiguen en el mercado, y se dispone de reactivos inmunológicos para evaluar la respuesta del huésped. Se ha infectado a primates con el virus de la viruela símica por diferentes vías: aerosol (Zaucha et al., 2001), intramuscular (Wenner et al., 1969), intratraqueal, intrabronquial e intravenosa (Stittelaar et al., 2006). En la mayoría de los primeros estudios sobre los cuales se informó se usaron macacos de Java (Macaca iris o M. fascicularis) (Hahon, 1961), aunque también se podrían usar macacos de la India (Macaca mulatta) (Hooper et al., 2004). La exposición por aerosol es la más apropiada para los modelos de exposición primaria tras un ataque en una guerra biológica. La transmisión natural del virus de la viruela símica (y del virus variólico) probablemente se produzca mediante una combinación de exposición por aerosol, fómites y exposición de las mucosas. Para la exposición por aerosol, que es menos controlable que la exposición por vía intravenosa, se necesitan medidas de biocontención de nivel de bioseguridad 4 en una cámara de seguridad biológica de clase III. La infección experimental de macacos de Java con virus de la viruela símica por aerosol (dosis inhalada calculada de 3 × 104 UFP) provocó la muerte de cinco de seis monos (uno por día los días 9, 11 y 12 y dos el día 10), con una media del tiempo hasta la muerte de 10,4 días. Los monos tenían fiebre alta (>39 °C), exantema leve, tos y leucocitosis con monocitosis absoluta y relativa (Jahrling, Zaucha y Huggins, 2000). Se aisló virus de células de la capa leucocitaria de animales febriles y, cuando se efectuó la necropsia, se encontraron títulos elevados de virus (>106 UFP/g) en los pulmones y en el bazo (Zaucha et al., 2001). Sobre la base del examen histopatológico se atribuyó la muerte a una bronconeumonía fibrinonecrótica grave. En los análisis inmunohistoquímicos se observaron abundantes antígenos del virus de la viruela símica en muestras de epitelio de las vías respiratorias afectadas y del intersticio circundante. Los parámetros clínicos medidos en los monos expuestos al virus de la viruela símica en aerosol se producen en un orden similar al observado en los seres humanos, pero con una tasa mayor (Breman y Henderson, 2002). La exposición intravenosa de macacos de Java al virus de la viruela símica también produjo una infección general uniforme. La gravedad de la enfermedad guardaba relación con la dosis (Stittelaar et al., 2006; Huggins y Jahrling, observaciones inéditas). 90 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Los macacos de Java infectados por vía intravenosa con 1 × 107 UFP de virus de la viruela símica (cepa Zaire 79, CDC V79‐I‐005) presentaron febrícula a partir del día 3 y lesiones pustulosas los días 4 y 5. La muerte sobrevino a partir del día 8, con una media del tiempo hasta la muerte de 12 días, es decir, entre 4 y 8 días después del inicio del exantema, período menor que el de 10 a 14 días observado con la viruela símica humana. Murieron 11 de los 12 monos infectados (92%), en comparación con 10% en la enfermedad humana. Se encontraron lesiones pustulosas en todos los animales, clasificadas como «graves» según el sistema de la OMS (más de 250 lesiones), que afectaron plenamente a las manos, los pies, la boca y el paladar blando. Todos los monos presentaron esta evolución típica de las etapas de formación de lesiones, y los que sobrevivieron el tiempo suficiente a la larga presentaron escaras. Todos los animales perdieron peso. Los resultados de las pruebas de laboratorio fueron normales en su mayoría, excepto por un aumento del nitrógeno de la urea en sangre y de la creatinina poco antes de la muerte. En la necropsia se observó que los órganos estaban muy afectados por lesiones macroscópicas y por la multiplicación del virus. Los títulos víricos en el pulmón, el hígado y el bazo eran superiores a 108 UFP/g, y en la sangre había 105 UFP/ml de virus asociado a células. En el plasma no había virus infeccioso. Los títulos víricos en los riñones eran ligeramente superiores a los de la sangre, lo cual indica que el virus se multiplica en los riñones. No se detectó una carga vírica importante (superior a la de la sangre contenida) en el cerebro. A fin de determinar el efecto de la dosis infecciosa en la evolución de la enfermedad, se evaluaron dosis menores, de 105 y 106 UFP. Estas dosis más bajas no causaron la muerte, pero todos los animales enfermaron y presentaron lesiones. El número de lesiones, según el sistema de clasificación de la OMS, dependía de la dosis y era leve (con 105 UFP), moderado (con 106 UFP) o grave (con 107 UFP). Los animales infectados presentaban una elevación notable de los leucocitos que no dependía de la dosis. Se observó una disminución de las plaquetas dependiente de la dosis, que llegó al nivel más bajo entre los días 2 y 8, pero después las plaquetas volvieron a los límites normales. Con las dosis más bajas del virus no se observó un deterioro importante de la función pulmonar. Todos los animales tenían febrícula (<38,3 °C) para el día 3 o 4. Las lesiones pustulosas aparecieron entre los días 4 y 5, continuaron agrandándose hasta el día 10 o 12 y después se resolvieron en el curso de las dos semanas siguientes en los animales que sobrevivieron. Los animales infectados con dosis letales de 107 UFP o mayores presentaban más de 1500 lesiones. La carga vírica en la sangre, medida en forma de genomas por mililitro de sangre entera mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP) cuantitativa, podía detectarse 24 horas después de la infección y aumentó a más de 107 genomas/ml antes de la muerte. En los animales que sobrevivieron, ya sea porque recibieron dosis infecciosas más bajas o quimioterapia antivírica eficaz o porque fueron vacunados, la carga vírica nunca excedió de 106 genomas/ml. La albúmina disminuyó proporcionalmente a la dosis, llegando a 15 mg/ml en los monos infectados con 107 UFP, mientras que la proteína sérica total se mantuvo dentro de los límites normales. Se usó el modelo de provocación intravenosa por el virus de la viruela símica para poner a prueba la eficacia de una vacuna experimental para la viruela a base de virus variolovacunal Ankara modificado (MVA) muy atenuado. En este estudio se comparó la vacuna de MVA con la vacuna Dryvax autorizada y combinada con ella (Earl et al., 2004). Se vacunó a monos con la vacuna de MVA o Dryvax. Durante la semana 8, los monos que 5. Modelos animales y patogenia 91 habían recibido la vacuna de MVA recibieron una dosis de refuerzo de la misma vacuna o de la vacuna Dryvax, y después, en la semana 16, fueron provocados por vía intravenosa con virus de la viruela símica. Los testigos que recibieron placebo presentaron más de 500 lesiones pustulosas y enfermaron de gravedad; dos de seis murieron. En cambio, ninguno de los monos que recibieron la vacuna Dryvax sola o combinada con la vacuna de MVA enfermó. Los monos que recibieron la vacuna de MVA y una dosis de refuerzo de la misma vacuna permanecieron sanos pero presentaron 16 lesiones en promedio. Ninguno de los monos vacunados presentó una viremia importante detectada mediante RCP cuantitativa (Kulesh et al., 2004), a diferencia de los testigos que recibieron placebo, que tenían títulos víricos superiores a 108 genomas/ml en la sangre. Cuando se estaba vacunando a los monos, se observó que la vacuna de MVA producía títulos más altos que la vacuna Dryvax en la prueba de inmunosorción enzimática dentro de los 10 días siguientes a la vacunación. A fin de determinar si la respuesta inmunitaria a la vacuna MVA era suficiente como para conferir protección con tanta rapidez, se administró a los monos una sola dosis de vacuna de MVA o Dryvax y se los provocó el día 10. A diferencia de lo que ocurrió con los testigos, que presentaron más de 500 lesiones cada uno y enfermaron de gravedad, ninguno de los monos que recibieron la vacuna de MVA o Dryvax enfermó. Ambos grupos presentaron lesiones aisladas (de tres a seis por animal). Ambas vacunas limitaron la multiplicación vírica a títulos inferiores a los de la viremia artificial provocada mediante la infección intravenosa por virus de la viruela símica. La vacuna Dryvax confirió una protección sólida contra la provocación con virus de la viruela símica administrado en aerosol en estudios de la eficacia de la vacuna en los cuales se comparó la vacuna Dryvax con un virus variolovacunal obtenido de un cultivo celular (Jahrling, 2002). Más recientemente, la vacuna de MVA confirió una protección sólida contra provocaciones letales de macacos de Java con virus de la viruela símica administrado por vía respiratoria (Stittelaar et al., 2005). Se usaron macacos de la India en un modelo similar de provocación por vía intravenosa para evaluar la estrategia de una vacuna de ADN (ácido desoxirribonucleico) con una combinación de cuatro genes del virus variolovacunal (L1R, A27L, A33R y B5R); los resultados fueron prometedores (Hooper et al., 2004). Hace poco, estos genes fueron expresados en un replicón de alfavirus, con resultados prometedores similares (Hooper et al., 2009). Se ha mostrado cierta renuencia a aceptar el modelo de provocación por vía intravenosa, alegándose que la provocación debería efectuarse por la vía «natural». El argumento en contra de esta preocupación es que la protección contra una dosis intravenosa abrumadora es un criterio muy estricto y puede predecir la eficacia contra la infección por vías periféricas. Sin embargo, debido a estas preocupaciones y a que la provocación intravenosa crea exigencias excesivas para la evaluación de medicamentos antivíricos, se están examinando otros modelos de exposición, entre ellos la vía intratraqueal. Como la curva de dosis‐respuesta es muy pronunciada, la administración intravenosa del virus es una ventaja al calibrar la dosis del inóculo. Para la exposición aerógena o por medio de las mucosas se necesitarían más animales. A pesar de estas limitaciones, se ha usado el modelo de administración intravenosa del virus de la viruela símica para demostrar la eficacia de varios medicamentos antivíricos experimentales, entre ellos el cidofovir (Wei et al., 2009) y el ST‐246 (Jordan et al., 2009), pero esos estudios rebasan el alcance de este capítulo. 92 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 En fecha reciente se han examinado distintos modelos en primates utilizando otros métodos de provocación con ortopoxvirus. Un método prometedor consiste en la infección de titíes (Callithrix jaccus) por el virus de la viruela vacuna (Kramski et al., 2010). La provocación intranasal con solo 5 × 102 UFP de virus de la viruela vacuna es letal para los titíes y la evolución de los signos recuerda a la viruela. Aunque el mono tití es un pariente más distante de los seres humanos que los macacos y todavía no es fácil conseguir reactivos inmunológicos, esta especie es muy prometedora para la obtención de modelos en el futuro. Se necesita un modelo animal en el cual el virus variólico produzca una enfermedad similar a la viruela humana para demostrar de forma convincente la eficacia protectora de las vacunas y los medicamentos antivíricos con respecto a la viruela (USFDA, 2002, 2008, 2009). Debido a la especificidad de especie del virus variólico, no es sorprendente que los intentos de infectar a roedores y conejos con virus variólico y producir enfermedad en ellos hayan sido infructuosos (Marennikova, 1979). De hecho, incluso en los primates, los primeros experimentos con virus variólico produjeron infecciones leves que remitieron espontáneamente. Los macacos de Java expuestos a aerosoles que contenían 2 × 108 UFP presentaron exantema al cabo de un período de incubación de 6 días. El virus se multiplicó en los pulmones y se establecieron sitios secundarios de multiplicación en los ganglios linfáticos antes de que se produjera la viremia (Hahon, 1961). En el mismo estudio (Westwood et al., 1966), se expuso a 109 macacos de la India. Todos presentaban fiebre para el día 5 y exantema entre los días 7 y 11, pero solo dos murieron. Los macacos coronados (Macaca radiata) también resistieron la enfermedad tras la infección (Rao et al., 1968) y ninguno de los 14 murió. Sin embargo, los mismos autores demostraron que, con el tratamiento con cortisona, los monos se volvieron susceptibles: 14 de 16 murieron, al igual que una mona que no había recibido tratamiento pero que estaba preñada. En las poblaciones humanas, las mujeres embarazadas presentaban la mortalidad más elevada tras la infección variólica (Rao et al., 1963). Por lo tanto, los registros históricos muestran que no había modelos apropiados de la patogenia de la infección por el virus variólico en los seres humanos (US Institute of Medicine, 1999). Sin embargo, se sabía que la infección de los macacos producía lesiones cutáneas e indicios de infección general, y se usó un modelo en primates a fin de autorizar la vacuna de MVA en Alemania en los años sesenta (Hochstein‐Mintzel et al., 1975). Por consiguiente, era razonable someter a prueba otras cepas del virus variólico en dosis mayores por diversas vías a fin de buscar un modelo de viruela letal. La exposición de macacos de Java por aerosol a las cepas Yamada o Lee del virus variólico (108,5 UFP) produjo infección pero no una enfermedad grave (LeDuc y Jahrling, 2001). Sin embargo, la exposición de los monos a las cepas del virus variólico Harper o India 7124 por vía intravenosa condujo a una letalidad aguda (Jahrling et al., 2004). Con dosis inferiores a 109 UFP, la letalidad fue menor y los parámetros cuantificables de la gravedad de la enfermedad disminuyeron a la par de la dosis. En los monos que murieron después de la infección por el virus variólico, las lesiones terminales se parecían a la viruela humana terminal. Nuestros conocimientos de la fisiopatología de la viruela humana son imprecisos porque la enfermedad fue erradicada antes de que se dispusiera de los instrumentos modernos de la virología y la inmunología. Sin embargo, los modelos en primates podrían ser una fuente de inspiración para reanudar la investigación de muestras archivadas utilizando técnicas 5. Modelos animales y patogenia 93 modernas tales como inmunohistoquímica y micromatrices de ADNc, que se usaron en los estudios de modelos en primates (Jahrling et al., 2004; Rubins et al., 2004). Un examen reciente de todos los informes anatomopatológicos publicados en inglés en los últimos 200 años (Martin, 2002) mostró que, en general, los pacientes por lo demás sanos que morían de viruela generalmente sucumbían a la insuficiencia renal, el choque como consecuencia de la hipovolemia, y la dificultad con la oxigenación y la ventilación como consecuencia de la neumonía vírica y la afección de las vías respiratorias, respectivamente. La degeneración de hepatocitos podría haber dañado la salud en cierta medida, pero la insuficiencia hepática no era por lo común la causa de muerte. Las lesiones terminales de los monos a los cuales se inoculó virus variólico se parecían mucho a esta enfermedad humana (Jahrling et al., 2004). Después de la infección experimental se podían evaluar varios parámetros en momentos intermedios antes de la muerte. Los monos inoculados por vía intravenosa presentaron una viremia artificial demostrable justo después de la inoculación. Tras una fase de eclipse de varios días, el virus en la sangre estaba asociado únicamente a los monocitos. Los animales que murieron tenían leucocitosis profunda, trombocitopenia y una concentración elevada de creatinina en suero. La gran carga vírica en los tejidos afectados estaba relacionada con una disfunción orgánica e insuficiencia multiorgánica. La distribución de los antígenos víricos (determinada por medio de técnicas inmunohistoquímicas) estaba correlacionada con la presencia de partículas víricas capaces de multiplicarse (determinada por medio de microscopia electrónica) y con alteraciones de los tejidos linfáticos, la piel, la mucosa oral, el tubo digestivo, el aparato reproductor y el hígado. Los indicios histológicos de una tendencia hemorrágica fueron corroborados por la elevación de dímeros D. Se produjo apoptosis de linfocitos T en el tejido linfático, probablemente debido a la multiplicación vírica en los macrófagos y a la hipercitocinemia resultante («tormenta de citocinas»). La «toxemia», descrita por los médicos como el evento terminal en la viruela humana, probablemente se deba tanto a la hiperestimulación de la respuesta inmunitaria innata, con inclusión de la interleucina‐6 y el interferón‐γ, como al daño ocasionado directamente por el virus a los tejidos. Se analizaron muestras de sangre periférica de los monos utilizando micromatrices de ADNc ideadas para el estudio de las características de la expresión de los genes humanos (Rubins et al., 2004). El virus variólico produjo perfiles sorprendentes y temporalmente coordinados de expresión de los genes (características que representan la respuesta de un interferón), proliferación celular y expresión de inmunoglobulinas, correlacionados con la dosis vírica y la modulación de la respuesta inmunitaria del huésped. Lo sorprendente es que prácticamente no hubo una respuesta del factor de necrosis tumoral‐α – factor nuclear kappa B (NF‐κB), lo cual indica que los productos genéticos del virus variólico podrían neutralizar esta respuesta. En los modelos en monos solo se puede lograr una aproximación de la interacción del virus variólico con el sistema inmunitario humano, pero es menos dudoso extrapolar de los primates a los seres humanos que de los roedores a los seres humanos. Todavía no se sabe si el virus de la viruela símica en los monos es un modelo mejor de la viruela humana que el virus variólico en los monos, lo cual es el tema de intensas investigaciones. Ambos modelos en primates podrían llevar a la formulación de estrategias de diagnóstico, prevención y tratamiento. 94 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 5.3 Conclusión En general, se reconoce que los modelos en primates del virus de la viruela símica o el virus variólico reproducen algunas de las características de la enfermedad humana pero no todas. La infección intravenosa con estos virus lleva a una secuencia de manifestaciones similares a la enfermedad en los seres humanos (Breman y Henderson, 2002), aunque más acelerada debido a la ausencia de un período prodrómico. Igual que ocurre en los seres humanos tras la viremia secundaria, el inicio de la fiebre está seguido de la aparición de máculas, pápulas, vesículas, pústulas y, a la larga, costras, si el paciente no sucumbe a la enfermedad. El curso de la enfermedad experimental puede prolongarse disminuyendo la dosis intravenosa del inóculo; una disminución de la dosis a la décima parte reduce la letalidad del 100% al 33%, aproximadamente, y aumenta la media del tiempo hasta la muerte. Aunque una mortalidad del 33% para la infección por el virus variólico se asemeja más a la enfermedad humana, al usar este modelo para determinar la eficacia es necesario recurrir a determinaciones de criterios indirectos de valoración en vez de la reducción de la mortalidad. Actualmente, los criterios indirectos de valoración son las reducciones de la viremia y el número de lesiones, que son mediciones rudimentarias de la gravedad de la enfermedad. Se necesita más tiempo para obtener una serie de criterios indirectos de valoración que refleje con mayor exactitud la fisiopatología de la enfermedad y su reversión. Entre ellos se encuentran series de biomarcadores y características de la expresión de proteínas que se refieran a la totalidad del genoma, junto con la imaginología médica, incluida la resonancia magnética, la tomografía por emisión de positrones, la tomografía de emisión monofotónica y la tomografía computarizada. Se debería comenzar a invertir más en modelos perfeccionados en primates después de una evaluación exhaustiva de los datos de experimentos anteriores, entre ellos los realizados con dosis más bajas de virus administradas por distintas vías, como la exposición por aerosol, intrabronquial, intratraqueal y por gotículas. Probablemente no se encuentre una combinación única de condiciones que conduzca a un modelo que satisfaga simultáneamente todos los criterios del modelo ideal de infección variólica, sino que podrían necesitarse diferentes modelos para evaluar distintas indicaciones. Se debería tener en cuenta la utilidad de los datos fisiopatológicos de estudios con telemetría e imaginología médica. Si conviene invertir más en modelos específicos, habría que prestar especial atención a la dilucidación de las características de los biomarcadores que podrían usarse en un medio clínico como desencadenantes de una intervención temprana, aumentando de esa forma las probabilidades de éxito de la intervención. Abreviaturas ADNc ácido desoxirribonucleico complementario MVA virus variolovacunal Ankara modificado OMS Organización Mundial de la Salud RCP reacción en cadena de la polimerasa 5. Modelos animales y patogenia 95 96 UFP unidad formadora de placas WR Western Reserve Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Referencias Adams MM, Rice AD, Moyer RW (2007). Rabbitpox virus and vaccinia virus infection of rabbits as a model for human smallpox. Journal of Virology, 81:11084–11095. Alcami A, Smith GL (1992). 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Laboratory Investigation 81:1581–1600. 100 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 6 Obtención de medicamentos antivíricos pa r a e l t r a ta m i e n t o d e l a v i r u e l a : situación de la terapéutica con moléculas pequeñas John W Huggins1 y Nina Tikunova2 1 División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos, Fort Detrick (Estados Unidos de América) 2 Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk (Federación de Rusia) Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones contenidas en este capítulo son de los autores y no han sido necesariamente refrendadas por el Ejército o el Departamento de Defensa de Estados Unidos ni por el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR. 101 Resumen de orientación Importancia para la salud pública En vista de los eventos graves, que ocasionalmente llevan a la muerte, relacionados con las vacunas antivariólicas actuales, es muy improbable que se vacune de forma generalizada contra la viruela antes que se produzca un brote. Por lo tanto, si resurge la viruela, podría ser necesario tratar un gran número de casos con un medicamento antivírico antes que las campañas de vacunación masiva tengan tiempo para conferir suficiente inmunidad protectora. Antes, las medidas de control de la viruela consistían exclusivamente en la vacunación y el cuidado de sostén de las personas infectadas, cuya probabilidad de morir como consecuencia de la infección podía llegar al 30%. Sin embargo, la experiencia con el control de la actual epidemia de gripe H1N1 ha demostrado que tanto la vacuna como los medicamentos antivíricos pueden ser importantes como parte de la respuesta de salud pública a fin de controlar el brote y reducir la mortalidad de las personas infectadas. El proyecto que se describe en este capítulo se realizó con la finalidad de obtener la aprobación de dos medicamentos antivíricos orales, que tienen mecanismos de acción diferentes, para tratar los casos clínicos de viruela. A fin de que estos medicamentos puedan utilizarse en un brote, deben estar aprobados por un organismo de reglamentación competente. Dicha aprobación también representa una prueba convincente de la eficacia de los medicamentos, que será necesaria para los funcionarios de salud pública que formulen estrategias de control. Como la viruela fue erradicada mediante la vacunación masiva, la eficacia de estos medicamentos solo se puede demostrar con modelos animales de infección por el virus variólico en primates no humanos. Progreso realizado hasta la fecha La obtención de cualquier tratamiento antivírico es un proceso prolongado y difícil que ha sido infructuoso en el caso de muchas infecciones víricas, en particular el catarro común. En lo que concierne a la viruela, se ha progresado mucho con el descubrimiento inicial de medicamentos y es necesario evaluar varios medicamentos experimentales en modelos animales. Tres compuestos (cidofovir, ST‐246 y CMX001) que inhiben la multiplicación del virus variólico en cultivos celulares y en varios modelos animales (modelos de ortopoxvirus sustitutos) han recibido la clasificación de medicamentos experimentales nuevos de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (USFDA) para el tratamiento de ortopoxvirosis. Se están llevando a cabo estudios iniciales con seres humanos. Dos de estos compuestos (cidofovir y ST‐246) han demostrado actividad en un modelo letal de infección por el virus variólico en primates, y el tercero es un profármaco de cidofovir que puede administrarse por vía oral. El desarrollo del ST‐246 y el CMX001 sigue adelante y ya se han iniciado ensayos clínicos. 102 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Investigaciones adicionales que requieren el uso de virus variólico vivo a fin de obtener la aprobación de un medicamento antivírico para el tratamiento de la viruela Aunque los resultados obtenidos hasta la fecha son prometedores, la vasta experiencia del sector con la obtención de medicamentos indica que menos de 35% de los compuestos que llegan a la etapa de los ensayos ampliados sobre seguridad (fase II de la USFDA) reciben aprobación. El proceso para pasar de la etapa de medicamento experimental nuevo a la solicitud de clasificación de medicamento nuevo lleva de cinco a siete años, en promedio. Como el virus variólico ha sido erradicado de la población humana, no se pueden hacer ensayos clínicos tradicionales de la eficacia. Por razones éticas, tampoco se pueden hacer ensayos clínicos en seres humanos, de modo que, para demostrar la eficacia, se deben aplicar las normas de la USFDA relativas a las pruebas con animales (US 21CRF310.610). En vista de las incertidumbres de estas normas y del hecho de que todavía no se ha aprobado ningún medicamento antivírico para ningún tipo de indicación relacionada con la viruela (ya sea tratamiento o quimioprofilaxis), es difícil calcular el tiempo o los datos necesarios para la aprobación. Se prevé que se requerirán datos sobre las investigaciones con el virus variólico, entre otras cosas. La intensidad del examen y el grado de escrutinio científico aplicados a los estudios con modelos animales propuestos para respaldar las indicaciones de conformidad con las normas correspondientes serían los mismos que se aplican a los ensayos clínicos en seres humanos con objeto de respaldar la aprobación de productos para otros tipos de indicaciones utilizando otras vías para obtener la aprobación. El proceso de aprobación en otros países implica al menos la misma incertidumbre. Se podría argumentar que debería existir la posibilidad de realizar estudios con virus variólico vivo hasta que las autoridades de reglamentación aprueben suficientes medicamentos, con mecanismos de acción diferentes, que puedan usarse en todo el mundo para combatir un brote de viruela. En un informe del Instituto de Medicina de las Academias Nacionales, titulado Live variola virus considerations for continuing research [Consideraciones sobre el virus variólico para la continuación de las investigaciones], se llega a la conclusión de que «la razón más contundente para la conservación a largo plazo de reservas de virus variólico vivo es su función esencial en la selección y la obtención de agentes antivíricos que puedan usarse en previsión de un gran brote de viruela». 6.1 Introducción La enfermedad variólica natural fue erradicada mediante la vacunación masiva en una época en que la terapéutica antivírica todavía estaba en gestación. Los medicamentos que había en esa época, entre ellos la tiosemicarbazona metisazona (Marboran) y la M&B7714 conexa, no presentaron actividad en los ensayos terapéuticos y profilácticos en el terreno (Rao, McFadzean y Squires, 1965; Rao, McFadzean y Kamalakshi, 1966; Rao et al., 1966), por lo que fueron retirados del mercado. El arabinósido de citosina (ara‐C) (Dennis et al., 1974) y el arabinósido de adenosina (ara‐A) (Koplan et al., 1975) tampoco 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 103 redujeron la mortalidad. Los resultados de estos estudios han sido objeto de una revisión (Smee y Sidwell, 2003). La obtención de medicamentos para la viruela es un proceso complicado, prolongado y costoso. La mayor parte del progreso realizado hasta la fecha en el descubrimiento de medicamentos se ha logrado en universidades, laboratorios estatales y unas pocas compañías farmacéuticas pequeñas. La obtención de un compuesto terapéutico comienza con el descubrimiento de un compuesto que inhibe de forma selectiva la multiplicación vírica en cultivos celulares. Este descubrimiento guía a los químicos orgánicos en la síntesis de estructuras químicas similares, a fin de determinar cuál es el compuesto más activo de esa clase. Esta tarea suele estar seguida de un enfoque de química medicinal, con el cual se modifica sistemáticamente la estructura y se evalúa su actividad antivírica a fin de producir el compuesto más potente, que ahora se denomina «cabeza de serie». La mayor parte de los estudios publicados corresponden a estos pasos iniciales. La cabeza de serie no suele tener todas las propiedades de un medicamento deseable, como poca toxicidad, dosificación oral, resistencia a la inactivación metabólica, solubilidad adecuada y muchas otras características que contribuyen al éxito del tratamiento. Durante la etapa de obtención, el químico medicinal trata de modificar la estructura a fin de mejorar propiedades convenientes tales como la solubilidad, eliminando al mismo tiempo aspectos no deseables tales como la toxicidad, para lo cual suele ser necesario sacrificar algo de potencia en el quid pro quo. Después se necesitan estudios multidisciplinarios complejos en animales, realizados con prácticas adecuadas de laboratorio, para comprender el metabolismo del compuesto, su farmacocinética, la distribución en los tejidos y la toxicidad. Estas propiedades deben evaluarse en varias especies, utilizando una serie de pruebas bastante corrientes, así como en estudios especialmente adaptados para determinar si el compuesto podrá administrarse sin peligro a los seres humanos. En esta etapa se debe hacer una extensa serie de evaluaciones, denominada «sección de microbiología», en cultivos celulares y modelos animales. Estas evaluaciones proporcionan información sobre la capacidad del compuesto para inhibir la multiplicación vírica e información preliminar sobre su capacidad para reducir la morbilidad y mortalidad por la enfermedad. Estos estudios, junto con la información obtenida en los estudios de farmacocinética con las mismas especies de animales, permiten calcular la concentración mínima necesaria para la actividad del fármaco y, combinados con los estudios de la fase I de medicamentos experimentales nuevos en seres humanos, permiten realizar un cálculo inicial de la dosis objetivo correspondiente en los seres humanos. En Estados Unidos, para administrar un posible medicamento a seres humanos con fines de evaluación clínica hay que presentar una solicitud de clasificación de medicamento experimental nuevo, a la que se adjuntan formalmente los estudios antedichos, así como información sobre la metodología de síntesis y los procedimientos de control de calidad. Los estudios para obtener un medicamento experimental nuevo llevan varios años y deben realizarse antes de la evaluación del compuesto en seres humanos. Menos de 10% a 25% de los compuestos que reciben la clasificación de medicamento experimental nuevo son aprobados a la larga. 104 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Los estudios de la fase I en seres humanos comienzan con un pequeño número de sujetos y una concentración del compuesto seleccionado mucho menor (la décima parte o menos) que la que pueda causar toxicidad. Se va aumentando lentamente la concentración a la par que se determinan las características farmacocinéticas del medicamento y su distribución, hasta que se obtiene una concentración adecuada sobre la base de los estudios preclínicos. Si el fármaco candidato no es tóxico en la concentración que se prevé que será terapéutica, se realiza un estudio ampliado para determinar su seguridad en un número creciente de sujetos. Posteriormente, estos estudios se extienden a grupos especiales que son buenos candidatos para el tratamiento, incluidos aquellos con complicaciones de índole médica. En el caso de la viruela, como no sería conveniente excluir a nadie, esas poblaciones incluirían a niños, adolescentes, adultos y personas de edad avanzada, así como personas con problemas que puedan influir en las concentraciones del fármaco, como trastornos renales o hepáticos. A la larga, habrá que evaluar la seguridad en cientos de sujetos (con una evaluación en 600 sujetos se detectará un evento adverso al nivel del 1%). Los datos sobre la eficacia que la USFDA requiere para la aprobación de un medicamento provienen tradicionalmente de ensayos clínicos fundamentales «bien controlados» en seres humanos. Este requisito no se puede cumplir con medicamentos para una enfermedad sumamente patógena, como la viruela. A fin de abordar este problema, la USFDA ha publicado normas relativas a las pruebas con animales (USFDA, 2009), que permiten demostrar la eficacia utilizando uno o varios modelos animales que reproduzcan de forma adecuada los aspectos cruciales de la enfermedad y en el cual quepa prever que una reducción similar de la magnitud de la enfermedad en los seres humanos conduzca a una reducción de la morbilidad o la mortalidad. Sin embargo, esto plantea varios problemas adicionales para la obtención de medicamentos. La determinación de la dosis objetivo equivalente para los seres humanos y los animales utilizados en las pruebas de eficacia ha adquirido más importancia, ya que determinará la dosis para los seres humanos. Extrapolar el margen terapéutico entre los seres humanos y los modelos actuales de infección por el virus variólico en primates también es difícil. En los modelos actuales, debido a su gravedad, se podría subestimar el último momento en que se puede iniciar el tratamiento. En lo que se refiere a la viruela, la meta de un tratamiento eficaz es reducir la mortalidad cuando se inicia el tratamiento después de la aparición de lesiones (el único diagnóstico que resulta práctico durante un gran brote). Eso elimina los medicamentos que solo reducen la morbilidad y, en vista de los modelos actuales de infección por el virus variólico, constituye un requisito más estricto para el medicamento. Además de los estudios limitados realizados en los dos centros colaboradores de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en Estados Unidos y el Centro Estatal de Investigaciones sobre Virología y Biotecnología VECTOR en la Federación de Rusia), en el proceso de descubrimiento en relación con el virus variólico se han utilizado virus sustitutos debido a la limitación del acceso al virus variólico y a las dificultades para realizar ese tipo de investigación en instalaciones con nivel de bioseguridad 4. En la mayor parte de las investigaciones se han usado dos virus sustitutos estrechamente relacionados: el virus variolovacunal y el virus de la viruela vacuna, y se han hecho algunas evaluaciones con el virus de la ectromelia y el virus de la viruela del conejo, que presentan un riesgo biológico menor. Además, 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 105 ambos pueden manipularse en instalaciones con nivel de bioseguridad 2. Después se evalúan compuestos muy potentes contra el virus de la viruela símica y un número mucho menor contra el virus variólico. Muchos laboratorios han contribuido a la labor para descubrir compuestos antivíricos con actividad contra los ortopoxvirus. En 2009, en una búsqueda realizada en PubMed de los términos «ortopoxvirus» y «antivírico», se encontraron 1041 publicaciones, que en su mayoría se referían solamente a actividades preliminares de descubrimiento de medicamentos, en muchos casos con virus variolovacunal para la evaluación primaria in vitro, de la forma sugerida (De Clercq, 2001). Otros grupos incluyen sistemáticamente el virus de la viruela vacuna. En un estudio realizado por la División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos (USAMRIID) con más de 500 compuestos se determinó que, entre los virus que pueden manipularse en instalaciones con nivel de bioseguridad 2, el virus de la viruela vacuna era el que mejor permitía predecir la actividad del virus variólico (Huggins, observación inédita, 2003). Muchos de los resultados publicados han sido revisados por varios autores (Goebel et al., 1982; Bray et al., 2000; De Clercq, 2001; Baker, Bray y Huggins, 2003; Keith et al., 2003; Kern, 2003; Smee y Sidwell, 2003; De Clercq et al., 2005; Smee, 2008), y se recomienda a los lectores que se remitan a esas revisiones para ver información detallada sobre cada compuesto. Esos autores examinaron la actividad de varias clases de compuestos, agrupándolos con frecuencia según el mecanismo de acción propuesto. 6.2 Descubrimiento de medicamentos Los ortopoxvirus son grandes virus lineales con ADN (ácido desoxirribonucleico) bicatenario que se multiplican exclusivamente en el citoplasma, utilizando varias enzimas codificadas por virus para la multiplicación del ADN. Los complejos mecanismos de multiplicación de los ortopoxvirus representan numerosos blancos para la intervención farmacológica. El genoma de los ortopoxvirus tiene una parte central muy conservada que codifica la maquinaria necesaria para la multiplicación vírica. Los dos extremos, que son más variables, codifican proteínas que influyen en la virulencia y la gama de huéspedes. El genoma del virus variólico codifica un gran número de proteínas que alteran la capacidad del huésped para reconocer la infección y echar a andar los mecanismos que normalmente permiten a los seres humanos combatir la infección. La maquinaria necesaria para la multiplicación vírica ha sido el blanco más frecuente de la formulación de los medicamentos antivíricos, ya que está muy conservada en los ortopoxvirus, lo cual posibilita el uso de virus sustitutos, como el variolovacunal y el de la viruela vacuna, para el descubrimiento inicial de medicamentos. Asimismo, la secuencia de la polimerasa del ADN vírico presenta grandes similitudes en el sitio activo con otros virus de ADN, entre ellos los herpesvirus. 6.2.1 Tiosemicarbazonas Las tiosemicarbazonas fueron la primera clase de medicamentos en mostrar actividad contra los ortopoxvirus (Bauer, 1955). La metisazona, cuyo uso para el tratamiento de la viruela se aborda en la sección 6.1, mostró una actividad moderada contra el virus variólico en pruebas basadas en una inhibición de 50% (Baker, Bray y Huggins, 2003), pero logró inhibir la multiplicación en un 80% solo con la concentración máxima tolerada (Huggins, observación inédita, 2003). Se evaluaron numerosos compuestos afines in 106 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 vitro, y algunos en modelos en ratones, que presentaron una actividad moderada; pero ninguno pasó a la etapa de evaluación avanzada en primates. 6.2.2 Evaluación de fármacos nuevos aprobados y en investigación Los medicamentos aprobados actualmente por la USFDA fueron evaluados sistemáticamente in vitro para determinar su actividad contra el virus variolovacunal y el virus de la viruela vacuna (Kern, 2003). Entre ellos se encuentran algunos que presentan actividad contra los herpesvirus, el virus de la hepatitis B (virus de ADN) y el virus de la inmunodeficiencia humana (que es un virus de ARN), así como inhibidores de la retrotranscriptasa análogos de nucleósidos, inhibidores de la retrotranscriptasa no análogos de nucleósidos e inhibidores de la proteasa, y varios compuestos clasificados como medicamentos experimentales nuevos. Muchos de los compuestos activos también fueron evaluados para determinar su actividad contra el virus variólico y el virus de la viruela símica (Goebel et al., 1982; Baker, Bray & Huggins, 2003). Kern y colaboradores (2002) encontraron varios compuestos con actividad pertinente, entre ellos el cidofovir y el adefovir dipivoxil (bis‐POM PMEA), que ya se conocían; sin embargo, Baker, Bray y Huggins (2003) observaron que el último compuesto era menos activo. La idoxuridina y la trifluridina, dos medicamentos de uso tópico, presentaron actividad pero no se pudieron administrar por vía oral debido a su toxicidad. Se evaluó una quimioteca integrada por la mayoría de los medicamentos aprobados sin indicar candidatos adicionales (Huggins, resultados inéditos del programa de evaluación de USAMRIID, 2005). 6.2.3 Fosfonatos de nucleósidos acíclicos Los nucleósidos acíclicos que inhiben la ADN polimerasa, como aciclovir, penciclovir y ganciclovir, así como sus profármacos orales, fueron utilizados originalmente contra los herpesvirus. Requieren fosforilación por una timidina‐cinasa o proteína‐cinasa codificada por virus y fosforilación adicional por cinasas celulares para producir el compuesto antivírico activo a base de trifosfato. La timidina‐cinasa del citomegalovirus humano no logró fosforilar estos compuestos, de modo que se obtuvo una clase de fosfonatos de nucleósidos acíclicos equivalentes al monofosfato de nucleósidos que utilizan fosfonatos químicamente resistentes que no son reconocidos por las fosfatasas que normalmente extraen un monofosfato en circulación. La clave consistió en sustituir el enlace P–O–C lábil con un enlace P–C estable de fosfonato que no es escindido por las hidrolasas celulares (De Clercq, 2003; Helliot et al., 2003; Keith et al., 2003). En cuanto al citomegalovirus humano, la timidina‐cinasa de los ortopoxvirus no fosforila los nucleósidos acíclicos, pero el cidofovir (HPMPC) y su análogo cíclico, el HPMPC cíclico, presentaron actividad in vitro contra todos los ortopoxvirus sometidos a prueba, incluido el virus variólico (Baker, Bray y Huggins, 2003). El cidofovir fue el primer compuesto en mostrar protección en el modelo de infección por el virus variólico en primates, y ha demostrado protección en varios modelos en animales pequeños (véase una lista en el cuadro 3 de Smee, 2008). El cidofovir (Vistide) intravenoso, cuya situación actual se examina en los apartados 6.5 y 6.9, ha sido aprobado para el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus humano con una dosis semanal de 5 mg/kg. Los problemas de captación del cidofovir, que es captado por pinocitosis y requiere una inyección en embolada que puede causar nefrotoxicidad, fueron superados mediante 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 107 lípidos derivados de cidofovir sintetizados por Hostetler y colaboradores (Painter y Hostetler 2004). Los análogos de lípidos usan la vía de los quilomicrones para la captación efectiva y son biodisponibles por vía oral (Kern et al., 2002; Keith et al., 2004; Painter y Hostetler 2004; Beadle et al., 2006; Lebeau et al., 2006). Se ha evaluado una gran serie de análogos de lípidos y se seleccionó el hexadeciloxipropil‐cidofovir, que posteriormente pasó a denominarse CMX001, para una evaluación avanzada (véase una lista parcial de las evaluaciones publicadas en el cuadro 4 de Smee, 2008). El CMX001 se analiza por separado en los apartados 6.6 y 6.9. 6.2.4 Inhibidores de deshidrogenasas de monofosfato de inosina Uno de los inhibidores de deshidrogenasas de monofosfato de inosina es la ribavirina, el primer análogo de nucleósido de amplio espectro (Sidwell et al., 1972). La ribavirina, junto con otros integrantes de esta clase de compuestos, presenta actividad in vitro contra el virus variolovacunal en los ratones y contra el virus de la viruela del conejo en los conejos. Sin embargo, no confirió protección alguna en el modelo de infección por el virus de la viruela símica en primates (Huggins, observaciones inéditas, 2001) cuando se la administró de forma profiláctica con la dosis, vía y pauta que conferían protección a los primates contra la infección por el virus Junin (McKee et al., 1988) y el virus Lassa (Jahrling et al., 1980; Stephen y Jahrling 1979). Otros análogos más nuevos, como la 5‐ fluoro‐1‐β‐D‐ribofuranosilimidazol‐4‐carboxamida (FICAR), la 5‐etinil‐1‐β‐D‐ ribofuranosilimidazol‐4‐carboxamida (EICAR), la tiazofurina (que presentó actividad contra el virus variólico in vitro) y el selenazol, presentaron actividad contra la infección por el virus de la viruela vacuna en los ratones (Huggins, observación inédita, 2003), pero no han sido evaluados en modelos en primates (en los cuales la ribavirina no dio resultado) y no se considera probable que sean eficaces. 6.2.5 Inhibidores de hidrolasas de la S-adenosilhomocisteína Se cree que los inhibidores de hidrolasas de la S‐adenosilhomocisteína inhiben los ortopoxvirus al inhibir un paso específico de la metilación de la caperuza (enzima que forma la caperuza del ARNm o guanililtransferasa del ARNm) que se requiere para la multiplicación vírica (véanse las estructuras en la figura 4 de De Clercq, 2001). Dos miembros de esta clase, la 3‐deazaneplanocina A y la 3‐deazaneplanocina A carbocíclica, se encuentran entre los inhibidores más activos del virus variólico (Baker, Bray y Huggins, 2003) y mostraron actividad contra la infección intranasal por el virus de la viruela vacuna (Baker, Bray y Huggins, 2003). Aunque ambos compuestos presentaron una actividad moderada en este modelo de infección (Huggins, resultados inéditos, 2003), no han sido sometidos a pruebas adicionales. 6.2.6 Inhibidores de decarboxilasas de orotidina-5’-monofosfato La pirazofurina, el prototipo de los inhibidores de las decarboxilasas de orotidina‐5’‐ monofosfato, es uno de los compuestos antivíricos más activos in vitro, pero es tóxica en los animales. Los extensos intentos de la química medicinal para separar la parte antivírica y la parte tóxica de la molécula han sido infructuosos. En consecuencia, este fármaco debería considerarse como un medicamento anticanceroso pero de gran toxicidad (Huggins, observación inédita del programa de evaluación de USAMRIID, 2001). 108 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 6.2.7 Inhibidores de sintasas de timidilato Aunque el virus variolovacunal no codifica una sintasa de timidilato, los inhibidores de sintasas de timidilato (compuestos 5‐sustituidos de una 2’‐desoxiuridina; véanse las estructuras en la figura 9 de De Clercq, 2001, y la actividad in vitro en el cuadro 1 de De Clercq, 2001) han mostrado actividad contra la infección de ratones por el virus variolovacunal mediante escarificación de la cola. El rápido catabolismo a metabolitos inactivos ha limitado el potencial de la 5‐yododesoxiuridina y los compuestos afines. Sin embargo, en fecha reciente, el análogo 4’‐tio (SRI‐21950) resolvió el problema de la inestabilidad metabólica y confirió una protección excelente contra la infección de ratones por virus variolovacunal o de la viruela vacuna (Kern et al., 2009). 6.2.8 Compuestos que interfieren en el ensamblaje del virus Algunos de los compuestos que bloquean pasos específicos del ensamblaje de ortopoxvirus son la rifampina y la N1‐isonicotinoil‐N2‐3‐metil‐4‐clorobenzoilhidracina (IMCBH). La rifampina interactúa con el polipéptido de 65 kilodaltones codificado por el gen D13L del virus variolovacunal (Sodeik et al., 1994), y la IMCBH interactúa con una proteína de 37 kilodaltones codificada por el gen F13L del virus variolovacunal, que es un componente de la envoltura externa del virus extracelular con envoltura o del virus extracelular (Schmutz et al., 1991). La rifampina bloquea la formación de la primera forma infecciosa del virus, llamada virus maduro intracelular o virus maduro, de modo que no se forma descendencia infecciosa. En cambio, la IMCBH evita que las partículas de virus maduro intracelular se envuelvan en una doble capa de membrana celular derivada de la red trans‐Golgi o de endosomas tempranos, modificada por la inserción de varias proteínas víricas. Aunque el bloqueo de la morfogénesis del virus en esta etapa no evita la formación de partículas infecciosas de virus maduro intracelular, impide el transporte del virus fuera de la célula y disminuye considerablemente su diseminación, que es mediada por virus extracelulares con envoltura o por virus extracelulares. En ViroPharma y USAMRIID se usó una prueba muy sencilla y de gran productividad para evaluar un tercio del millón de compuestos de su quimioteca, y de esta forma se encontraron varias clases de agentes activos. Se evaluó la actividad de los compuestos activos contra el virus de la viruela símica. Finalmente, tras una extensa labor de química medicinal (Bailey et al., 2007), se obtuvo un número limitado de candidatos, que fueron evaluados en lo que se refiere a su actividad contra el virus variólico (Yang et al., 2005). Se seleccionó el ST‐246 para las etapas avanzadas de obtención. En la revisión realizada por Smee hay una lista parcial de los modelos animales en los cuales el ST‐246 ha mostrado protección (véase el cuadro 4 de Smee, 2008). En los apartados 6.7 y 6.9 se describe el progreso adicional realizado en la obtención de este compuesto. 6.2.9 Cinasas de la familia Abl El Gleevec, aprobado para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica en los seres humanos, bloquea la salida de los ortopoxvirus de las células. Tras la infección de ratones con una dosis de virus variolovacunal que indujo una mortalidad del 70%, confirió protección y redujo en un factor de 100.000 el título de virus variolovacunal en los ovarios. Aunque estrictamente eso no constituye prueba de que confiera protección, 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 109 indica que el Gleevec y otros compuestos afines deberían ser objeto de evaluaciones adicionales (McFadden, 2005; Reeves et al., 2005). 6.2.10 Preparaciones inmunobiológicas La inmunoglobulina de virus variolovacunal de los seres humanos se usa para la profilaxis y el tratamiento de varias complicaciones de la vacunación. Sin embargo, como tiene todas las desventajas de una preparación a base de sangre donada, sería preferible usar anticuerpos recombinados humanos específicos contra los ortopoxvirus, en particular anticuerpos recombinados totalmente humanos (o monoclonales). Para producirlos, se combinan dominios variables de anticuerpos humanos que poseen la actividad buscada con dominios constantes de inmunoglobulinas humanas del isotipo necesario. La etapa decisiva para la obtención de anticuerpos recombinados totalmente humanos es la selección de dominios variables que determinan la especificidad, la afinidad y las propiedades biológicas de los anticuerpos. Una forma de producirlos consiste en seleccionar dominios variables de fagotecas combinatorias de minianticuerpos utilizando las cepas del virus variólico Ind3a y Butler. En estudios de seguimiento, 34 anticuerpos construidos en el Centro VECTOR fueron sometidos a pruebas a fin de determinar su capacidad para neutralizar la infectividad de las cepas del virus variólico Ind3a y Butler, y se encontraron cinco anticuerpos scFv capaces de neutralizar el virus variólico (Tikunova, datos inéditos, 2006). Se confirmó que los anticuerpos totalmente humanos construidos sobre la base de dominios variables de cuatro anticuerpos scFv se fijaron al virus variólico y a otros ortopoxvirus y neutralizaron el virus variólico en cultivos celulares. Será necesario evaluar estos anticuerpos en modelos animales de infección por el virus variólico. 6.2.11 Compuestos varios Se evaluó una serie de análogos de N1‐óxido de adenosina que presentan actividad contra el virus variolovacunal, tanto in vitro como tras la infección de ratones mediante escarificación de la cola (Kwong et al., 1998), para determinar su actividad contra el virus variólico y el virus variolovacunal in vitro (Huggins, datos inéditos, 2002). La correlación entre la potencia contra el virus variolovacunal y la potencia contra el virus variólico fue baja. Si se hubiera usado solamente la actividad contra el virus variolovacunal a fin de seleccionar un compuesto para continuar el trabajo de obtención, se habría seleccionado uno 40 veces menos activo que el más activo contra el virus variólico. Este es un ejemplo claro de los riesgos de recurrir demasiado a virus sustitutos, salvo que se sepa que los blancos son idénticos. 6.2.12 Compuestos cuya estructura no se revelará hasta una etapa avanzada de su obtención En los pasos iniciales de la búsqueda de compuestos con actividad contra ortopoxvirus participaron varios laboratorios con patrocinio estatal (Institutos Nacionales de Alergia y Enfermedades Infecciosas, USAMRIID y Centro VECTOR) que evaluaron un gran número de compuestos a fin de determinar su actividad contra ortopoxvirus sustitutos, y en ambos centros colaboradores de la OMS se evaluaron varios miles de compuestos a fin de determinar su actividad contra el virus variólico utilizando una prueba in vitro basada en cultivos celulares. Los resultados de estas pruebas fueron presentados al Comité Asesor de la OMS en Investigaciones sobre el Virus Variólico durante las reuniones 110 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 anuales (WHO, 2001, 2002). La mayoría de los compuestos no presentaron una actividad significativa contra el virus variólico y no fueron objeto de más evaluaciones. Muchos de los compuestos que fueron evaluados inicialmente para determinar su actividad contra el virus variólico tenían un número de identificación del proveedor, en vez de un nombre descriptivo basado en la clase química. Se ha revelado la estructura de todos los compuestos evaluados en modelos animales de infección por el virus variólico, incluidos los tres que se encuentran en la etapa de desarrollo clínico. Aunque la protección conferida por la patente varía según el país, en general dura solo un número determinado de años, y en varios países ese período comienza a contar a partir de la fecha en que se divulga la estructura del compuesto por primera vez. Eso puede tener consecuencias no deseadas, entre ellas dificultades para obtener un compuesto que no cuente con una patente clara. Esta consideración a veces lleva a la industria a no dar a conocer la estructura de los compuestos en desarrollo hasta justo antes del inicio de los ensayos con seres humanos (Huggins, resultados inéditos; US Institute of Medicine, 2009). 6.2.13 Método basado en la biología molecular para inhibir la multiplicación vírica, como la ribointerferencia La ribointerferencia es un mecanismo que las células usan normalmente para regular la expresión de los genes, incluida la supresión de ARN extraño (Fire et al., 1998). Para usar este mecanismo en la práctica a fin de inhibir la multiplicación vírica fue necesario esperar hasta que se idearan sistemas de administración que permitieran que la ribointerferencia y el ARN interferente pequeño sobrevivieran la inactivación en el torrente circulatorio durante su distribución a las células blanco (Nguyen et al., 2008). En fecha reciente, Alkhalil y colaboradores (2009) describieron la inhibición del virus de la viruela símica por ribointerferencia. Este campo nuevo está ampliándose con rapidez y bien podría proveer la nueva generación de medicamentos antivíricos. 6.3 Modelos animales de la viruela y de la viruela símica en primates La obtención de un modelo de infección por el virus variólico en primates ha resultado difícil. Los primeros trabajos, realizados en los años sesenta, no condujeron a un modelo aceptable (Hahon y Wilson, 1960; Hahon, 1961; Hahon y McGavran, 1961; Lancaster et al., 1966; Westwood et al., 1966), probablemente porque el virus variólico infecta de forma natural solo a los seres humanos. No se ha comprobado la infección natural de primates no humanos, y los modelos experimentales en primates no humanos se obtuvieron únicamente con la inoculación intravenosa de una dosis 100 000 veces mayor que la dosis calculada para los seres humanos. A fin de evaluar la viruela en animales, se crearon dos modelos de infección intravenosa de macacos de Java por virus variólico. En los seres humanos, la extensión (el número de lesiones) del exantema característico de la viruela y de la viruela símica está correlacionada con la gravedad de la enfermedad. Con el sistema de la OMS se clasifica la gravedad de la enfermedad según el número de lesiones pustulosas: la categoría normalizada «grave» generalmente está relacionada con una mortalidad elevada, mientras que las categorías «leve» y «moderada» generalmente se aplican a una enfermedad que no es letal (Jahrling y Huggins, 2005). La infección intravenosa con más de 107 unidades formadoras de placas (UFP) de virus de la viruela símica produjo un 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 111 modelo letal que reprodujo fielmente las lesiones exantemáticas características de la viruela y la viruela símica. En estudios similares con 108 UFP (2 × 109 genomas) de la cepa Harper del virus variólico se produjo una enfermedad similar con más de 1.000 lesiones (categoría grave de la OMS) y una mortalidad del 33% (los días 11 y 13) en macacos de Java, que es la misma mortalidad notificada en relación con la viruela humana. La decuplicación de la dosis de provocación de virus variólico (a 1 × 109 UFP o 2 × 1010 genomas) produjo una enfermedad con una letalidad aguda del 100% (media del tiempo hasta la muerte de 4 días) que se asemejaba más a la viruela hemorrágica. Los títulos víricos en los órganos en el momento de la muerte eran de 1000 a 10 000 veces superiores en los monos infectados con la décima parte de los virus (Jahrling et al., 2004; Rubins et al., 2004). La mortalidad en ambos modelos depende de la dosis infectante, que está correlacionada con el número de lesiones. Los autores de este capítulo postulan que la infección intravenosa produce una viremia secundaria artificial sin período de incubación que lleva a la rápida aparición de altas concentraciones del virus y al rápido inicio de la enfermedad. El motivo de preocupación para la salud pública es que se deberían usar criterios de diagnóstico realistas para el tratamiento de un gran número de casos a fin de definir la intervención terapéutica. Eso lleva a la selección del inicio del exantema, la enfermedad y las lesiones como momento apropiado para iniciar el tratamiento, según los síntomas clínicos. Sin embargo, a esa altura todos los órganos tienen una carga vírica considerable, de más de 106 genomas por gramo de tejido, cuando se inicia el tratamiento el día 4 después de la infección. Es necesario diseñar un ensayo que muestre la eficacia fundamental a fin de proporcionar datos independientes (es decir, que no dependan de otros estudios) que emulen, en la medida de lo posible, un estudio clínico de fase III con seres humanos, porque los revisores médicos usarán ese ensayo en vez de ensayos clínicos en seres humanos para determinar la eficacia del medicamento. En un informe del Instituto de Medicina de las Academias Nacionales, titulado Live variola virus considerations for continuing research [Consideraciones sobre el virus variólico para la continuación de las investigaciones], en el cuadro 4‐1 se señala que el modelo en primates no humanos es «sumamente útil para indicar los probables beneficios de los tratamientos y las vacunas experimentales contra la viruela en la población humana» (US Institute of Medicine, 2009). A fin de obtener autorización para incluir entre las indicaciones del medicamento la reducción de la mortalidad por la viruela, uno de los estudios fundamentales debe ser el modelo del virus de la viruela símica en primates. El único modelo animal del virus variólico obtenido hasta la fecha que se asemeja a la viruela presenta una letalidad del 33%, y el único laboratorio donde se pueden realizar investigaciones sobre el virus variólico no tiene cabida para un número suficiente de primates que permita obtener resultados estadísticamente significativos (el criterio para el diseño del estudio a fin de aumentar la confianza en los resultados sobre la base del tamaño de la muestra es que se necesitan 120 primates no humanos para una P = 0,05, en una prueba bilateral con una potencia estadística del 79%). Por lo tanto, a fin de lograr significación estadística, para probar la reducción de la mortalidad se debe usar el modelo de infección por el virus de la viruela símica en primates, que está estrechamente relacionado y causa una mortalidad superior al 90%. 112 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 6.4 Datos de seres humanos para validar modelos animales La viruela fue erradicada en una época en que la mayor parte de la metodología moderna que se usa en la actualidad para caracterizar la patogenia de la enfermedad todavía estaba en gestación. En consecuencia, hay pocos datos humanos que puedan compararse con los resultados de estudios de la patogenia realizados con macacos de Java infectados por virus variólico y de la viruela símica. La necesidad de esta información llevó a la USFDA a instar a la USAMRIID a que realizara un estudio clínico de la viruela símica humana, que actualmente es el pariente más cercano de la viruela, a fin de validar un modelo animal que cumpliera el requisito de la eficacia en animales. Este estudio se está llevando a cabo en el Hospital General de Referencia de Kolé, situado en el distrito de Sankuru, en la República Democrática del Congo, junto con el Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas de Kinshasa, del mismo país, y la USAMRIID (Huggins, comunicación personal, 2010). 6.5 Cidofovir intravenoso El cidofovir (Vistide) intravenoso ha sido aprobado por la USFDA para el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus humano en enfermos de sida. Este análogo de nucleósidos de moléculas pequeñas que inhibe selectivamente la polimerasa del ADN vírico mostró actividad uniforme contra 35 aislamientos de virus variólico seleccionados de forma tal que representaran la zona geográfica y el período más extensos que fuese posible (LeDuc et al., 2002). Redujo la multiplicación del virus variólico de 1000 a 100 000 veces en cultivos celulares (Baker, Bray y Huggins, 2003). Se investigó la eficacia del cidofovir para el tratamiento de la infección por el virus de la viruela vacuna en ratones BALB/c a fin de evaluar tratamientos nuevos para ortopoxvirosis virulentas en un modelo animal pequeño. Una inoculación intramuscular de 100 mg/kg de cidofovir el día de la infección intraperitoneal, el día 2 después de la infección por aerosol o el día 4 después de la infección intranasal condujo a una supervivencia del 90% al 100% en modelos que, de lo contrario, habrían sido uniformemente letales. El tratamiento el día 0 disminuyó los títulos víricos pulmonares entre 10 y 100 veces, redujo la gravedad de la neumonía intersticial vírica y previno la hemorragia pulmonar (Bray et al., 2000). Se usaron dos modelos en primates de profilaxis tras la exposición para demostrar la eficacia del medicamento. El primero era un modelo de lesión letal con el virus de la viruela símica, en el cual la evaluación de la eficacia del medicamento se basaba en la reducción de la mortalidad, el número de lesiones y la carga vírica. El segundo era un modelo de lesión del virus variólico, en el cual la evaluación de la eficacia del medicamento se basaba en la reducción del número de lesiones y la carga vírica. En ambos modelos, el tratamiento se inició 24 horas después de la infección, cuando la multiplicación llegó a más de 104 genomas/g de tejido en todos los órganos. A fin de determinar si se podía tratar eficazmente un modelo de lesión, se usó el modelo intravenoso letal del virus de la viruela símica, que se ajusta más al modelo del virus variólico tras la infección con 108 UFP, para mostrar que la profilaxis con cidofovir protegía por completo al animal. Los monos tratados con cidofovir no presentaron signos de enfermedad y se controló la multiplicación vírica en la sangre. En cambio, el animal tratado con placebo tenía más de 850 lesiones y una concentración del virus en la sangre superior a 107 genomas/ml, y murió el día 12. Los estudios con el virus de la viruela símica demostraron que, al duplicar la dosis de cidofovir (el cuádruplo de la dosis 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 113 aprobada para los seres humanos), se controló mejor la multiplicación vírica. Sin embargo, esta dosis más elevada no ha sido aprobada para el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus humano en los enfermos de sida. El cidofovir presenta un gran riesgo de nefrotoxicidad y requiere prehidratación intravenosa, la administración de probenecida e hidratación después de la administración intravenosa, lo cual podría representar una seria carga para los centros médicos durante un brote. Hay una controversia en torno a la posibilidad de que una dosis más alta sea tolerable, pero no se ha encontrado una población de pacientes que se beneficie lo suficiente de esta dosis mayor como para justificar su evaluación en seres humanos. Después se evaluó el cidofovir, a fin de determinar su actividad contra el virus variólico, en el modelo de profilaxis tras la exposición. Se administró tratamiento a grupos de tres macacos de Java los días 0, 1 o 2 y se compararon los resultados con los monos que recibieron placebo. Uno de los tres monos tratados con placebo (33%) murió y los tres enfermaron de gravedad. Ninguno de los monos tratados con cidofovir murió o enfermó de gravedad. El número de lesiones y la carga vírica fueron menores en todos los grupos tratados con cidofovir que en el grupo tratado con placebo (P < 0,01). Se usó el modelo de la viruela hemorrágica para demostrar la eficacia de la profilaxis con cidofovir, pero, debido a la índole abrumadora de la infección, el modelo de la viruela hemorrágica no es apropiado para determinar la eficacia del tratamiento para la viruela típica. Estos resultados demostraron que el cidofovir, administrado antes del inicio del exantema, pero no después (no se presentan datos), puede prevenir la mortalidad. Sin embargo, para obtener resultados óptimos se necesitó una dosis de 20 mg/kg. Aunque no se ha resuelto plenamente la equivalencia exacta de la dosis entre los seres humanos y los macacos de Java, es superior a la dosis de 5 mg/kg que ha sido aprobada para tratar la retinitis por citomegalovirus humano en los seres humanos. Los datos limitados que existen sobre la seguridad en los seres humanos indican que se podría tolerar la dosis de 10 mg/kg, pero los estudios para determinar la seguridad que habría que realizar no se justifican porque no hay una población de pacientes en la cual la dosis mayor sea suficientemente beneficiosa para compensar la mayor probabilidad de nefrotoxicidad. Por lo tanto, no hay forma de obtener los datos sobre la seguridad que se necesitan a fin de respaldar la aprobación de una dosis más alta. Cabe destacar que la intervención después de la aparición de las lesiones no dio resultado en estos modelos. Ambos podrían producir una enfermedad más grave que la viruela, especialmente porque su curso es más rápido, y es posible que el cidofovir sea un tratamiento eficaz para la viruela, pero los intentos de crear modelos sintomáticos pero menos graves con objeto de demostrar la eficacia después de la aparición de lesiones han sido infructuosos. 6.6 CMX001 oral El cidofovir se capta mediante pinocitosis y requiere una infusión intravenosa que puede causar nefrotoxicidad. El 1‐O‐hexadeciloxipropil‐cidofovir (HDP‐cidofovir, CMX001), que se examina en la sección 6.9, es un análogo de lípidos biodisponible por vía oral, y no se ha detectado nefrotoxicidad en estudios preclínicos de toxicidad ni en ensayos con seres humanos (Kern et al., 2002; Keith et al., 2004; Painter y Hostetler, 2004; Beadle et al., 2006; Lebeau et al., 2006). Desde un punto de vista mecanicista, la fracción de lípidos del CMX001 dicta las propiedades farmacocinéticas del medicamento en los órganos afectados, mientras que la actividad antivírica reside en los residuos de nucleótidos. En comparación con el cidofovir, que es captado en las células mediante procesos 114 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 ineficientes, el conjugado está diseñado para actuar como la lisofosfatidilcolina, utilizando vías naturales de captación de lípidos para alcanzar concentraciones intracelulares elevadas. Una vez dentro de las células blanco, la cadena lateral de lípidos del CMX001 se escinde, supuestamente debido a la acción de la fosfolipasa C, produciendo cidofovir libre. La conversión del cidofovir en difosfato de cidofovir, el principio antivírico activo, se produce por medio de un proceso de fosforilación de dos pasos catalizado por cinasas anabólicas intracelulares. El difosfato de cidofovir ejerce sus efectos antivíricos en el interior de las células, actuando como potente inhibidor alternativo del sustrato de la síntesis de ADN vírico. Se ha caracterizado la actividad del CMX001 contra los ortopoxvirus in vitro e in vivo, en ratones, conejos y primates no humanos. La potencia in vitro del CMX001 contra el virus variólico es de 0,1 µM, y es de 0,5 a 0,9 µM contra el virus de la viruela vacuna, el virus variolovacunal, el virus de la ectromelia y el virus de la viruela del conejo (Hostetler, 2009). En los ratones, el CMX001 previene la mortalidad tras la infección intranasal con un inóculo letal de virus de la ectromelia, virus de la viruela vacuna, virus variolovacunal o virus de la viruela símica cuando se lo administra varios días después de la infección. Las dosis eficaces se sitúan en la gama de 1 a 20 mg/kg una vez al día durante cinco días. Una sola dosis de 20 a 100 mg/kg también es eficaz en algunos casos. En un modelo en conejos, el CMX001 también previno la mortalidad tras la infección letal por el virus de la viruela del conejo. Las dosis eficaces se situaron entre 1 mg/kg dos veces al día durante cinco días y 20 mg/kg una vez al día durante cinco días. Una sola dosis de 20 mg/kg también es eficaz en algunos casos. En un estudio aleatorizado reciente, con enmascaramiento y con testigos tratados con placebo, de conejos infectados por el virus de la viruela del conejo, en el cual se inició el tratamiento después de la aparición de las lesiones, tres dosis de 20 mg/kg administradas en días alternos (dosis total de 60 mg/kg) confirieron una protección estadísticamente significativa contra la mortalidad después de la inoculación intradérmica en conejos de una dosis letal de virus de la viruela del conejo (11 conejos de 12 sobrevivieron en el grupo que recibió CMX001, en comparación con 2 conejos de 12 en el grupo tratado con placebo). Debido a las diferencias del metabolismo y la exposición al CMX001 en primates no humanos, los estudios del CMX001 en macacos de Java no son pertinentes para los seres humanos. Sin embargo, se ha comprobado que el cidofovir es eficaz en modelos de infección en monos, y tanto el cidofovir como el CMX001 suministran el mismo compuesto antivírico activo (difosfato de cidofovir). Por ejemplo, los monos quedaron protegidos contra la mortalidad después de una inoculación intravenosa letal de virus de la viruela símica cuando se administró cidofovir en una dosis de 20 mg/kg los días 1, 6 y 11 después de la infección. De los 8 monos que recibieron cidofovir, 7 sobrevivieron, en comparación con 1 de los 8 del grupo que recibió placebo (Huggins, resultados inéditos, 2004). En general, los estudios combinados del CMX001 y el cidofovir en animales muestran que estos compuestos son eficaces contra varias ortopoxvirosis in vivo como tratamiento antes de la exposición y como tratamiento de la enfermedad sintomática después de la exposición (es decir, después de la aparición de lesiones). Asimismo, el cidofovir intravenoso puede usarse para elaborar un modelo de exposición eficaz a difosfato de cidofovir en primates no humanos, en el cual, debido a las diferencias metabólicas, no es posible hacer una evaluación directa del CMX001. Hay que determinar la exposición 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 115 general al CMX001 o al cidofovir, así como la concentración de difosfato de cidofovir en los leucocitos mononucleares de la sangre periférica con la dosis y la pauta eficaces. Los estudios propuestos se realizarán con conejos infectados por el virus de la viruela del conejo y tratados con CMX001 administrado por vía oral, y con macacos de Java infectados por el virus de la viruela símica y el virus variólico y tratados con cidofovir administrado por vía intravenosa. Los datos farmacocinéticos relacionados con el CMX001 o con el cidofovir, así como las concentraciones intracelulares de difosfato de cidofovir en los leucocitos mononucleares de la sangre periférica de conejos y monos sanos e infectados, se usarán para determinar la dosis eficaz en los seres humanos. En estos, la concentración de difosfato de cidofovir en los leucocitos mononucleares de la sangre periférica se determinará después de variar las dosis de CMX001. Para el tratamiento de la viruela en los seres humanos, la dosis eficaz de CMX001 y el intervalo de dosificación mantendrán una concentración de difosfato de cidofovir en los leucocitos mononucleares de la sangre periférica igual o superior a la concentración eficaz (determinada en los modelos animales) durante un período correspondiente al curso normal de la viruela. El CMX001 se absorbe bien en los seres humanos, de modo que se alcanzan concentraciones elevadas del medicamento en el plasma. Un paciente con infección progresiva por el virus variolovacunal fue tratado eficazmente con un régimen que incluyó CMX001. Se puede encontrar información detallada sobre este caso en el sitio web de Morbidity and Mortality Weekly Review13. Actualmente, se están realizando estudios clínicos de fase II en seres humanos con el CMX001 para el virus BK y el citomegalovirus humano. Hasta la fecha, se ha administrado a más de 80 voluntarios sanos y pacientes en tres ensayos clínicos, sin que se hayan producido eventos adversos graves relacionados con el medicamento. 6.7 ST-246 oral El ST‐246 (tecovirimat) es un compuesto de molécula pequeña que es potente, selectivo y activo contra varios ortopoxvirus, entre ellos el virus de la viruela símica, el virus de la viruela de los camellos, el virus de la viruela vacuna, el virus de la ectromelia y el virus variólico (Yang et al., 2005; Bailey et al., 2007). El medicamento actúa sobre un gen (el V061 del virus de la viruela vacuna, el F13L del virus variolovacunal o el C17L del virus variólico Bangladesh [marco de lectura abierto 040]) que codifica una proteína importante de la envoltura (p37) que se encuentra en la membrana externa del virus extracelular con envoltura. Esta proteína es necesaria para la producción de virus extracelular. La presencia del ST‐246 inhibió la formación de placas y los efectos citopáticos inducidos por el virus. Además, la formación de virus extracelular se redujo 158 veces, mientras que la producción de virus maduro intracelular disminuyó en un factor de 11 en pruebas de rendimiento del virus en las cuales se usó una multiplicidad de infección baja. El ST‐246 no causó un defecto en la producción de virus maduro intracelular. Sin embargo, como no se formó virus extracelular con envoltura, la propagación del virus a las células que no estaban infectadas fue menor. El tratamiento 13 116 http://www.cdc.gov/mmwr/ Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 con ST‐246 no influye en la formación de partículas de virus maduro intracelular ni en su estructura, vistas mediante microscopia electrónica de transmisión. In vivo, la administración oral de ST‐246 protegió a ratones BALB/c contra la infección letal después de la inoculación intranasal de 10 × DL50 de virus variolovacunal (cepa J del Departamento de Salud Internacional). Los ratones tratados con el medicamento que sobrevivieron la infección adquirieron inmunidad protectora y resistieron la provocación subsiguiente con una dosis letal (10 × DL50) de virus variolovacunal (Yang et al., 2005). El ST‐246, en una dosis de 50 mg/kg dos veces al día, protegió a ratones ANC/R contra la infección letal después de la inoculación intranasal de 40.000 × DL50 de virus de la ectromelia. Los títulos víricos infecciosos en el hígado, el bazo y los pulmones el día 8 después de la infección eran inferiores a los detectables (<10 UFP/ml) en los animales tratados con ST‐246. En cambio, los títulos víricos medios en tejido del hígado, el bazo y los pulmones de ratones tratados con placebo eran de 6,2 × 107, 5,2 × 107 y 1,8 × 105 UFP/ml, respectivamente. La administración oral de ST‐246 inhibió la lesión de la cola inducida por el virus variolovacunal en ratones NMRI a los cuales se inoculó el virus en la vena de la cola. La administración oral de ST‐246 también confirió protección contra una provocación letal con virus de la viruela símica hasta 3 días después de la infección en el modelo de la ardilla terrestre listada (Sbrana et al., 2007). En conjunto, estos resultados validan la proteína p37 como blanco antivírico y demuestran que un inhibidor de la formación de virus extracelular con envoltura puede proteger a los ratones contra la enfermedad provocada por ortopoxvirus. Se ha otorgado a SIGA Technologies la clasificación de medicamento experimental nuevo y vía rápida para el ST‐246, en vista del perfil de gran seguridad preclínica del medicamento. (Con la clasificación de vía rápida, se pueden presentar datos de ensayos clínicos a la USFDA en cuanto están disponibles, en vez de hacerlo al final de los estudios.) Se evaluó el ST‐246 oral a fin de determinar su actividad profiláctica contra la infección de macacos de Java por el virus variólico tras la exposición, ya que esta infección se asemeja mucho a la viruela humana. El grupo que recibió placebo presentó un cuadro típico de la enfermedad, con más de 1250 lesiones pustulosas y una mortalidad del 33%. La administración por sonda gástrica de ST‐246 se inició 24 horas después de la infección en el grupo que recibió tratamiento, cuando la médula ósea, el bazo, algunos ganglios linfáticos y el hígado presentaban más de 108 genomas/g y todos los tejidos tenían entre 104 y 106 genomas/g. El tratamiento eliminó la enfermedad, a juzgar por una ausencia total de formación de lesiones (el mejor factor pronóstico de la gravedad de la enfermedad variólica en los seres humanos) y la falta de datos clínicos o de laboratorio importantes. Los títulos víricos en la sangre no aumentaron respecto del nivel anterior al tratamiento (106 genomas/ml) y el virus fue eliminado en 6 días, en comparación con 16 días en los animales que recibieron placebo (según datos anteriores) (Huggins et al., 2009). Después se evaluó el ST‐246 en lo que respecta a la infección de macacos de Java por el virus de la viruela símica, que se asemeja mucho a la viruela humana. El grupo que recibió placebo presentó un cuadro típico de la enfermedad, con más de 1500 lesiones pustulosas y una mortalidad del 100%. La administración por sonda gástrica de ST‐246 se inició 24 horas después de la infección, cuando la médula ósea, el bazo, algunos ganglios linfáticos y el hígado presentaban más de 107 genomas/g y todos los tejidos tenían entre 105 y 106 genomas/g. El tratamiento eliminó la enfermedad, a juzgar por una ausencia 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 117 total de formación de lesiones y la falta de datos clínicos o de laboratorio importantes. Los títulos víricos en la sangre no aumentaron respecto del nivel anterior al tratamiento y el virus fue eliminado en 4 días, en comparación con 16 días en los animales que recibieron placebo o en los animales tratados con cidofovir intravenoso (según datos anteriores). En otro experimento, la administración por sonda gástrica de ST‐246 se inició 3 días después de la infección, cuando la médula ósea, el bazo, algunos ganglios linfáticos y el hígado presentaban más de 108 genomas/g y todos los tejidos tenían más de 106 genomas/g. También en este caso, el tratamiento eliminó la enfermedad, a juzgar por una ausencia total de formación de lesiones en dos de los tres monos y menos de 5% de lesiones testigo en el otro mono (estas lesiones no empeoraron), así como la falta de datos clínicos o de laboratorio importantes. Los títulos víricos en la sangre no aumentaron respecto del nivel anterior al tratamiento y el virus fue eliminado en 6 días, en comparación con 16 días en los animales que recibieron placebo (Jordan et al., 2009). El ST‐246, a la dosis símica de 10 mg/kg (que equivale a la dosis propuesta para los seres humanos), puede usarse para tratar eficazmente la viruela símica después de la aparición de lesiones. En los estudios iniciales se usó una dosis de 300 mg/kg, con resultados incluso más notables. El ST‐246 fue seleccionado entre análogos afines tras una extensa labor para optimizar la potencia y la estabilidad del compuesto en pruebas de metabolismo hepático S9. La unión del compuesto a las proteínas fue moderada (alrededor del 80% en seres humanos y del 88% en ratones y monos, de 0,03 µM a 50 µM). La absorción, que redujo la biodisponibilidad al 30%, aproximadamente, limitó la exposición. En vista de estas limitaciones, la potencia del compuesto es sumamente importante para su eficacia. La unión a proteínas, la absorción y la excreción de compuestos de moléculas pequeñas varían de una especie a otra y eso puede tener efectos extraordinarios sobre la eficacia en modelos animales, limitando así su valor predictivo para los seres humanos. Los problemas imprevistos que surgen de estas diferencias son ejemplos concretos de la razón por la cual es posible que la actividad en un modelo en roedores pequeños no conduzca a un producto clínico útil. 6.8 Efecto de la administración de medicamentos antivíricos en la protección vacunal 6.8.1 Cidofovir y Dryvax Se ha examinado el efecto de la coadministración de cidofovir y Dryvax en ratones y monos. En macacos de Java, la coadministración de una sola dosis de cidofovir (20 mg/kg) y Dryvax redujo la carga de virus variolovacunal y los eventos adversos causados por Dryvax en comparación con la vacuna sola. Sin embargo, el cidofovir también redujo la inmunidad, medida sobre la base de respuestas humorales o celulares, y disminuyó la protección contra una provocación con virus de la viruela símica (sobrevivieron 2 de los 6 macacos de Java que recibieron placebo, los 6 que recibieron Dryvax y 5 de los 6 que recibieron cidofovir más Dryvax) (Wei, 2009). En los casos en que se coadministraron Dryvax y cidofovir (12,5 mg/kg) a ratones A/NCR, las lesiones fueron más pequeñas y se curaron con mayor rapidez que en los casos en que se usó la vacuna sola. Igual que en el estudio con monos, la respuesta de anticuerpos se redujo, pero a diferencia de lo que ocurrió en dicho estudio, no se produjo una disminución perceptible de la protección contra la provocación con un ortopoxvirus heterólogo (virus de la ectromelia). Estos datos muestran de manera uniforme una disminución de los títulos de 118 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 anticuerpos cuando se administra cidofovir junto con Dryvax, como cabría suponer cuando un medicamento que inhibe la multiplicación vírica en una etapa temprana del ciclo biológico se combina con una vacuna que requiere varias rondas de multiplicación con los inóculos habituales. Se planea realizar estudios para evaluar el CMX001 y la vacuna de virus variolovacunal Ankara modificado (IMVAMUNE), que se administra en una dosis elevada, ya que este virus no se multiplica en las células humanas. 6.8.2 Efectos del tratamiento con ST-246 (tecovirimat) en la protección conferida por las vacunas Dryvax y ACAM2000 Se ha comprobado que la eficacia de las vacunas Dryvax y ACAM2000 no se altera por el tratamiento con ST‐246 administrado en el momento de la vacunación. Se vacunó a ratones inmunocompetentes normales con Dryvax (Grosenbach et al., 2008) o ACAM2000 (Berhanu et al., 2010), usando la dosis y la vía normalizadas para los seres humanos, y se administró tratamiento con ST‐246 justo después de la vacunación. La gravedad de las lesiones inducidas por la vacuna y el tiempo que tardaron en resolverse se redujeron con el tratamiento con ST‐246. Asimismo, la liberación de virus a partir de la lesión fue menor (Berhanu et al., 2009). Es posible que el tratamiento con ST‐246 haya reducido ligeramente las respuestas inmunitarias humorales, pero las respuestas inmunitarias celulares parecían ser ligeramente mayores. Los animales que fueron vacunados y tratados con ST‐246 quedaron igualmente protegidos contra una provocación letal posterior en experimentos de corta y larga duración, lo cual demostró claramente que el ST‐246 no menoscaba la eficacia de la vacuna. En una serie de experimentos complementarios, varios modelos murinos de inmunodeficiencia fueron vacunados con ACAM2000, usando la dosis y la vía normalizadas para los seres humanos, y después fueron tratados con ST‐246 (Berhanu et al., 2010). El ST‐246 fue eficaz en todos los modelos, excepto los que carecían por completo de respuestas inmunitarias celulares (deficiencia combinada de linfocitos CD4+ y CD8+). El ST‐246 redujo la reactogenicidad de la vacuna y el tiempo necesario para que la lesión causada por la vacuna se resolviera. La liberación de virus en el sitio de la lesión también se redujo con el tratamiento con este medicamento. En modelos con inmunodeficiencias parciales, los animales fueron vacunados sin riesgo y resistieron una provocación letal posterior en experimentos de corta y larga duración. Eso demostró que, incluso en casos de inmunodeficiencia parcial, el ST‐246 aumenta la seguridad de la vacuna y al mismo tiempo induce respuestas inmunitarias robustas que permiten resistir una provocación letal. 6.9 Medicamentos en desarrollo clínico En un informe del Instituto de Medicina de las Academias Nacionales, titulado Live variola virus considerations for continuing research [Consideraciones sobre el virus variólico para la continuación de las investigaciones], se llega a la conclusión de que «la razón más contundente para la conservación a largo plazo de reservas de virus variólico vivo es su función esencial en la selección y la obtención de agentes antivíricos que puedan usarse en previsión de un gran brote de viruela» (US Institute of Medicine, 2009). Aunque se han encontrado numerosos compuestos que inhiben la multiplicación de ortopoxvirus en varios sistemas de prueba in vitro (incluida la evaluación limitada de su 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 119 actividad contra el virus variólico), se ha evaluado un número menor en modelos en roedores pequeños, generalmente ratones. Los modelos animales de infección por ortopoxvirus, en su mayoría murinos, que se han usado para evaluar compuestos fueron examinados recientemente por Smee (Smee, 2008). De estos modelos se puede obtener información útil, pero son solo el primer paso del largo y complicado proceso de varios años de duración para obtener la aprobación de un medicamento. La mayoría de los compuestos que muestran protección en los primeros modelos animales tropiezan con algún problema debido al cual no llegan a ser un medicamento eficaz: toxicidad excesiva, inactivación metabólica, imposibilidad de alcanzar una concentración suficiente en los tejidos blanco, inviabilidad económica de la producción y muchos otros posibles problemas. Hasta la fecha, tres compuestos han sido sometidos a un trabajo de desarrollo suficiente para que puedan evaluarse en seres humanos de conformidad con una solicitud de clasificación como medicamento experimental nuevo: el cidofovir, medicamento que fue aprobado para la retinitis por citomegalovirus humano; el CMX001, un profármaco lípido del cidofovir; y el ST‐246. Los tres presentan actividad en una gama de modelos en roedores pequeños con ortopoxvirus sustitutos, y tanto el cidofovir como el ST‐246 han conferido protección en los modelos en primates de infección por el virus variólico. Sin embargo, ninguno ha sido aprobado para el tratamiento de la viruela, ya que las evaluaciones requeridas no han concluido. Como realizar ensayos clínicos usando el virus de la viruela sería contrario a la ética, la USFDA tuvo que adoptar un nuevo enfoque para la aprobación de medicamentos que permite evaluar su eficacia en modelos animales: las normas relativas a las pruebas con animales. De acuerdo con estas normas, los estudios con modelos animales son sometidos a exámenes de la misma intensidad y al mismo grado de escrutinio científico que los ensayos clínicos en seres humanos para respaldar la aprobación de productos para otros tipos de indicaciones utilizando otras vías aprobadas. El Centro de Evaluación e Investigaciones Farmacológicas de la USFDA no ha visto ningún argumento contundente de que pueda justificarse una indicación para la viruela sin datos relativos al virus variólico. Eso significa que la USFDA posiblemente no autorice un medicamento contra la viruela si no recibe datos sobre su eficacia contra el virus variólico en modelos animales. Debido a la historia singular y la virulencia del virus variólico, las vías para la aprobación de indicaciones para la viruela no son claras ni uniformes ni siquiera con un modelo de provocación con virus variólico. Los organismos de reglamentación de otros países han proporcionado incluso menos orientación formal. Algunos patrocinadores pueden optar por continuar el trabajo de desarrollo de su producto para otra enfermedad o trastorno, manteniendo la clasificación de medicamento experimental nuevo o su equivalente para el uso de ese producto contra la viruela. Sin embargo, el uso de un medicamento experimental nuevo durante una situación de emergencia plantea complicaciones adicionales, incluso de índole logística. A fin de abordar en parte estos problemas, la USFDA ha aprobado un proceso de autorización del uso en situaciones de emergencia, pero todavía se está determinando la forma en que se pondría en práctica. La USFDA también ha publicado un proyecto de orientación (USFDA, 2007) sobre el uso de las normas relativas a las pruebas con animales. Sin embargo, debido principalmente 120 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 a la falta de conocimientos pormenorizados sobre la viruela humana, la USFDA todavía no ha determinado si algunos modelos animales de viruela son adecuados en el marco de esta normativa. Todo medicamento que se apruebe de conformidad con estas normas debe cumplir los demás requisitos para el otorgamiento de licencias, en particular la demostración de su seguridad en los seres humanos. Salvo que el medicamento pueda usarse también para tratar enfermedades que no sean causadas por ortopoxvirus, debe ser sometido a pruebas en voluntarios sanos. Eso se puede hacer solamente con medicamentos que tengan efectos colaterales insignificantes, ya que los sujetos de los experimentos no recibirán ningún beneficio. Este requisito limita considerablemente los medicamentos experimentales que pueden obtenerse. Aunque se puede tolerar cierta toxicidad al tratar a un paciente de viruela que corre un riesgo de mortalidad del 30%, esa consideración no es pertinente para las pruebas de seguridad en sujetos sanos. 6.10 Cronología de la obtención de tratamientos para la viruela Se debe aplicar las normas relativas a las pruebas con animales a fin de evaluar la eficacia de todos los tratamientos antivíricos para la viruela, pero exigir una evaluación de la eficacia solo en animales evidentemente no es un atajo para obtener la aprobación de un medicamento. En realidad, complica más la aprobación, porque las comprobaciones científicas en que se basa la reglamentación todavía están evolucionando. Como hasta la fecha se han evaluado solamente dos medicamentos de acuerdo con las normas relativas a las pruebas con animales, sería demasiado prematuro calcular los tipos y el número de estudios que se necesitarán para determinar la eficacia de un tratamiento para la viruela. Hay que resolver muchos problemas científicos a fin de responder a estas preguntas, y eso introduce incertidumbre con respecto al tiempo que se necesitará a fin de obtener la aprobación de un medicamento para la viruela. Subsiste una gran incertidumbre con respecto a la combinación de datos obtenidos de pruebas in vitro y de modelos animales que sea suficiente para demostrar la eficacia. Los organismos de reglamentación asesoran sobre los tipos de estudios que podrían ser útiles para evaluar un fármaco candidato, pero les resulta difícil proporcionar orientación precisa. En cambio, piden al patrocinador del medicamento que presenten un plan de desarrollo clínico para su examen. En algunos campos en los cuales se han aprobado varios productos para tratar una enfermedad determinada, hay una hoja de ruta más clara para obtener la aprobación. Sin embargo, fuera de la orientación pública de la USFDA a la industria, los talleres y las reuniones a puerta cerrada de la USFDA con el patrocinador sobre un medicamento específico (que generalmente no se dan a conocer al público), no hay ninguna experiencia que nos permita predecir una cronología. La mayoría de los demás organismos equivalentes proporcionan incluso menos orientación. Cada país tendrá que aprobar el uso de un medicamento dentro de sus fronteras. A la larga, incumbe al patrocinador preparar un plan de desarrollo clínico, que guía la documentación que debe presentarse para demostrar adecuadamente la seguridad y la eficacia del producto en cuestión. A fin de facilitar este proceso, la USFDA ha publicado un proyecto de orientación para la industria, titulado Guidance to industry, en relación con el tratamiento para la viruela. La USFDA convocará un «Grupo Asesor de la USFDA», integrado por expertos técnicos, que ayude a determinar la combinación de modelos animales que se necesitará con objeto de reemplazar los ensayos clínicos en seres humanos en los estudios para demostrar la eficacia en un modelo de provocación con 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 121 virus variólico. Estos ensayos deben estar «bien controlados». En los estudios con animales, eso significa que deben ceñirse a las prácticas adecuadas de laboratorio, cuyo cumplimiento en un medio con nivel de bioseguridad 3 para el virus de la viruela símica es difícil pero posible (Huggins, datos inéditos, 2008). Sin embargo, es posible que no resulte práctico cumplir todas las normas en materia de prácticas adecuadas de laboratorio al realizar estudios de fármacos con virus variólico en condiciones de bioseguridad 4, debido a las restricciones impuestas por el trabajo en un «traje espacial» protector. Debido al gran número de incógnitas, es posible que en cualquier momento se requieran estudios adicionales con virus variólico vivo que por ahora no podemos prever hasta que se obtenga la aprobación definitiva del medicamento. De acuerdo con las normas vigentes de la USFDA, el material de estudios cruciales debe conservarse durante dos años después de la aprobación del medicamento a fin de que se pueda hacer otra evaluación si surgen problemas durante el uso clínico. No se sabe de qué forma se aplicaría esta norma a un medicamento antivariólico. La experiencia de la industria muestra que los medicamentos que inician los estudios de la fase I tienen una probabilidad del 10% al 25% de recibir aprobación, y este proceso generalmente lleva entre cinco y ocho años más. En vista de estas limitaciones, es notable que tres medicamentos hayan recibido la clasificación de medicamento experimental nuevo para el tratamiento de la viruela y que dos compañías estén trabajando con la USFDA en la elaboración de una hoja de ruta para la aprobación de medicamentos. Desde un punto de vista realista, la aprobación probablemente llevará por lo menos entre 5 y 10 años, incluso si todos los estudios son fructíferos. Sin embargo, es crucial que se realicen estudios adecuados, no solo para obtener la aprobación regulatoria necesaria con objeto de vender un medicamento, sino también para que los funcionarios de salud pública cuenten con suficiente información para asignar los escasos recursos destinados a la atención de salud de forma tal que surtan el mayor efecto posible en la contención de una epidemia y la reducción al mínimo de la mortalidad y morbilidad de los casos clínicos. A fin de obtener esta información posiblemente se necesiten estudios adicionales, en particular para extrapolar los beneficios del tratamiento observados en modelos animales a los probables beneficios para los seres humanos y determinar las probables repercusiones en los recursos médicos necesarios. 6.11 Análisis final No hay tratamientos antivíricos, ni siquiera medicamentos experimentales nuevos, para muchas virosis, entre ellas el catarro común, que ofrezcan un potencial enorme de rentabilidad para un medicamento eficaz. Eso es prueba clara de que el proceso de obtención de medicamentos antivíricos es difícil. Es notable que tres fármacos candidatos hayan recibido la clasificación de medicamento experimental nuevo para el tratamiento de enfermedades causadas por ortopoxvirus y que los tres se hayan usado para tratar eventos adversos relacionados con la vacunación con virus variolovacunal. Ninguno se ha usado para tratar la infección por el virus de la viruela símica en seres humanos y se necesita más información sobre su seguridad para que se pueda investigar su uso sin riesgos en zonas alejadas donde se está transmitiendo la viruela símica. 122 Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Hay un número mucho mayor de compuestos prometedores que no han avanzado tanto en el proceso de obtención. Cientos de compuestos presentan actividad en pruebas basadas en cultivos celulares y más de una docena se encuentran en la etapa de evaluación inicial en modelos en roedores pequeños. Se podría argumentar que es crucial continuar el trabajo con estos compuestos, junto con la tarea de descubrimiento de métodos nuevos para inhibir la multiplicación vírica. La experiencia de la industria muestra que todavía no podemos predecir si alguno de los tres medicamentos experimentales nuevos será aprobado por las autoridades de reglamentación y que, por lo tanto, deberíamos continuar y ampliar las investigaciones con el propósito de obtener más fármacos candidatos para el tratamiento de la viruela. Eso debería incluir una labor de descubrimiento de medicamentos con ortopoxvirus sustitutos, la evaluación de compuestos prometedores contra el virus variólico y, mucho más tarde en el proceso de desarrollo, después que se haya establecido el equivalente en los primates de la dosis propuesta para los seres humanos, la evaluación de la eficacia en modelos en primates de infección por el virus variólico, iniciada cuando el diagnóstico clínico y el tratamiento sean factibles. Actualmente no se puede predecir durante cuánto más tiempo será necesario trabajar con virus variólico vivo. Sin embargo, ciertamente será necesario hasta que se aprueben por lo menos dos medicamentos para el tratamiento de la viruela clínica. La USFDA ha señalado en varias ocasiones que no considera posible una vía para la aprobación de medicamentos que no requiera datos sobre la eficacia en un modelo de provocación con virus variólico. Como no se pueden hacer ensayos clínicos contra la viruela en seres humanos, a fin de demostrar la eficacia se debe aplicar las normas de la USFDA relativas a las pruebas con animales (US 21CRF310.610) u otros procedimientos establecidos por los organismos de reglamentación de otros países para la aprobación en su territorio. En vista de las incertidumbres en torno a los aspectos prácticos de estas normas, debido a que se han usado poco hasta la fecha, y de que actualmente no hay un medicamento aprobado para la viruela, es difícil dar una idea segura de la cronología o los datos necesarios para la aprobación por la USFDA. La aprobación en otros países es por lo menos igualmente incierta. Abreviaturas ADN ácido desoxirribonucleico ARNm ácido ribonucleico mensajero CMX001 HDP‐cidofovir, 1‐O‐hexadeciloxipropil‐cidofovir HPMPC cidofovir IMCBH N1‐isonicotinoil‐N2‐3‐metil‐4‐clorobenzoilhidracina OMS Organización Mundial de la Salud UFP unidad formadora de placas 6. Obtención de medicamentos antivíricos para el tratamiento de la viruela 123 124 USAMRIID División de Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigaciones Médicas del Ejército de Estados Unidos USFDA Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos Examen científico de las investigaciones sobre el virus variólico, 1999–2010 Referencias Alkhalil A et al. (2009). Inhibition of monkeypox virus replication by RNA interference. Virology Journal, 6:188. Bailey TR et al. ( 2007). N‐(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a‐Octahydro‐1,3‐dioxo‐4,6‐ ethenocycloprop[f]isoindol‐2‐(1H)‐yl)carboxamides: identification of novel orthopoxvirus egress inhibitors. 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