1 TP Nº8 ECOLOGIA MICROBIANA Columna de Winogradsky y

TP Nº8
ECOLOGIA MICROBIANA
Columna de Winogradsky y Ciclo del Azufre
Objetivos:
a) Efectuar el seguimiento del desarrollo de un ecosistema acuático a partir de las observaciones y el
estudio de la columna de Winogradsky.
b) Identificar los diversos grupos bacterianos involucrados en el ciclo del S0.
c) Interpretar desde un punto de vista ecológico las interacciones existentes en el nicho que es objeto
de estudio.
Construcción de la columna de Winogradsky:
Materiales:
- Tubos de vidrio de aprox. 50cm de longitud
- Fuente de luz incandescente
- SO4Ca, CO3Ca y PO4HK2
- Papel de Filtro o Residuos Vegetales
- Fango proveniente de pantano, zanja o río con aguas estancadas, como fuente de inóculo
Procedimiento: Se montarán 2 columnas de Winogradsky (columnas A y B). Para cada una se realizará
lo siguiente:
1) Colocar 400g del inóculo en el interior de la columna tratando de no removerlo en exceso al efectuar la
operación.
2) Adicionar: 4g de CO3Ca
4g de SO4Ca
4g de PO4HK2
trozos de papel de filtro o papeles vegetales
3) Completar con agua de red hasta aprox. la 3/4 partes del tubo, vertiéndola suavemente sobre las
paredes. Controlar periódicamente el nivel de agua durante el transcurso de la experiencia (verificar que
no queden atrapadas burbujas de aire). Luego tapar la columna con tapones de algodón. Cubrir la
columna con papel de aluminio evitando que reciba luz durante el lapso de una semana.
4) Al término de este periodo descubrir la columna A y exponerla a una fuente de luz dejando la columna
B tapada. Incubar ambas columnas a T° ambiente (20-22°C). Tomar nota de los cambios observados en la
columna A durante todo el experimento para su posterior interpretación.
Identificación de los diversos grupos microbianos involucrados en el ciclo de S 0
Géneros de microorganismos que participan en el ciclo del S0:
Desulfovibrio: Bacteria reductora de SO42-. Anaerobia obligada. Reductora del H2S a partir del SO42mediante respiración.
Desulfotomaculum: Bacteria esporogena reductora del SO42-. Anaerobia obligada. Reductora del H2S
a partir del SO42- mediante respiración.
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Chromatium: Bacteria púrpura del S. Anaerobia obligada y fotodependiente. Oxida H 2S a H2SO4
mediante fotosíntesis anoxigénica.
Chlorobium: Bacteria verde del S. Anaerobia obligada y fotodependiente. Oxida H 2S a H2SO4
mediante fotosíntesis anoxigénica.
Rhodospirillum: Bacteria púrpura no del S. Anaerobia, microaerófila o aerobia. Usa compuestos
orgánicos tanto para efectuar fotosíntesis en ausencia de O2, como para efectuar respiración en su
presencia. Puede usar fotosintéticamente bajas concentraciones de H 2S oxidándolo a SO42- sin formar S0
como intermediario.
Chloroflexus: Bacteria verde no del S. Descubierta recientemente, se asemeja por sus propiedades
metabólicas y nutricionales a las rojas no sulfureas.
Beggiatoa: Bacteria deslizante oxidadora del H2S. Aeróbica o microaerofílica. Oxida H2S a SO42dando como intermediario al S0 por medio de metabolismo respiratorio.
Thiothrix: Bacteria no-deslizante oxidadora del H2S. Aeróbica o microaerofílica. Oxida H2S a SO42dando como intermediario al S0 por medio de metabolismo respiratorio.
Thiobacillus: Bacteria oxidadora del H2S y otros compuestos del S. Aeróbica. El producto final de la
oxidación es el H2SO4, generado mediante metabolismo respiratorio. No acumulan S 0 en su interior.
Todos los géneros arriba mencionados pertenecen a la división II del reino Procariota, la división
Bacterias. Un segundo miembro del reino Procariota, perteneciente a la división I: Cianobacterias, suelen
participar del ecosistema estudiado.
Cianofíceas, o algas verde-azuladas: organismos aerobios pertenecientes a una gran variedad de
géneros distintos. Utilizan agua y H2S para llevar a cabo fotosíntesis.
Procedimiento para la toma y siembra de muestras:
Para la toma del inóculo se deberá tener en cuenta la relación del microorganismo a estudiar con el
oxigeno, siendo necesario extraer los anaerobios del seno del sedimento y los aerobios de la parte líquida
de la columna. El color y la turbidez desarrolladas en las columnas será de gran orientación para el
criterio de la toma.
Para esta extracción se usara una pipeta Pasteur de 60 cm de longitud con boquilla de goma en su
extremo para faciltar la extracción. Es aconsejable un tratamiento cuidadoso para no alterar demasiado las
condiciones del ecosistema.
Siembra en medio líquido:
Se comenzará con siembra en medio líquido antes de pasar a medios sólidos. Respecto de los aerobios, se
cutivarán en tubos de ensayo con 4-5 ml del medio apropiado para el microorganismo en cuestión.
Los anaerobios, se cultivarán en frascos de penicilina o tubos con tapa a rosca, los cuales se cubrirán con
el medio apropiado hasta el tope. Luego de agregado el inóculo se cerrarán con las tapas a rosca y se
sellarán con parafina, procurando no dejar burbujas en su interior.
Siembra en medio sólido:
Se procederá a sembrar los medios sólidos una vez obtenido desarrollo positivo en medios líquidos.
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Los aerobios se sembrarán directamente como ya se ha explicado a lo largo del curso. En caso de tratarse
de organismos deslizantes, es recomendable colocar una mínima alícuota proveniente del medio líquido
en la parte central de la placa de Petri. Estos organismos móviles se alejarán del centro de la misma,
autopurificándose ya que dejarán tras sí cualquier otro contaminante no móvil.
Los anaerobios se cultivarán en tubos agarizados de la siguiente manera:
Se coloca 1-2 ml de medio sólido fundido a punto de solidificar.
Se agrega una alícuota de la muestra, agitando con suavidad para evitar laformación de burbujas.
Se adiciona mas medio a punto de solidificar, completando el llenado del tubo con tapon vaspar (o
sellándolo con vaselina-parafina)
Observación
Se realizarán observaciones macroscópicas y microscópicas de los organismos que se desarrollen en los
medios seleccionados.
La información a extraer es la siguiente:
Macroscópica: turbidez, desarrollo de color, movilidad, olores característicos. Tamaño, forma, color y
movilidad de las colonias.
Microscópicas: tamaño, forma, color, Gram, inclusiones citoplasmáticas.
CUESTIONARIO T. P. 8
1)¿Qué ventajas y desventajas encuentra en el uso de columnas de vidrio para el desarrollo de las
columnas?
2) ¿Cuál es la importancia de la selección de una fuente de luz incandescente? ¿Puede ser sustituida por
otra fuente de luz?
1) ¿Cuál es el rol que cumple cada droga (incluido el papel de filtro) en el desarrollo del ecosistema?¿Se
puede prescindir de alguna de ellas? Justifique.
2) ¿Cómo influye el origen del inóculo usado? ¿Cuáles serian las consecuencias de usar muestras
provenientes de aguas de libre curso?
3) ¿Por qué es necesario mantener el nivel del agua de los tubos por encima de la mitad de la longitid de
los mismos? ¿Qué pasaria si esto no se cumpliera?
4) ¿Qué ocurriría si las columnas no se hubieran dejado al abrigo de la luz por 7 dias?
7) ¿Qué tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color púrpura y verde de la columna
de Winogradsky?
8) ¿En qué zona de la columna esperaría encontrar un anaerobio estricto?
9) Describa una sucesión microbiana en la columna de Winogradsky
10) ¿Qué gradientes se forman en la columna de Winogradsky? ¿Qué elementos se utilizan en el
laboratorio para garantizar la formación de los mismos?
11) a) Ubique en relación al gradiente de SH2 a los siguientes microorganismos: bacterias reductoras de
sulfato, bacterias verdes del azufre, bacterias púrpuras del azufre, cianobacterias, diatomeas.
b) En base a que otro/s parámetro/s ambientales podría ubicarlas.
Justifique en todos los casos.
12) A partir de libros de texto, citas bibliográficas o búsquedas a través de internet, obtener más
información sobre el metabolismo y los requerimientos de oxígeno de los organismos que pueden estar
presentes en la columna de Winogradsky. Muchos de estos microorganismos se mencionan más abajo.
Utilizando la información obtenida, dibujar una columna de Winogradsky y ubicar los microorganismos
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en el lugar apropiado. Thiobacillus sp., Clostridium sp., Algae, Desulfovibrio sp., Cyanobacteria,
Chromatium sp., Rhodospirillum sp., Chlorobium sp.