Prueba de patogenicidad de extracto de papa después del

Métodos de diagnostico en campo
Prueba del flujo vascular del tallo
Es necesario efectuar una prueba de diagnóstico ya que la marchitez de la planta causada por la
bacteria Ralstonia solanacearum puede confundirse con los síntomas inducidos por otros agentes
patógenos como Fusarium eumartii, Verticillium sp., Pectobacterium spp., por daños mecánicos
o por los causados por insectos en la base del tallo.
La prueba del flujo vascular consiste en: (1) cortar un pedazo de tallo de 3-4 centímetros de la
base de la planta marchita y lavarlo con agua corriente; (2) sujetar el trozo de tallo en posición
vertical con un alambre o clip en un tubo de prueba conteniendo agua estéril; (3) luego de unos
minutos se observaran hilos lechosos parecidos al humo de cigarro que salen del sistema vascular
del tallo. Este flujo es característico de R. solanacearum.
Prueba de KOH
Los síntomas de la pudrición parda en los tubérculos se pueden confundir con los de la pudrición
anular causada por Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (antes llamada
Corynebacterium sepedonicum). Se puede realizar una prueba diferencial y rápida directamente
con el exudado bacteriano del tubérculo para diferenciar ambas bacterias. Se colocan dos gotas de
hidróxido de potasio (KOH) al 3% en el exudado y se mezclan con una ansa o un mondadientes
de madera durante 10 segundos. La formación de un hilo lechoso al levantar el mondadientes
indica la presencia de R. solanacearum (bacteria Gramnegativa). En el caso de C. michiganensis
subsp. sepedonicus (bacteria Grampositiva), no se forma el hilo.
Aislamiento en medio TZC o Kelman
Estriar 20 l del extracto de tallo enriquecido o de la solución del flujo vascular en placas
conteniendo el medio TZC (Kelman 1054) e incubar a 30oC durante dos días. Este medio es útil
para distinguir R. solanacearum de otras bacterias durante su aislamiento. Al cabo de dos días de
incubación a 30oC, las colonias virulentas se caracterizan por ser fluidas, irregulares, lisas, con
borde redondeado y de color blanco cremoso con la parte central de color rosado difuso, a veces
en forma de espiral.
Prueba de patogenicidad
Para esta prueba es necesario un cultivo de R. solanacearum en medio CPG (Kelman sin TZC) de
dos días de incubación a 30oC. Plántulas de tomate (cv. Marglobe) o de papa (cualquier variedad
susceptible a la marchitez bacteriana) de 10 a 15 cm de altura se inoculan inyectando 20 l de una
suspensión de R. solanacearum de aproximadamente 108 células/ml en la axila de la tercera hoja
superior, con ayuda de una jeringa hipodérmica. Otro método consiste en tomar una o dos
colonias de R. solanacearum crecida en medio Kelman sin TZC con el extremo de un
mondadientes e insertarlo en la axila de la tercera hoja superior. Las plantas se mantienen bien
regadas en un ambiente con temperaturas entre 25 a 30oC durante un mes con 80-90% de
humedad relativa y con luz natural del día. Si el aislamiento inoculado es una cepa virulenta de R.
solanacearum los síntomas aparecerán a partir de los cinco días y dentro de 4 semanas. Después
de la aparición de los síntomas, se puede realizar la prueba del flujo vascular del tallo y la
bacteria puede ser re-aislada de la suspensión obtenida.