5 Genética de las bacterias y sus virus Preguntas clave ¿A través de qué procesos las bacterias pueden intercambiar genes? ¿Se pueden utilizar estos procesos de intercambios para cartografiar genes mediante la producción de fenotipos mutantes? ¿Cómo interaccionan los genomas de los fagos con los genomas de las bacterias? ¿Cómo se pueden cartografiar los genomas de los fagos? Esquema 5.1 Trabajando con microorganismos 5.2 Conjugación bacteriana 5.3 Transformación bacteriana 5.4 Genética de los bacteriófagos 5.5 Transducción 5.6 Comparación de mapas físicos y mapas de ligamiento La tecnología del DNA es la responsable de los rápidos avances que se están haciendo en la genética de todos los organismos modelo. También es un tema con un interés considerable en el dominio público. Algunos ejemplos son el gran anuncio público de las secuencias de los genomas completos de humano y chimpancé en los últimos años, y la popularidad de los análisis forenses a partir de DNA en los shows televisivos y en las películas (Figura 5-1). Estos resultados espectaculares, ya sea en humanos, peces, insectos, plantas u hongos, se han obtenido a través del uso de tecnologías que permiten aislar trozos pequeños de DNA, llevarlos de una célula a otra, y amplificarlos en grandes muestras. La mayoría de los sistemas sofisticados que permiten estas manipulaciones del DNA de cualquier organismo provienen de las bacterias y sus virus. Por lo tanto, el avance de la genética moderna hasta el estado de conocimientos actual ha dependido completamente del desarrollo de la genética bacteriana, el tema de este capítulo. Aunque la genética bacteriana ha hecho posible la genética molecular moderna, nunca fue el objetivo de su investigación. Las bacterias, por si mismas, son (pág. 181) (pág. 182) importantes desde el punto de vista biológico. Son el organismo más numeroso en nuestro planeta. Contribuyen al reciclaje de nutrientes como el nitrógeno, el sulfuro y el carbono en los ecosistemas. Algunas son agentes de enfermedades humanas, animales o de plantas. Otras viven en simbiosis en nuestras bocas e intestinos. Además, hay muchos tipos de bacterias útiles para la síntesis industrial de un amplio abanico de productos orgánicos. Por todo esto, el ímpetu para la disección genética de las bacterias ha sido el mismo que para los organismos multicelulares –la comprensión de su función biológica. Las bacterias pertenecen a una clase de organismos conocida como procariotas, que también incluyen el alga verdeazulada (actualmente clasificada como cianobacteria). Una característica clave que define los procariotas es que su DNA no está encerrado en un núcleo rodeado de membrana. Al igual que los organismos superiores, las bacterias tienen genes compuestos de DNA que se encuentran dispuestos en una larga serie en un “cromosoma”. Sin embargo, la organización de su material genético es única en varios aspectos. El genoma de la mayoría de las bacterias es una única molécula de DNA de doble cadena con la forma de un círculo cerrado. Además, en la naturaleza, las bacterias tienen a menudo elementos extras de DNA denominados plásmidos. La mayoría de plásmidos también son círculos de DNA, pero son mucho más pequeños que el genoma bacteriano principal. Las bacterias pueden estar parasitadas por virus específicos denominados bacteriófagos o, simplemente, fagos. Los fagos y los otros virus son muy diferentes de los organismos que hemos estado estudiando hasta ahora. Los virus tienen algunas propiedades en común con los organismos; por ejemplo, su material genético puede ser DNA o RNA que constituye un “cromosoma” corto. Sin embargo, la mayoría de los biólogos no los considera seres vivos porque no se pueden reproducir por si mismos. Para reproducirse, los virus deben parasitar células vivas y utilizar la maquinaria molecular de estas células. Por esto, para estudiar su genética, los virus deben estar propagados en las células de los organismos hospedadores. Cuando los científicos empezaron a estudiar las bacterias y los fagos, estaban especialmente interesados en sus sistemas hereditarios. Claramente, las bacterias y los fagos deben tener sistemas hereditarios porque muestran una apariencia y una función constantes de una generación a la siguiente (mantienen una coherencia genealógica). Pero, ¿cómo funcionan estos sistemas hereditarios? Las bacterias, al igual que los organismos eucariotas unicelulares, se reproducen asexualmente por crecimiento y división celular, una célula se convierte en dos. Esta reproducción asexual es bastante sencilla de demostrar experimentalmente. Sin embargo, ¿se dan a veces uniones de diferentes tipos con el propósito de la reproducción sexual? Además, ¿cómo se reproducen los fagos que son mucho más pequeños? ¿Se unen alguna vez para un ciclo similar al sexual? En este capítulo se pretende contestar estas preguntas. Vamos a ver que hay una variedad de procesos hereditarios en las bacterias y los fagos. Estos procesos son interesantes por la biología básica de estas formas, pero también actúan como modelos –como fuentes de conocimiento de los procesos genéticos que funcionan en todos los organismos. Para un genetista, el atractivo de estas formas es que se pueden cultivar en números muy grandes porque son muy pequeñas. Por consiguiente, es posible detectar y estudiar sucesos genéticos muy raros que son difíciles o imposibles de estudiar en los eucariotas. ¿Qué procesos hereditarios se observan en los procariotas? El DNA se replica en una división celular asexual, pero la repartición de las copias nuevas entre las células hijas se lleva a cabo por un mecanismo bastante diferente de la mitosis. ¿Surgen mutantes? De hecho, el proceso de la mutación ocurre en las células asexuales de la misma manera que en las eucarióticas, hecho que permite la disección genética de la función bacteriana. ¿Qué pasa con la reproducción sexual y la recombinación? Los posibles sucesos de fusión similares al sexo son difíciles de observar, incluso con un microscopio, porque las células y sus cromosomas son muy pequeños. Por lo tanto, la aproximación general para detectar la fusión similar al sexo ha sido una aproximación genética en la que se detectan los recombinantes. La lógica es que, si alguna vez genomas diferentes están juntos en la misma célula, ocasionalmente producirían recombinantes. A la inversa, si se detectan recombinantes, con un marcador A de un parental y uno B del otro; entonces debe haber sucedido algún tipo de unión “sexual”. Por eso, aunque las bacterias y los fagos no experimentan la meiosis, la aproximación al análisis genético de estas formas es sorprendentemente similar al de los eucariotas. La oportunidad para la recombinación genética en las bacterias puede (pág. 182) (pág. 183) surgir de diferentes maneras, pero en todos los casos, se reúnen dos moléculas de DNA. Sin embargo, una diferencia importante respecto a los eucariotas es que, en las bacterias, raramente se reúnen dos cromosomas completos; normalmente, se une un cromosoma completo con un fragmento de otro cromosoma. Las posibilidades están esquematizadas en la Figura 5-2. El primer proceso de intercambio genético que se examina en el capítulo es la conjugación, que consiste en el contacto y la fusión de dos células diferentes. Tras la fusión, una de las células, denominada donante, a veces transfiere el DNA en una dirección hacia la otra célula. El DNA transferido puede ser una parte o (raramente) todo el genoma completo. En algunos casos, uno de los elementos de DNA extragenómicos denominados plásmidos, si está presente, se transfiere. Tras su entrada, cualquier fragmento genómico que se haya transferido puede recombinar con el cromosoma receptor. Una célula bacteriana también puede absorber un trozo de DNA del ambiente externo e incorporarlo en su propio cromosoma, un proceso llamado transformación. Además, algunos fagos pueden coger un trozo de DNA de una célula bacteriana e inyectarlo en otra, donde puede incorporarse en el cromosoma, en un proceso denominado transducción. Los propios fagos pueden experimentar la recombinación cuando dos genomas diferentes infectan la misma célula bacteriana (recombinación de fagos, no se muestra en la Figura 5-2). Antes de analizar estos modos de intercambio genético, vamos a considerar las formas prácticas de manejar las bacterias, que son muy diferentes de las que se utilizan para trabajar con organismos multicelulares. 5.1 Trabajando con microorganismos Las bacterias se dividen rápidamente y ocupan poco espacio, así que son adecuadas para su uso como organismos modelo en genética. Se pueden cultivar en medio líquido o en una superficie sólida como en un gel de agar, siempre que se les suministren los nutrientes básicos. Cada (pág. 183) (pág. 184) célula bacteriana se divide asexualmente de 1 2 4 8 16 células, y así sucesivamente, hasta que se agotan los nutrientes o hasta que los productos de deshecho tóxicos se acumulan a niveles que detienen el crecimiento de la población. Se puede pipetear una pequeña cantidad de cultivo líquido en una placa de Petri con medio sólido de agar y extenderla uniformemente sobre la superficie con un asa de siembra estéril, mediante un proceso denominado siembra (Figura 5-3). Las células se dividen, pero como no pueden irse lejos en la superficie del gel, todas las células permanecen juntas en un grupo. Cuando esta masa supera las 107 células, se hace visible a simple vista como una colonia. Cada una de las diferentes colonias de la placa proviene de una única célula original. Los miembros de una colonia que tienen un único ancestro genético se conocen como clones celulares. Es bastante fácil obtener bacterias con mutaciones. Los mutantes nutricionales son un buen ejemplo. Las bacterias de tipo salvaje son prototróficas, es decir, pueden crecer y dividirse en un medio mínimo –un substrato que sólo contiene sales inorgánicas, una fuente de carbono para la energía y agua. Se pueden obtener mutantes auxotróficos a partir de un cultivo prototrófico. Estos mutantes son células que no crecerán a menos que el medio contenga uno o más bloques de construcción específicos de la célula como la adenina, la treonina o la biotina. Otro tipo de mutantes útiles son los que difieren de las bacterias de tipo salvaje en la capacidad de utilizar una fuente de energía específica. Por ejemplo, el tipo salvaje (lac+) puede utilizar lactosa y crecer, mientras que el mutante (lac-) no puede. La Figura 5-4 muestra otra manera de distinguir las colonias lac+ y lac- mediante el uso de una tinción. En otra categoría de mutantes, mientras el tipo salvaje es susceptible a un inhibidor, como el antibiótico estreptomicina, los mutantes resistentes pueden dividirse y formar colonias en presencia del inhibidor. Todos estos tipos de mutantes permiten a los genetistas diferenciar distintas cepas individuales y, de ese modo, proporcionan marcadores genéticos (alelos marcadores) para realizar un seguimiento de los genomas y las células en los experimentos. La Tabla 5-1 resume algunos fenotipos bacterianos mutantes y sus símbolos genéticos. Las siguientes secciones describen el descubrimiento de varios procesos por los que los genomas bacterianos recombinan. Los métodos históricos son interesantes por sí mismos, pero también sirven para presentar los distintos procesos de recombinación, al igual que las técnicas analíticas que hoy en día todavía son aplicables. (pág. 184) (pág. 185) 5.2 Conjugación bacteriana Los primeros estudios en genética bacteriana revelaron el proceso inesperado de la conjugación celular. Descubrimiento de la conjugación ¿Presentan las bacterias algún proceso similar a la reproducción sexual y a la recombinación? La pregunta fue respondida por el trabajo experimental, elegantemente simple, de Joshua Lederberg y Edward Tatum, quienes en 1946 descubrieron un proceso similar al sexo en el que llegó a ser el principal modelo para la genética bacteriana, Escherichia coli (véase el recuadro Organismo modelo). Estaban estudiando dos cepas de E. coli con diferentes conjuntos de mutaciones auxotróficas. La cepa A sólo crecía si el medio estaba suplementado con metionina y biotina; la cepa B sólo crecía si estaba suplementado con treonina, leucina y tiamina. Así, las cepas se pueden designar como cepa A: met- bio- thr+ leu+ thi+ cepa B: met+ bio+ thr- leu- thi- RECUADRO Organismo modelo Escherichia coli El microscopista del siglo diecisiete Antony van Leeuwenhoek probablemente fue el primero en ver células bacterianas y en reconocer su tamaño pequeño: “Hay más bacterias viviendo en la capa de suciedad de los dientes de una boca humana que humanos en el reino”. Sin embargo, la bacteriología no empezó seriamente hasta el siglo diecinueve. En la década de los 40, Joshua Lederberg y Edward Tatum realizaron el descubrimiento que convirtió la bacteriología en un campo floreciente de la genética: descubrieron que, en una determinada bacteria, había un tipo de ciclo sexual que incluía un proceso similar al entrecruzamiento. El organismo que escogieron para este experimento ha llegado a ser el modelo no sólo para la genética procariota, sino en cierto modo para toda la genética. El organismo era Escherichia coli, una bacteria que recibió su nombre según su descubridor, el bacteriólogo alemán del siglo diecinueve Theodore Escherich. La elección de E. coli resultó afortunada ya que ha demostrado tener muchas características adecuadas para la investigación genética, de las cuales no es la menos importante que se pueda obtener fácilmente, dado que vive en el intestino de humanos y de otros animales. En el intestino, es un simbionte benigno, pero ocasionalmente causa infecciones en el tracto urinario y diarrea. E. coli tiene un único cromosoma circular de 4.6 Mb de longitud. De sus 4000 genes sin intrones, un 35% son de función desconocida. El ciclo sexual es posible por la acción de un plásmido extragenómico llamado F, que confiere un tipo de “masculinidad”. Otros plásmidos llevan genes cuyas funciones equipan a la célula para vivir en ambientes específicos, tales como genes de resistencia a fármacos. Estos plásmidos han sido adaptados como vectores génicos, que son transportadores de genes y constituyen la base de las transferencias génicas que son esenciales en la ingeniería genética moderna. E. coli es unicelular y crece por simple división celular. Debido a su tamaño pequeño (~1 m de longitud), E. coli puede crecer en grandes cantidades y ser sometida a procedimientos de selección intensiva y de rastreo para sucesos genéticos raros. La investigación en E. coli representa el inicio del razonamiento de “caja negra” en la genética: mediante la selección y el análisis de los mutantes, se pudo deducir el funcionamiento de la maquinaria genética, aunque era demasiada pequeña como para ser vista. Fenotipos como el tamaño de la colonia, la resistencia a fármacos, el uso de fuentes de carbono, y la producción de colorantes son el equivalente de los fenotipos morfológicos de la genética de eucariotas. (pág. 185) (pág. 186) La Figura 5-5a ilustra de manera sencilla el diseño de su experimento. Se mezclaron las cepas A y B, se incubaron por un tiempo y se sembraron en medio mínimo, donde no podía crecer ninguno de los auxótrofos. Resultó que una pequeña minoría de las células (1 de 107) crecía como protótrofas y, por lo tanto, debían ser de tipo salvaje; habían recuperado la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes. En algunas placas sólo se sembró la cepa bacteriana A, y en otras, sólo la cepa B, a modo de controles; pero no surgió ningún protótrofo de estas placas. La Figura 5-5b ilustra el experimento con más detalle. Estos resultados sugirieron que había ocurrido algún tipo de recombinación génica entre los genomas de las dos cepas para producir los protótrofos. Se podría argumentar que las células de las dos cepas realmente no intercambian genes, sino que pierden substancias que las otras células pueden absorber y utilizar para su crecimiento. (pág. 186) (pág. 187) La posibilidad de la “alimentación cruzada” fue descartada por Bernard Davis de la siguiente manera. Construyó un tubo con forma de U que tenía los dos brazos separados por un filtro fino. Los poros del filtro eran demasiado pequeños para permitir el paso de las bacterias, aunque lo suficientemente grandes como para permitir fácilmente el paso de cualquier sustancia disuelta (Figura 5-6). La cepa A se puso en un brazo, y la cepa B, en el otro. Tras haber incubado las cepas durante un tiempo, Davis examinó el contenido de cada brazo para ver si había células prototróficas, pero no se encontró ninguna. En otras palabras, era necesario el contacto físico entre las dos cepas para formar las células de tipo salvaje. Parecía como si hubiera ocurrido algún tipo de unión de genomas y se hubieran producido auténticos recombinantes. La unión física de las células bacterianas se puede confirmar con un microscopio electrónico y, actualmente, se denomina conjugación (Figura 5-7). Descubrimiento de factor de fertilidad (F) En 1953, William Hayes descubrió que, en los tipos de “cruces” aquí descritos, los parentales conjugados se comportaban de manera desigual (más tarde, veremos maneras de demostrar esta participación desigual). Un parental (y sólo ese parental) parecía transferir una parte o todo su genoma a otra célula. Por lo tanto, una célula actúa como donante y la otra, como receptora. Este “cruce” es bastante diferente de los cruces eucariotas en los que los progenitores contribuyen equitativamente con los genomas nucleares. Mensaje. La transferencia de material genético en la conjugación en E. coli no es recíproca. Una célula, la donante, transfieren una parte de su genoma a la otra célula, que actúa como la receptora. Accidentalmente, Hayes descubrió una variante de esta cepa donante original que no producía recombinantes al cruzarse con la cepa receptora. Aparentemente, la cepa de tipo donante había perdido la capacidad de transferir material genético y se había convertido en una cepa de tipo receptora. Mientras trabajaba con esta variante donante “estéril”, Hayes encontró que podía recuperar la capacidad de actuar como donante al asociarse con otras cepas donantes. De hecho, la capacidad donante se transmitía rápida y efectivamente entre las cepas durante la conjugación. Parecía estar ocurriendo una especie de “transferencia infecciosa” de algún factor. Sugirió que la capacidad donante es un estado hereditario, impuesto por un factor de fertilidad (F). Las cepas que contienen F pueden donar y se designan F+. Las cepas que carecen de F no pueden donar y son receptoras, designadas F-. Ahora se sabe mucho más sobre F. Es un ejemplo de una pequeña molécula circular no esencial de DNA llamada plásmido que puede replicarse en el citoplasma independientemente del cromosoma hospedador. La Figura 5-8 muestra cómo las bacterias pueden transferir los plásmidos como el F. El plásmido F dirige la síntesis de los pili (pilus, en singular), proyecciones que inician el contacto con una receptora (véase Figuras 5-7 y 5-8) y acercan ambas células. El DNA de F de la célula donante hace una copia de cadena sencilla de sí mismo mediante un mecanismo peculiar denominado replicación por círculo rodante. El plásmido circular “rueda”, y a medida que gira, va liberando la copia de cadena sencilla como un hilo de pescar. Esta copia pasa a través de un poro a la célula receptora donde se sintetiza la otra copia formando una doble (pág. 187) (pág. 188) hélice. Así pues, una copia de F permanece en la donante y otra copia aparece en la receptora, tal y como se muestra en la Figura 5-8. Cabe notar que el genoma de E. coli está representado como un único cromosoma circular en la Figura 5-8. (Se examinará la evidencia de este hecho más adelante). La mayoría de los genomas bacterianos son circulares, una característica bastante diferente de los cromosomas nucleares eucariotas. Veremos que esta característica conlleva a muchas de las idiosincrasias de la genética bacteriana. Cepas Hfr Un avance importante llegó cuando Luca Cavalli-Sforza descubrió un derivado de una cepa F+ con dos propiedades inusuales: 1. Al cruzarse con cepas F-, esta nueva cepa producía 1000 veces más recombinantes que una cepa F+ normal. Cavalli-Sforza designó a este derivado como una cepa Hfr para simbolizar su capacidad de promover una alta frecuencia de recombinación (en inglés, high frequency of recombination). 2. En los cruces Hfr × F-, prácticamente ninguno de los progenitores F- se convertía a F+ o a Hfr. Este resultado es opuesto a los cruces F+ × F-, en los que, como ya hemos visto, la transferencia infecciosa de F resulta en una gran proporción de F- convertidos a F+. Se puso de manifiesto que una cepa Hfr resulta de la integración del factor F en el cromosoma, como se ilustra en la Figura 5-9. Ahora se puede explicar la primera propiedad inusual de las cepas Hfr. Durante la conjugación, el factor F insertado en el cromosoma conduce una parte o todo el cromosoma a la célula F- de manera eficiente. Entonces, el fragmento cromosómico puede recombinar con el cromosoma receptor. Los pocos recombinantes observados por Lederberg y Tatum en los cruces F+ × F- eran debidos a la formación espontánea, pero poco frecuente, de células Hfr en el cultivo F+. Cavalli-Sforza aisló ejemplos de estas células raras de los cultivos de F+ y encontró que, de hecho, actuaban como verdaderas Hfr. ¿Muere una célula Hfr tras dar su material cromosómico a una célula F-? La respuesta es no. El cromosoma Hfr se replica y transfiere una cadena sencilla a la célula Fdurante la conjugación, justo como los plásmidos F. El hecho que el DNA transferido sea de cadena sencilla se puede demostrar visualmente mediante el uso de cepas y anticuerpos especiales, tal y como se muestra en la Figura 5-10. La replicación del cromosoma asegura un cromosoma completo para la célula donante tras el apareamiento. En la célula receptora, la cadena transferida se convierte en una doble hélice y los genes donados pueden llegar a incorporarse en el cromosoma receptor mediante entrecruzamientos, creando así, una célula recombinante (Figura 5-11). Si no hay recombinación, los fragmentos de DNA transferidos simplemente se pierden en el curso de la división celular. (pág. 188) (pág. 189) Transmisión lineal de los genes HFR desde un punto fijado En 1957, se obtuvo una visión más clara del comportamiento de las cepas Hfr cuando Elie Wollman y François Jacob investigaban el patrón de transmisión de los genes Hfr a las células F- durante el cruce. Ellos cruzaron Hfr azir tonr lac+ gal+ strs × F- azis tons lac- gal- strr (Los superíndices ‘‘r’’ y ‘‘s’’ simbolizan resistente y sensible, respectivamente). En tiempos concretos después de la mezcla, extrajeron muestras, cada una de las cuales se pasó por una batidora de cocina durante unos segundos para separar las parejas de células unidas. Este procedimiento se denomina apareamiento interrumpido. Las muestras se sembraron en medio con estreptomicina para matar las células Hfr donantes que llevaban el alelo sensible strs. Las células strr supervivientes se examinaron en busca de la presencia de alelos provenientes del genoma donado. Cualquier célula strr que lleve un alelo donado debe haber participado en la conjugación; estas células se denominan ex conjugantes. Los resultados se pueden observar gráficamente en la Figura 5-12a donde se muestra los tiempos en los que ha entrado cada alelo donado azir, tonr, lac+ y gal+. La Figura 5-12b representa la transferencia de los alelos Hfr. Los elementos clave de estos resultados son 1. Cada alelo donado aparece primero en las receptoras F- en un momento determinado después que haya empezado el apareamiento. 2. Los alelos donados aparecen en una secuencia específica. 3. Los alelos donados tardíos están presentes en pocas células receptoras. Al tener en cuenta todas estas observaciones conjuntamente, Wollman y Jacob dedujeron que, en el conjugante Hfr, (pág. 189) (pág. 190) la transferencia del DNA de cadena sencilla empieza por un punto fijado del cromosoma donado, llamado el origen (O), y continúa de manera lineal. Actualmente, se sabe que el punto O es el sitio por donde se inserta el plásmido F. Cuanto más lejos está un gen de O, más tarde se transfiere a F-. El proceso de transferencia generalmente se parará antes de que se transfieran los genes más lejanos y, como resultado, estos genes se incluirán en un número menor de ex conjugantes. ¿Cómo se puede explicar la segunda propiedad inusual de los cruces Hfr, que los ex conjugantes F- raramente se convierten en Hfr o F+? Cuando Wollman y Jacob permitieron que los cruces Hfr × F- continuaran durante 2 horas antes de la interrupción, encontraron que, de hecho, algunos ex conjugantes se habían convertido en Hfr. En otras palabras, la parte de F que confiere la capacidad donadora finalmente se había transmitido, pero a una frecuencia muy baja. La rareza de los ex conjugantes Hfr sugirió que el F insertado se transmitía como el último elemento del cromosoma lineal. Se puede resumir el orden de transmisión con el siguiente mapa genérico, donde la flecha indica la dirección de la transferencia, empezando por O: O a b c F Así, prácticamente ninguno de las receptoras F- se convierte ya que el factor de fertilidad es el último elemento transmitido y normalmente el proceso de transmisión se habrá parado antes de llegar tan lejos. Mensaje. El cromosoma Hfr, originalmente circular, desenrolla una copia de si mismo que se transfiere a la célula F- de manera lineal, y el factor F es el último en entrar. Infiriendo los sitios de integración de F y la circularidad del cromosoma Wollman y Jacob continuaron para arrojar más luz sobre cómo y dónde se integra el plásmido F para formar un Hfr y, al hacerlo, dedujeron que el cromosoma es circular. Realizaron experimentos de apareamiento interrumpido por separado con diferentes cepas Hfr derivadas. El orden de transmisión de los alelos difería significativamente de una cepa a otra, como en el ejemplo siguiente: Cepa Hfr H 1 O thr pro lac pur gal his gly thi F O thr thi gly his gal pur lac pro F 2 3 AB 312 O pro thr thi gly his gal pur lac F O pur lac pro thr thi gly his gal F O thi thr pro lac pur gal his gly F Cada línea se puede considerar un mapa que muestra el orden de los alelos en el cromosoma. A primera vista, parece ser una mezcla aleatoria de los genes. Sin (pág. 190) (pág. 191) embargo, cuando se invierten algunos de los mapas Hfr, la relación de las secuencias se aclara. H (escrito al revés) 1 2 3 AB 312 (escrito al revés) F thi gly his gal pur lac pro thr O O O O F thr thi gly his gal pur lac pro thr thi gly his gal pur pur lac pro thr thi gly his gly his gal pur lac pro thr pro lac gal thi F F F O La relación de unas secuencias con otras se explica si cada mapa es el segmento de un círculo. Éste fue el primer indicio de que los cromosomas bacterianos son circulares. Además, Allan Campbell propuso una sorprendente hipótesis que daba explicación a los diferentes mapas Hfr. Propuso que, si F es circular, la inserción debe ser un simple entrecruzamiento entre F y el cromosoma bacteriano (Figura 5-13). Siendo éste el caso, se podría generar cualquiera de los cromosomas Hfr lineales simplemente por la inserción de F en el anillo en el lugar y orientación adecuados (Figura 5-14). Varias hipótesis –posteriormente confirmadas– seguían la proposición de Campbell. 1. Un extremo del factor F integrado sería el origen, donde empieza la transferencia del cromosoma Hfr. El término estaría en el otro extremo de F. 2. La orientación con la que se inserta F determinaría el orden de entrada de los alelos donados. Si el círculo contiene los alelos A, B, C y D, la inserción entre A y D daría la ordenación ABCD o DCBA, según la orientación. Se pueden comprobar las distintas orientaciones de las inserciones en la Figura 5-14. ¿Cómo es posible que F se integre en diferentes posiciones? Si el DNA de F tuviera una región homóloga a varias regiones del cromosoma bacteriano, cualquiera de estas (pág. 191) (pág. 192) regiones podría actuar como una región de apareamiento donde el apareamiento podría estar seguido de un entrecruzamiento. Se sabe que estas regiones de homología principalmente son segmentos de elementos transponibles denominadas secuencias de inserción. Para una explicación completa de las secuencias de inserción, véase el Capítulo 14. Así, el factor de fertilidad existe en dos estados: 1. El estado plasmídico: como un elemento citoplasmático libre, F se transfiere fácilmente a las receptoras F-. 2. El estado integrado: como una parte contigua del cromosoma circular, F se transmite tan sólo al final de la conjugación. El ciclo de conjugación de E. coli se resume en la Figura 5-15. Cartografía de los cromosomas bacterianos Cartografía cromosómica a gran escala utilizando el tiempo de entrada Wollman y Jacob se dieron cuenta de que la construcción de mapas de ligamiento a partir de los resultados de apareamiento interrumpido sería sencilla si se utilizaba como medida de “distancia” el tiempo en el que los alelos donados aparecían primero tras el apareamiento. Las unidades de distancia en este caso eran minutos. De este modo, si b+ empieza a entrar en la célula F- 10 minutos después de que a+ haya empezado a entrar, entonces a+ y b+ están separados por 10 unidades. Al igual que los mapas eucariotas basados en entrecruzamientos, originalmente estos mapas de ligamiento eran construcciones puramente genéticas. En el momento en que se concibieron, no había manera de examinar su base física. Cartografía cromosómica a pequeña escala utilizando frecuencias de recombinación El fragmento donado debe recombinar con el cromosoma receptor para que un ex conjugante adquiera genes donados como características permanentes de su genoma. Sin embargo, cabe notar que la cartografía por tiempo de entrada no está basada en la frecuencia de recombinación. De hecho, las unidades son minutos, y no FR. No obstante, se puede utilizar la frecuencia de recombinación en bacterias para un tipo de cartografía a escala más fina, un método que vamos a ver a continuación. Primero, es preciso comprender algunas características especiales del proceso de recombinación en bacterias. Hay que recordar que la recombinación no ocurre entre dos (pág. 192) (pág. 193) genomas completos, como pasa en eucariotas; sino que ocurre entre un genoma completo, el de F-, llamado endogenote, y uno incompleto, proveniente de la Hfr donante y denominado exogenote. En ese momento, la célula tiene dos copias de un segmento de DNA: una copia es parte del endogenote y la otra, del exogenote. Así, en ese momento, la célula es un diploide parcial, llamado merocigoto. La genética bacteriana es genética de merocigotos. Un simple entrecruzamiento en un merocigoto rompería el anillo y no produciría recombinantes viables, tal y como se muestra en la Figura 5-16. Para mantener el círculo intacto, debe haber un número par de entrecruzamientos. Un número par de entrecruzamientos produce un cromosoma circular intacto y un fragmento. Aunque tales sucesos de recombinación se representan por sencillez como entrecruzamientos dobles, el mecanismo molecular real es algo diferente, es más como una invasión del endogenote por una sección interna del exogenote. El otro producto del “doble entrecruzamiento”, el fragmento, generalmente se pierde en el crecimiento posterior de la célula. Además, sólo sobrevive uno de los productos recíprocos de la recombinación. Por eso, otra característica distintiva de la recombinación bacteriana es que hay que olvidarse de los productos de intercambio recíprocos en la mayoría de casos. Mensaje. La recombinación durante la conjugación proviene de un suceso similar a un entrecruzamiento doble, que ocasiona recombinantes recíprocos de los cuales sólo sobrevive uno. Tras conocer esta propiedad, podemos examinar la cartografía por recombinación. Supongamos que se quieren calcular las distancias cartográficas que separan a tres loci cercanos: met, arg y leu. Se necesitan “trihíbridos”, ex conjugantes que han recibido los tres marcadores donados, para examinar la recombinación de estos genes. Asumamos que un (pág. 193) (pág. 194) experimento de apareamiento interrumpido ha mostrado que el orden es met, arg, leu, siendo met el primero en transferirse y leu, el último. Para obtener un trihíbrido, es necesario el merocigoto representado aquí: leu+ arg+ met+ Fragmento transferido del cromosoma Hfr leu- arg- metCromosoma F- Para obtener este merocigoto, antes se deben seleccionar ex conjugantes estables que lleven el último alelo donado, que, en este caso, es leu+. ¿Por qué? Porque si se selecciona el último (pág. 194) (pág. 195) marcador, se sabe que esas células en algún momento también deben haber albergado los marcadores anteriores –en concreto, arg+ y met+. Ahora, el objetivo es contar las frecuencias de entrecruzamientos en diferentes posiciones. Cabe notar que ahora se tiene una situación diferente de la del análisis de conjugación interrumpida. En la cartografía por conjugación interrumpida, se mide el tiempo de entrada de los loci individualmente; para ser heredados de manera estable, cada marcador tiene que recombinar con el cromosoma receptor por un entrecruzamiento doble que abarque el marcador. Sin embargo, en el análisis de la frecuencia de recombinación, se han seleccionado los trihíbridos específicamente como punto de partida, y ahora hay que considerar las diferentes combinaciones posibles de los tres alelos donados que se pueden insertar por entrecruzamiento doble a distintos intervalos. Se sabe que leu+ debe haber entrado y se debe haber insertado porque es el que se selecciona, pero los recombinantes leu+ que se seleccionan pueden haber incorporado o no los otros marcadores donados, en función de donde haya ocurrido el entrecruzamiento doble. De ahí que el procedimiento sea seleccionar primero los ex conjugantes leu+ y después aislar y examinar una gran muestra de estos ex conjugantes para ver qué otros marcadores se han integrado. Vamos a ver un ejemplo. En el cruce Hfr met+ arg+ leu+ strs × F- met- arg- leu- strr, se seleccionarían los recombinantes leu+ y se examinarían en busca de los alelos arg+ y met+, denominados marcadores no seleccionados. La Figura 5-17 representa los tipos de sucesos de entrecruzamientos dobles esperados. Un entrecruzamiento debe estar en el lado izquierdo del marcador leu y el otro debe estar en el lado derecho. Asumamos que los ex conjugantes leu+ son de los siguientes tipos y frecuencias: leu+ arg- met- 4% leu+ arg+ met- 9% leu+ arg+ met+ 87% En la Figura 5-17 se muestran los dobles entrecruzamientos que se necesitan para producir estos genotipos. Los dos primeros tipos son clave porque requieren un entrecruzamiento entre leu y arg en el primer caso; y entre arg y met, en el segundo. Por lo tanto, las frecuencias relativas de estos tipos se corresponden con los tamaños de estas dos regiones. Concluiríamos que la región leu-arg es de 4 unidades de mapa y que la región arg-met es de 9 unidades de mapa. En un cruce como el que se acaba de describir, un tipo de recombinantes potenciales, con genotipo leu+arg- met+, requiere cuatro entrecruzamientos en lugar de dos (véase el final de la Figura 5-17). Raramente se recuperan estos recombinantes, ya que su frecuencia es muy baja comparada con la de los otros tipos de recombinantes. Plásmidos F que llevan fragmentos genómicos El factor F en las cepas Hfr generalmente es bastante estable en su posición insertada. Sin embargo, ocasionalmente un factor F sale limpiamente del cromosoma por una inversión del proceso de recombinación que lo había insertado en primer lugar. Las dos regiones de apareamiento homólogas ambos lados se reaparean, y ocurre un entrecruzamiento que libera el plásmido F. Sin embargo, a veces la salida no es limpia y el plásmido se lleva una parte del cromosoma bacteriano. Un plásmido F que lleva DNA genómico bacteriano se denomina un plásmido F’ (F prima). La primera evidencia de este proceso viene de experimentos realizados por Edward Adelberg y François Jacob en 1953. Una de sus observaciones clave fue de una Hfr en la que el factor F se integró cerca del locus lac+. Tras empezar con esta cepa Hfr lac+, Jacob y Adelberg encontraron un derivado F+ que, en los cruces, transfería el lac+ a receptoras F- lac- con una frecuencia muy elevada. (Se podían detectar estos transferentes sembrando en medio sin lactosa). El lac+ transferido no se incorpora en el cromosoma principal de la receptora, que, como se sabe, conserva el alelo lac- porque estos ex conjugantes F+ lac+ ocasionalmente generan células hermanas F- lac-, a una frecuencia de 1 × 10-3. Así, el genotipo de estas receptoras parecía ser F’ lac+/F- lac-. En otras palabras, los ex conjugantes lac+ parecían llevar un plásmido F’ con un trozo del cromosoma donado incorporado. El origen de este plásmido F’ (pág. 195) (pág. 196) se muestra en la Figura 5-18. Cabe notar que la escisión defectuosa ocurre porque hay otra región homóloga cercana que se aparea con la original. El F’ de nuestro ejemplo se denomina F’ lac porque el trozo que se cogió del cromosoma del hospedador tiene el gen lac. Se han encontrado factores F’ con muchos genes cromosómicos diferentes y se han llamado de acuerdo con esos genes. Por ejemplo, los factores F’ que llevan gal o trp se denominan F’ gal o F’ trp, respectivamente. Como las células F lac+/F- lac- tienen el fenotipo Lac+, se sabe que lac+ es dominante sobre lac-. Los diploides parciales hechos con cepas F’ son útiles para varios aspectos de la genética bacteriana rutinaria, como el estudio de la dominancia o de la interacción alélica. Algunas cepas F’ pueden llevar partes muy grandes (hasta un cuarto) de un cromosoma bacteriano. Mensaje. El DNA de un plásmido F’ es una parte factor F y otra parte genoma bacteriano. Como los plásmidos F, los plásmidos F’ se transfieren rápidamente. Se pueden utilizar para establecer diploides parciales para estudios de dominancia bacteriana y interacción alélica. Plásmidos R En la década de los 40, se descubrió una propiedad alarmante de las bacterias patógenas mediante estudios realizados en hospitales japoneses. La disentería bacteriana está causada por bacterias (pág. 196) (pág. 197) del género Shigella. Inicialmente, esta bacteria era sensible a un amplio conjunto de antibióticos que se utilizaban para controlar la enfermedad. Sin embargo, en los hospitales japoneses, se demostró que la Shigella aislada de pacientes con disentería era resistente a muchos de estos fármacos simultáneamente, incluyendo la penicilina, la tetraciclina, la sulfanilamida, la estreptomicina y el cloranfenicol. Esta resistencia a múltiples fármacos se heredaba como un único paquete genético, y se podía transmitir de manera infecciosa –no sólo a otras cepas sensibles de Shigella, sino a otras especies bacterianas relacionadas. Este talento, que se parece a la movilidad del plásmido F de E. coli, es extraordinariamente útil para las bacterias patógenas porque la resistencia se puede extender rápidamente a través de una población. Sin embargo, sus implicaciones para la ciencia médica son extremas ya que las enfermedades bacterianas se vuelven, repentinamente, resistentes a los tratamientos de una amplia gama de fármacos. Sin embargo, desde el punto de vista de los genetistas, el mecanismo ha resultado interesante y es útil para la ingeniería genética. Los vectores que llevan estas resistencias múltiples resultaron ser otro grupo de plásmidos llamados plásmidos R. Se transfieren rápidamente en la conjugación celular, como el plásmido F en E. coli. De hecho, los plásmidos R en Shigella resultaron ser tan sólo los primeros de muchos elementos genéticos similares descubiertos. Todos existen en el estado de plásmido en el citoplasma. Se ha encontrado que estos elementos llevan muchos tipos diferentes de genes en las bacterias. La Tabla 5-2 muestra algunas de las características que los plásmidos pueden portar. La Figura 5-19 muestra un ejemplo de un plásmido con un gran recorrido que ha sido aislado de la industria lechera. (pág. 197) (pág. 198) Algunos plásmidos diseñados derivados de los plásmidos R, como el pBR 322 y el pUC (véase Capítulo 20), han llegado a ser los vectores preferidos para la clonación molecular del DNA de todos los organismos. Los genes de un plásmido R que confieren resistencia se pueden utilizar como marcadores para realizar el seguimiento del movimiento de los vectores entre las células. En los plásmidos R, los alelos para la resistencia a antibióticos a menudo se engloban en una unidad denominada transposón (Figura 5-20). Los transposones son segmentos únicos de DNA que se pueden desplazar a distintos sitios del genoma, un proceso denominado transposición. (El mecanismo para la transposición, que ocurre en la mayoría de especies estudiadas, se explicará en el Capítulo 14). Cuando un transposón se mueve a una nueva posición del genoma, ocasionalmente puede incluir entre sus extremos varios tipos de genes, incluyendo alelos de resistencia a fármacos, y llevarlos como pasajeros a sus nuevas posiciones. A veces, un transposón lleva un alelo de resistencia a fármacos a un plásmido, creando un plásmido R. Al igual que los plásmidos F, muchos de los plásmidos R son conjugativos; en otras palabras, se transmiten eficazmente a las células receptoras durante la conjugación. Incluso los plásmidos R que no son conjugativos y que nunca dejan sus propias células, pueden donar sus alelos R a un plásmido conjugativo por transposición. Por lo tanto, a través de los plásmidos, los alelos de resistencia a antibióticos se pueden extender rápidamente en una población de bacterias. Aunque la propagación de los plásmidos R es una estrategia eficaz para la supervivencia de las bacterias, representa un grave problema para la práctica médica, como ya se ha mencionado anteriormente, porque las poblaciones bacterianas se vuelven resistentes rápidamente a cualquier nuevo fármaco antibiótico que se invente y aplique a humanos. 5.3 Transformación bacteriana Algunas bacterias pueden absorber fragmentos de DNA del medio externo, y tal absorción constituye otra manera por la que las bacterias pueden intercambiar sus genes. El origen del DNA puede ser otras células de la misma especie o células de otras especies. En algunos casos, el DNA se ha liberado de células muertas; en otros casos, células bacterianas vivas han secretado el DNA. El DNA absorbido se integra en el cromosoma receptor. Si este DNA es de un genotipo distinto del genotipo del receptor, el del receptor puede verse cambiado permanentemente, un proceso acertadamente denominado transformación. La transformación se descubrió en la bacteria Streptococcus pneumoniae en 1928 por Frederick Griffith. Más tarde, en 1944, Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod y (pág. 198) (pág. 199) Maclyn McCarty demostraron que el “principio transformante” era DNA. Ambos resultados son hitos en la elucidación de la naturaleza molecular de los genes. Consideraremos este trabajo en más detalle en el Capítulo 7. El DNA transformante se incorpora en el cromosoma bacteriano por un proceso análogo a los sucesos de doble recombinación observados en los cruces Hfr × F-. Sin embargo, cabe notar que, en la conjugación, el DNA se transfiere de una célula viva a otra a través del contacto estrecho; mientras que, en la transformación, algunos trozos aislados de DNA se absorben por una célula a través de la pared celular y de la membrana plasmática. La Figura 5-21 muestra una manera de cómo puede ocurrir este proceso. La transformación ha sido una herramienta práctica en varias áreas de la investigación bacteriana, ya que se puede cambiar deliberadamente el genotipo de una cepa de una forma muy específica al transformarla con un fragmento de DNA apropiado. Por ejemplo, la transformación se utiliza ampliamente en la ingeniería genética. Más recientemente, se ha encontrado que incluso las células eucariotas se pueden transformar utilizando procedimientos similares, y esta técnica ha sido de inestimable valor para la modificación de las células eucariotas. Cartografía cromosómica utilizando la transformación La transformación se puede utilizar para medir cuán estrechamente están ligados dos genes en un cromosoma bacteriano. Cuando el DNA (el cromosoma bacteriano) se extrae para los experimentos de transformación, es inevitable que se rompa en trozos más pequeños. Si dos genes donados se encuentran muy cercanos en el cromosoma, hay muchas posibilidades de que a veces estén en el mismo trozo de DNA transformante. Por lo tanto, ambos serán absorbidos, causando una transformación doble. De manera inversa, si los genes están ampliamente separados en el cromosoma, será más probable que se transporten en segmentos transformantes separados. Posiblemente, un genoma podría absorber ambos segmentos de manera independiente, creando un transformante doble, pero este resultado no es probable. Por lo tanto, en los genes ampliamente separados, la frecuencia de los transformantes dobles será igual al producto de las frecuencias de los transformantes sencillos. Por eso, debería ser posible probar el ligamiento estrecho a partir de la desviación de la regla del producto. En otras palabras, si los genes están ligados, entonces la proporción de transformantes dobles será mayor que el producto de las frecuencias de los transformantes sencillos. Desafortunadamente, la situación es más compleja por varios factores –el más importante es que no todas las células de una población de bacterias son competentes para ser transformadas. No obstante, al final de este capítulo, podremos afinar nuestra habilidad en el análisis de la transformación en uno de los problemas, el cual supone que el 100% de las células receptoras son competentes. Mensaje. Las bacterias pueden absorber fragmentos de DNA del medio que les rodea. Dentro de la célula, estos fragmentos se pueden incorporar en el cromosoma. 5.4 Genética de los bacteriófagos La palabra bacteriófago, que es un nombre para los virus bacterianos, significa “que come bacterias”. Estos virus parasitan y matan las bacterias. Trabajos pioneros en la genética de los bacteriófagos a mediados del siglo veinte constituyeron los fundamentos de investigaciones más recientes en virus causantes de tumores y otros tipos de virus de animales y plantas. De esta manera, los virus bacterianos han proporcionado un importante sistema modelo. Estos virus se pueden utilizar en dos tipos distintos de análisis genéticos. Por un lado, se pueden cruzar dos genotipos de fago distintos para medir la recombinación y, por lo tanto, cartografiar el genoma vírico. El cartografiado del genoma vírico por este método es el tema de esta sección. Por otro lado, los bacteriófagos se pueden utilizar como una forma de reunir conjuntamente los genes bacterianos para los estudios de ligamiento u otros estudios genéticos. Estudiaremos el uso de los fagos en (pág.199) (pág. 200) los estudios bacterianos en la Sección 5.5. Además, como veremos en el Capítulo 20, los fagos se utilizan en la tecnología del DNA como transportadores, o vectores, de DNA foráneo. Antes de poder comprender la genética de los fagos, se debe examinar su ciclo de infección. Infección de bacterias por fagos La mayoría de las bacterias son susceptibles al ataque por los bacteriófagos. Un fago está compuesto por un “cromosoma” de ácido nucleico (DNA o RNA) rodeado por una cubierta de moléculas proteicas. Los tipos de fagos no se identifican por nombres de especies, sino por símbolos –por ejemplo, el fago T4, el fago , y así sucesivamente. Las Figuras 5-22 y 5-23 muestran la estructura del fago T4. Durante la infección, un fago se une a una bacteria e inyecta su material genético en el citoplasma de la bacteria, tal y como se esquematiza en la Figura 5-22. La Figura 5-24 muestra una micrografía electrónica del proceso. Entonces, la información genética del fago controla la maquinaria de la célula bacteriana parando la síntesis de los componentes bacterianos y redireccionando la maquinaria sintética bacteriana para hacer componentes del fago. Las cabezas del fago recién hechas se rellenan individualmente con las réplicas del cromosoma del fago. Finalmente, se crean muchos descendientes de fagos y éstos se liberan cuando la pared celular bacteriana se rompe. Este proceso de rotura se denomina lisis. La población progenie del fago se denomina lisado fágico. ¿Cómo se puede estudiar la herencia de los fagos cuando son tan pequeños que sólo son visibles bajo el microscopio electrónico? En este caso, no se puede producir una colonia visible mediante la siembra, pero se puede producir una manifestación visible de un fago aprovechando varios caracteres del fago. Vamos a ver las consecuencias de un fago que infecta una única célula bacteriana. La Figura 5-25 muestra la secuencia de sucesos en el ciclo infeccioso que lleva a la liberación de la progenie de fagos de la célula lisada. Tras la lisis, la progenie de fagos infecta las bacterias vecinas. Este ciclo se repite a través de rondas de replicación progresivas, y, a medida que los ciclos se repiten, el número de células lisadas aumenta exponencialmente. Al cabo de 15 horas después de que una única partícula fágica haya infectado una única célula bacteriana, los (pág. 200) (pág. 201) efectos son visibles a simple vista como una zona clara, o calva, en el cultivo confluente opaco de bacterias que cubre la superficie de la placa de medio sólido (Figura 5-26). Estas calvas pueden ser grandes o pequeñas, difusas o definidas, y así sucesivamente, según el genotipo del fago. Así, la morfología de la calva es un carácter del fago que se puede analizar en el nivel genético. Otro fenotipo del fago que se puede analizar genéticamente es la dispersión de hospedador, ya que los fagos difieren en el espectro de cepas bacterianas que pueden (pág. 201) (pág. 202) infectar y lisar. Por ejemplo, una cepa específica de bacterias puede ser inmune al fago 1 pero susceptible al fago 2. Cartografía de cromosomas de fago utilizando cruces entre fagos Dos genotipos de fagos se pueden cruzar de la misma manera que se cruzan dos organismos. El cruce entre fagos se puede ilustrar por un cruce de dos fagos T2 que originalmente fue estudiado por Alfred Hershey. Los genotipos de las dos cepas parentales en el cruce de Hershey eran h-r+ × h+r-. Los alelos corresponden a los siguientes genotipos: h- : puede infectar dos cepas distintas de E. coli (que podemos llamar cepas 1 y 2) h+ : sólo puede infectar la cepa 1 r- : lisa las células rápidamente, produciendo, de ese modo, grandes calvas r+ : lisa las células lentamente, produciendo calvas pequeñas Para realizar el cruce, se infecta la cepa 1 de E. coli con los dos genotipos parentales del fago T2. Este tipo de infección se denomina infección mixta o infección doble (Figura 5-27). Tras un periodo de incubación apropiado, el lisado fágico (la progenie de fagos) se analiza extendiéndolo en un cultivo bacteriano confluente formado por una mezcla de las cepas 1 y 2 de E. coli. Hay cuatro tipos de calvas distinguibles (Figura 5-28). Las calvas grandes indican lisis rápida (r-), y las calvas pequeñas indican lisis lenta (r+). Las calvas fágicas con el alelo h- infectarán los dos hospedadores, formando una calva clara; mientras que las calvas fágicas con el alelo h+ solo infectarán un hospedador, formando una calva turbia. Así, los cuatro genotipos se pueden clasificar fácilmente como parental (h-r+ y h+r-) y recombinante (h+r+ y h-r-), y la frecuencia de recombinación se puede calcular de la siguiente manera: FR = (h+r+) + (h-r-) número de calvas Si se asume que el cromosoma fágico recombinante es lineal, entonces los entrecruzamientos sencillos producen productos recíprocos viables. Sin embargo, los cruces entre fagos están asociados a algunas complicaciones analíticas. Primero, pueden ocurrir varias rondas de intercambio dentro de un hospedador: un recombinante producido poco después de la infección puede experimentar más recombinaciones en la misma célula o en ciclos de infección posteriores. Segundo, la recombinación puede ocurrir tanto entre fagos similares genéticamente como entre tipos distintos. Así, si nos referimos a los genotipos parentales generales como P1 y P2, además de los cruces P1 × P1 y P2 × P2, también ocurre P1 × P2. Por estos dos motivos, los recombinantes de los cruces entre fagos son una consecuencia de una población de sucesos en lugar de sucesos de intercambio defenidos en un solo paso. No obstante, siendo todo lo demás igual, el cálculo de FR representa un índice válido en los mapas de distancia de los fagos. Se pueden detectar sucesos de entrecruzamiento muy raros, porque se pueden utilizar números de fagos astronómicamente grandes en los análisis de recombinación de fagos. En la década de los 50, Seymour Benzer utilizó estos sucesos de entrecruzamiento raros para cartografiar los sitios mutados dentro del gen rII del fago T4, un gen que controla la lisis. Para los diferentes alelos mutados rII que surgen espontáneamente, el sitio mutado generalmente está en diferentes posiciones dentro del gen. Por eso, cuando (pág. 202) (pág. 203) se cruzan dos mutantes rII diferentes, pueden ocurrir unos pocos entrecruzamientos raros entre los sitios mutados, produciendo recombinantes de tipo salvaje, tal y como se muestra aquí: gen rII parental 1 parental 2 tipo salvaje doble mutante A medida que aumenta la distancia entre dos sitios mutados, tales sucesos de entrecruzamiento son más probables. Así, la frecuencia de los recombinantes rII+ es una medida de la distancia dentro del gen. (El producto recíproco es un doble mutante e indistinguible de los parentales). Benzer utilizó una aproximación ingeniosa para detectar los recombinantes rII+ muy raros. Utilizó el hecho de que los mutantes rII no infecten una cepa de E. coli llamada K. Por eso, hizo el cruce rII × rII en otra cepa y entonces sembró el lisado fágico en un cultivo confluente de la cepa K. Sólo los recombinantes rII+ formarán calvas en este cultivo. Esta manera de encontrar sucesos genéticos infrecuentes (en este caso, un recombinante) es un sistema selectivo: sólo los sucesos raros deseados pueden producir un cierto resultado visible. En contraste, un rastreo es un sistema en el que se escanean visualmente grandes números de individuos para buscar la poco frecuente “aguja en el pajar”. Esta misma aproximación se puede utilizar para cartografiar sitios mutados dentro de los genes de cualquier organismo del que se puedan obtener grandes números de células y para los que se puedan distinguir los fenotipos salvaje y mutante. Sin embargo, este tipo de (pág. 203) (pág. 204) cartografiado intragénico ha sido sustituido en gran parte por el advenimiento de métodos químicos de bajo coste para secuenciar el DNA que identifican las posiciones de los sitios mutados directamente. Mensaje. La recombinación entre los cromosomas de fagos se puede estudiar juntando los cromosomas parentales en una célula hospedadora mediante la infección mixta. La progenie de los fagos se puede examinar tanto en los genotipos parentales como en los recombinantes. 5.5 Transducción Algunos fagos son capaces de tomar genes bacterianos y llevarlos de una célula bacteriana a otra: un proceso conocido como transducción. Así, la transducción se suma a la batería de modos de transferencia de material genómico entre las bacterias – junto a la transferencia del cromosoma Hfr, la transferencia del plásmido F’, y la transformación. Descubrimiento de la transducción En 1951, Joshua Lederber y Norton Zinder estaban examinando la recombinación en la bacteria Salmonella typhimurium utilizando las técnicas que habían tenido éxito con E. coli. Los investigadores utilizaron dos cepas distintas: una era phe- trp- tyr-, y la otra era met- his-. No nos preocuparemos de la naturaleza de estos alelos excepto que todos son auxotróficos. Cuando cualquiera de las cepas se sembraba en medio mínimo, no se observaban células de tipo salvaje. Sin embargo, tras mezclar las dos cepas, aparecían protótrofos de tipo salvaje con una frecuencia de uno en 105. Hasta aquí, la situación era similar a la de la recombinación de E. coli. Sin embargo, en este caso, los investigadores también recuperaron recombinantes del experimento del tubo con forma de U, en el que se impedía la conjugación con un filtro que separaba los dos brazos. Supusieron que algún agente estaba llevando los genes de una bacteria a otra. Variando el tamaño de los poros del filtro encontraron que el agente responsable de la transferencia de genes era del mismo tamaño que un fago conocido de Salmonella, llamado fago P22. Además, el agente filtrable y P22 eran idénticos en cuanto a la sensibilidad al antisuero y a la inmunidad a las enzimas hidrolíticas. De este modo, Lederber y Zinder habían descubierto un nuevo tipo de transferencia génica, mediado por un virus. Fueron los primeros que llamaron transducción a este proceso. Como una rareza en el ciclo lítico, a veces las partículas víricas toman genes bacterianos y los transfieren cuando infectan otros hospedadores. La transducción se ha demostrado posteriormente en muchas bacterias. Para comprender el proceso de la transducción, es necesario distinguir dos tipos de ciclos fágicos. Los fagos virulentos son aquellos que lisan y matan el hospedador inmediatamente. Los fagos atemperados pueden permanecer en la célula hospedadora durante un tiempo sin matarla. Su DNA se puede bien integrar en el cromosoma hospedador para replicarse con él o replicarse por separado en el citoplasma, como un plásmido. Un fago que se ha integrado en el genoma bacteriano se llama profago. Una bacteria que alberga un fago quiescente se denomina lisogénica. Ocasionalmente, el fago quiescente de una bacteria lisogénica se activa, se replica a sí mismo y causa la lisis espontánea de su célula hospedadora. Un fago atemperado residente confiere resistencia a la infección de otros fagos de ese tipo. Hay dos tipos de transducción: generalizada o especializada. Los fagos con transducción generalizada pueden llevar consigo cualquier parte del cromosoma bacteriano, mientras que los fagos con transducción especializada sólo pueden llevar ciertas partes específicas. Mensaje. Los fagos virulentos no pueden llegar a ser profagos, pues siempre lisan una célula inmediatamente después de entrar. Los fagos atemperados pueden existir dentro de la célula bacteriana como profagos, permitiendo que sus hospedadores sobrevivan como bacterias lisogénicas; también pueden producir la lisis bacteriana ocasional. (pág. 204) (pág. 205) Transducción generalizada ¿Mediante qué mecanismos un fago puede llevar a cabo la transducción generalizada? En 1965, H. Ikeda y J. Tomizawa arrojaron luz sobre esta pregunta en unos experimentos con el fago P1 de E. coli. Encontraron que cuando una célula donante se lisa por P1, el cromosoma bacteriano se fragmenta en pequeños trozos. Ocasionalmente, las partículas fágicas recién formadas incorporan erróneamente un trozo del DNA bacteriano en la cabeza del fago en lugar del DNA del fago. Este suceso es el origen del fago transductor. Un fago que lleva DNA bacteriano puede infectar otra célula. Entonces, este DNA bacteriano puede incorporarse en el cromosoma de la célula receptora mediante recombinación (Figura 5-29). Este tipo de transducción es necesariamente la de tipo generalizado, ya que se pueden transducir los genes de cualquiera de las partes fragmentadas del genoma hospedador. Tanto el fago P1 como el P22 pertenecen a un grupo de fagos que presenta transducción generalizada. El DNA de P22 se inserta en el cromosoma hospedador, mientras que el DNA de P1 permanece libre, como un plásmido. Sin embargo, ambos transducen a través del rellenado defectuoso de la cabeza. La transducción generalizada se puede utilizar para obtener información del ligamiento en bacterias cuando los genes están suficientemente juntos como para que un fago pueda cogerlos y transducirlos en un único trozo de DNA. Por ejemplo, supongamos que se quiere encontrar la distancia de ligamiento entre met y arg en E. coli. Se puede hacer crecer el fago P1 en una cepa donante met+ arg+ y posteriormente permitir que los fagos P1 provenientes del lisado de esta cepa infecten una cepa met- arg-. Primero, se selecciona un alelo donado, por ejemplo, met+. Entonces, se mide el porcentaje de colonias met+ que también son arg+. Las cepas que han transducido (pág. 205) (pág. 206) met+ y arg+ se denominan cotransductantes. Cuanto mayor sea la frecuencia de transducción, más cercanos deben estar los dos marcadores genéticos (lo opuesto a la mayoría de medidas de cartografía). Los valores de ligamiento normalmente se expresan como frecuencia de cotransducción (Figura 5-30). Mediante el empleo de una extensión de esta aproximación, se puede estimar el tamaño del trozo de cromosoma hospedador que un fago puede coger, como en el siguiente tipo de experimento que utiliza el fago P1: donante leu+ thr+ azir receptora leu- thr- azis En este experimento, el fago P1 que ha crecido en la cepa donante leu+ thr+ azir infecta la cepa receptora leu- thr- azis. La estrategia consiste en seleccionar uno o más alelos donados en el cromosoma receptor y entonces examinar estos transductantes en busca de la presencia de los alelos no seleccionados. Los resultados se esquematizan en la Tabla 5-3. El experimento 1 en la Tabla 5-3 nos dice que leu está relativamente cerca de azi y distante de thr, dejando dos posibilidades: thr leu azi o thr azi leu El experimento 2 nos dice que leu está más cerca de thr que de azi, así que el mapa debe ser thr leu azi Si se selecciona para thr+ y leu+ juntos en el fago transductante, como en el experimento 3, vemos que el trozo de material genético transducido nunca incluye (pág. 206) (pág. 207) el locus azi porque la cabeza del fago no puede llevar un fragmento de DNA tan grande. P1 sólo puede cotransducir genes que estén separados menos de 1.5 minutos aproximadamente, en el mapa cromosómico de E. coli. Transducción especializada Un transductor generalizado, como el fago P22, coge al azar fragmentos del DNA hospedador roto. ¿Cómo son capaces otros fagos, que actúan como transductores especializados, de llevar sólo ciertos genes hospedadores a las células receptoras? La respuesta breve es que un transductor especializado se inserta en el cromosoma bacteriano en una única posición. Cuando sale, se produce un bucle defectuoso (similar al tipo que producen los plásmidos F’). Por lo tanto, sólo puede tomar y transducir los genes que están cerca. El prototipo de la transducción especializada fue proporcionado por trabajos emprendidos por Joshua y Esther Lederberg en un fago atemperado de E. coli llamado lambda (). El fago ha llegado a ser el fago más intensamente estudiado y mejor caracterizado. Comportamiento del profago El fago tiene efectos inusuales cuando se utilizan las células lisogénicas con en los cruces. En el cruce de una Hfr no infectada con una receptora F- lisogénica (Hfr × F- ()), se recuperan fácilmente ex conjugantes Flisogénicos con genes Hfr. Sin embargo, en el cruce recíproco Hfr () × F-, los genes tempranos del cromosoma Hfr se recuperan entre los ex conjugantes, pero los recombinantes para los genes tardíos no se recuperan. Además, los ex conjugantes lisogénicos casi nunca se recuperan de este cruce recíproco. ¿Cuál es la explicación? Las observaciones tienen sentido si el profago se está comportando como lo hace un locus de un gen bacteriano (es decir, como parte del cromosoma bacteriano). Así, el profago entraría en la célula F- según el tiempo específico que corresponde con su posición en el cromosoma. Los genes tempranos se recuperan porque entran antes que el profago. Los genes tardíos no se recuperan porque la lisis destruye la célula receptora. De hecho, en los experimentos de apareamiento interrumpido, el profago siempre entra en la célula F- en un tiempo específico, íntimamente ligado al locus gal. En un cruce Hfr () × F-, la entrada del profago en la célula desencadena inmediatamente el ciclo lítico; este proceso se denomina inducción cigótica (Figura 531). Sin embargo, en el cruce de dos células lisógenicas Hfr () × F- (), no hay inducción cigótica. La presencia de cualquiera de los profagos impide que otro virus infeccioso cause la lisis. El profago produce un factor citoplasmático que reprime la multiplicación del virus. (El represor citoplasmático dirigido a fagos (pág. 207) (pág. 208) explica muy bien la inmunidad de las bacterias lisogénicas, ya que un fago encontraría inmediatamente un represor y sería inactivado). Inserción de Los experimentos de apareamiento interrumpido descritos hasta este momento muestran que el profago es parte del cromosoma bacteriano lisogénico. ¿Cómo se inserta el profago en el genoma bacteriano? En 1962, Allan Campbell propuso que el fago se inserta por entrecruzamiento sencillo entre el cromosoma circular del fago y el cromosoma circular de E. coli, como se muestra en la Figura 532. El punto de entrecruzamiento estaría en una posición específica de , el sitio de fijación de , y el sitio de fijación del cromosoma bacteriano estaría situado entre los genes gal y bio, ya que se integra en esta posición del cromosoma de E. coli. Un atractivo de la propuesta de Campbell es que a partir de ella surgen predicciones que los genetistas pueden examinar. Por ejemplo, la integración del profago en el cromosoma de E. coli debería incrementar la distancia genética entre los genes bacterianos flanqueantes, tal y como se puede ver en la Figura 5-32 para gal y bio. De hecho, los estudios muestran que la lisogenia incrementa las distancias del tiempo de entrada o de la recombinación entre los genes bacterianos. Esta posición única de explica la transducción especializada. Mecanismo de la transducción especializada Como un profago, siempre se inserta entra la región gal y la región bio del cromosoma hospedador (Figura 5-33) y, como es de esperar, en los experimentos de transducción, sólo puede transducir los genes gal y bio. ¿Cómo se lleva los genes vecinos? La explicación radica, de nuevo, en una inversión imperfecta del mecanismo de inserción de Campbell, como el de la formación de F’. Un sistema especializado de enzimas codificadas por el fago codifica el suceso de recombinación entre las regiones específicas de y del cromosoma bacteriano y utiliza el sitio de fijación de como sustrato. El sistema enzimático sólo permite que se integre en un punto específico entre gal y bio en el cromosoma (véase Figura 5-33a). Además, durante la lisis, normalmente el profago se escinde precisamente por el punto correcto para producir un cromosoma circular de normal, como se ve en la Figura 5-33b(i). Muy raramente, la escisión puede ser anormal debido a la creación de un bucle defectuoso. En este caso, el DNA del fago que forma el bucle puede coger un gen cercano y dejar atrás algunos genes del fago, como se ve en la Figura 5-33(ii). El genoma del fago resultante es defectivo a causa de los genes que ha dejado, pero también ha ganado algún gen bacteriano, gal o bio. El DNA anormal que lleva genes consigo se puede empaquetar en las cabezas de los fagos para producir partículas fágicas que pueden infectar otras bacterias. Estos fagos se conocen como dgal (defectuoso gal) o dbio. En presencia de una segunda partícula fágica normal durante una infección doble, el dgal se puede integrar en el cromosoma en el sito de fijación de (Figura 5-33c). De este modo, los genes gal se transducen en este caso al segundo hospedador. Mensaje. La transducción ocurre cuando los fagos recién formados adquieren genes del hospedador y los transfieren a otras células bacterianas. La transducción generalizada puede transferir cualquier gen hospedador. Ocurre cuando durante el empaquetamiento del fago se incorpora accidentalmente DNA bacteriano en lugar de DNA del fago. La transducción especializada es debida a la formación de un bucle defectuoso del profago en el cromosoma bacteriano, así que el nuevo fago incluye tanto genes fágicos como bacterianos. El fago transductor sólo puede transferir genes específicos del hospedador. (pág. 208) (pág. 209) 5.6 Comparación de mapas físicos y mapas de ligamiento Algunos mapas cromosómicos muy detallados para bacterias se han obtenido combinando las técnicas de cartografía de apareamiento interrumpido, cartografía por recombinación, transformación y transducción. Hoy en día, los nuevos marcadores genéticos se cartografían típicamente a partir de un primer segmento de unos 10 a 15 minutos de mapa utilizando el apareamiento interrumpido. Entonces, los marcadores estrechamente ligados pueden cartografiarse en una escala más fina mediante el uso de la cotransducción de P1 o de la recombinación. Hacia 1963, el mapa de E. coli (Figura 5-34) ya detallaba las posiciones de aproximadamente unos 100 genes. Tras 27 años de refinamiento adicional, el mapa de 1990 representaba las posiciones de más de 1400 genes. La figura 5-35 muestra una sección de 5 minutos del mapa de 1990 (que se ajusta a una escala de 100 minutos). La complejidad de estos mapas ilustra el poder y la sofisticación del análisis genético. ¿Cuán bien se corresponden estos mapas con la realidad física? En 1997, la secuencia de DNA del genoma completo de E. coli de 4 632 221 pares de bases estaba completa, permitiendo la comparación (pág. 209) (pág. 211) de la posición exacta de los genes en el mapa genético con la posición de la secuencia codificadora correspondiente en la secuencia de DNA lineal (el mapa físico). El mapa completo se representa en la Figura 5-36. La Figura 5-37 hace una comparación de ambos mapas para un segmento. Claramente, el mapa genético muestra una estrecha concordancia con el mapa físico. En el Capítulo 4 se consideraban algunas maneras en las que el mapa físico (normalmente la secuencia genómica completa) puede ser útil para cartografiar nuevas mutaciones. En las bacterias, la técnica de la mutagénesis insercional es otro modo de dirigirse rápidamente a la posición de una mutación en un mapa físico conocido. La técnica causa mutaciones a lo largo de la inserción aleatoria de los fragmentos de DNA “foráneos”. Los insertos inactivan cualquier gen sobre el que caen, interrumpiendo la unidad transcripcional. Los transposones son insertos particularmente útiles para este propósito en varios organismos modelo, incluyendo las bacterias. Para cartografiar una nueva mutación, el procedimiento es el siguiente: el DNA del transposón que lleva un alelo de resistencia u otro marcador seleccionable se introduce por transformación en los cromosomas receptores bacterianos que no tienen transposones activos. Los transposones se insertan más o menos aleatoriamente, y cualquiera que caiga en medio de un gen causa una mutación. Un subconjunto de todos los mutantes obtenidos tendrá fenotipos relevantes para el proceso bacteriano bajo estudio, y estos fenotipos llegan a ser el foco del análisis. Lo bueno de insertar transposones es que, como se conoce su secuencia, se puede localizar y secuenciar el gen mutado. Los cebadores para la replicación del DNA se crean a partir de la correspondiente secuencia conocida del transposón (véase Capítulo 20). Estos cebadores se utilizan para iniciar un análisis de secuenciación fuera del transposón, en el gen circundante. La corta secuencia obtenida se puede introducir en un ordenador y compararla con la secuencia genómica completa. De este análisis se obtienen la posición del gen y su secuencia completa. La función de un homólogo de este gen puede que se haya deducido en otros organismos. Por lo tanto, se puede ver que esta aproximación (como la introducida en el Capítulo 4) es otra forma de (pág. 211) (pág. 212) unir el fenotipo mutante con la posición en el mapa y la función potencial. La Figura 538 resume esta aproximación. Como un apunte para finalizar, es interesante que muchos de los experimentos históricos que revelan la circularidad de los genomas bacterianos y plasmídicos coincidieron con la publicación y la popularización de El señor de los anillos de J. R. R. Tolkien. Por consiguiente, una revisión de la genética bacteriana en aquel momento salió con la siguiente cita de la trilogía: Un Anillo para gobernarlos a todos, Un Anillo para encontrarlos, Un Anillo para atraerlos a todos y atarlos en las tinieblas. Resumen Los avances en la genética bacteriana y de fagos de los últimos 50 años han proporcionado los fundamentos de la biología molecular y la clonación (discutidos en capítulos posteriores). A principios de este periodo, se encontró que la transferencia génica y la recombinación ocurrían entre diferentes cepas de bacterias. En las bacterias, sin embargo, el material genético sólo se pasa en una dirección –por ejemplo, en Escherichia coli, de una célula donante (F+ o Hfr) a una célula receptora (F-). La capacidad donante viene determinada por la presencia en la célula de un factor de fertilidad (F), un tipo de plásmido. En ocasiones, el factor F presente en estado libre en las células F+ se puede integrar en el cromosoma de E. coli y formar una célula Hfr. Cuando esto ocurre, un fragmento del cromosoma donante se puede transferir a una célula receptora y posteriormente recombinar con el cromosoma receptor. Como el factor F se puede insertar en diferentes lugares del cromosoma hospedador, los primeros investigadores fueron capaces de reunir conjuntamente los fragmentos transferidos para mostrar que el cromosoma de E. coli es un simple círculo, o anillo. La interrupción de la transferencia en diferentes tiempos ha proporcionado a los genetistas un método no convencional (apareamiento interrumpido) para construir mapas de ligamiento del único cromosoma de E. coli y de otras bacterias similares, en los que la unidad de mapa es una unidad de tiempo (minutos). En una extensión de esta técnica, la frecuencia de recombinación entre los marcadores que se sabe que han entrado en la célula receptora puede proporcionar una distancia de mapa a escala más fina. Se pueden encontrar otros tipos de plásmidos además del F. Los plásmidos R llevan alelos de resistencia a antibióticos, a menudo dentro de un elemento móvil llamado transposón. La extensión rápida del plásmido causa una resistencia amplia en la población a fármacos importantes médicamente. Derivados de estos plásmidos naturales han llegado a ser importantes vectores de clonación, útiles para el aislamiento de genes y el estudio de todo tipo de organismos. Los rasgos genéticos también se pueden transferir de una célula bacteriana a otra en forma de fragmentos de DNA tomados por la célula del ambiente extracelular. Este proceso de transformación en las células bacterianas fue la primera demostración de que el DNA es el material genético. Para que ocurra la transformación, el DNA debe ser incorporado por una célula receptora y entonces debe ocurrir la recombinación entre el cromosoma receptor y el DNA incorporado. Las bacterias se pueden infectar por virus llamados bacteriófagos. En un método de infección, el cromosoma del fago puede entrar en la célula bacteriana y, utilizando la maquinaria metabólica bacteriana, producir una progenie de fagos que revienten la bacteria hospedadora. Los nuevos fagos pueden infectar otras células. Si dos fagos de distinto fenotipo infectan el mismo hospedador, puede ocurrir la recombinación entre sus cromosomas. En otro modo de infección, la lisogenia, el fago inyectado permanece latente en la célula bacteriana. En muchos casos, este fago latente (el profago) se incorpora en el cromosoma hospedador y se replica con él. Ya sea espontáneamente o con la estimulación apropiada, el profago puede dejar su estado latente y lisar la célula hospedadora bacteriana. (pág. 212) (pág. 213) Un fago puede llevar genes bacterianos de una donante a una receptora. En la transducción generalizada, un fragmento aleatorio del DNA hospedador se incorpora solitariamente en la cabeza del fago durante la lisis. En la transducción especializada, la escisión defectuosa del profago de un único locus cromosómico resulta en la inclusión de genes hospedadores específicos así como de DNA del fago en la cabeza del fago. Hoy en día se dispone, en muchas especies bacterianas, de un mapa físico en forma de secuencia genómica completa. Con el uso de este mapa genómico físico, se puede localizar de manera precisa la posición en el mapa de una mutación de interés. Primero, se producen mutaciones adecuadas por la inserción de los transposones (mutagénesis insercional). Entonces, se obtiene la secuencia de DNA que rodea el transposón insertado y se busca su correspondencia con una secuencia en el mapa físico. Esta técnica proporciona el locus, la secuencia y posiblemente la función del gen de interés. Términos clave apareamiento interrumpido (p. 189) auxótrofo (p. 184) bacteria lisogénica (p. 204) bacteriófago (fago) (p. 182) calva (p. 201) clon celular (p. 184) colonia (p. 184) conjugación (p. 187) cotransductante (p. 206) donante (p. 187) endogenote (p. 193) ex conjugante (p. 189) exogenote (p. 193) F+ (donante) (p. 187) F- (receptor) (p. 187) factor de fertilidad (F) (p. 187) fago (bacteriófago) (p. 182) fago atemperado (p. 204) fago virulento (p. 204) Hfr (alta frecuencia de recombinación; del inglés, high frecuency of recombination) (p. 188) inducción cigótica (p. 207) infección doble (p. 202) infección mixta (p. 202) lisado (p. 200) lisis (p. 200) marcador genético (p. 184) marcador no seleccionado (p. 195) medio mínimo (p. 184) merocigoto (p. 193) mutagénesis insercional (p. 211) mutante resistente (p. 184) origen (O) (p. 190) plásmido (p. 187) plásmido F' (p. 195) plásmido R (p. 197) procariota (p. 182) profago (p. 204) protótrofo (p. 184) rastreo (p. 203) receptor (p. 187) recombinación de fagos (p. 183) replicación por círculo rodante (p. 187) siembra (p. 184) sistema selectivo (p. 203) sitio de fijación (p. 208) terminal (p. 191) transducción (p. 204) transducción especializada (p. 207) transducción generalizada (p. 205) transformación (p. 198) transformación doble (p. 199) virus (p. 182) Problemas resueltos Problema resuelto 1. Suponga que una célula fuera incapaz de llevar a cabo la recombinación generalizada (rec-). ¿Cómo se comportaría esta célula como receptora en la transducción generalizada y en la especializada? Primero, compare cada tipo de transducción y, entonces, determine el efecto de la mutación rec- en la herencia de los genes para cada proceso. SOLUCIÓN La transducción generalizada supone la incorporación de los fragmentos cromosómicos en las cabezas de los fagos, que después infectan las cepas receptoras. Los fragmentos cromosómicos se incorporan aleatoriamente en las cabezas de los fagos, así que cualquier marcador del cromosoma hospedador se puede transducir a otra cepa por transducción generalizada. Contrariamente, la transducción especializada supone la integración del fago en un punto específico del cromosoma y la rara incorporación de marcadores cromosómicos cerca del sitio de integración en el genoma del fago. Por eso, sólo aquellos marcadores que estén cerca del sitio de integración específico del fago en el cromosoma hospedador podrán ser transducidos. Los marcadores se heredan por distintas rutas en la transducción generalizada y en la especializada. Un fago que transduce de forma generalizada inyecta un fragmento del cromosoma donante en el receptor. Este fragmento debe incorporarse en el cromosoma receptor mediante recombinación, con el uso del sistema de recombinación del receptor. Por tanto, un receptor rec- no será capaz de incorporar fragmentos de DNA y no podrá heredar marcadores mediante transducción generalizada. Por otro lado, la principal ruta de herencia de marcadores vía transducción especializada es por la integración de (pág. 213) (pág. 241) las partículas transductantes especializadas en el cromosoma hospedador en el sitio de integración específico del fago. Esta integración, que a veces requiere un fago de tipo salvaje (ayudante) adicional, está mediada por el sistema enzimático específico del fago, que es independiente de las enzimas de recombinación normales. Por lo tanto, un receptor rec- puede heredar marcadores genéticos por transducción especializada. Problema resuelto 2. En E. coli cuatro cepas Hfr dan los siguientes marcadores genéticos, mostrados en el orden que se donan: Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3 : Cepa 4 : Q A B B W X N Q D P C W M T A D T M X M Todas estas cepas provienen de la misma cepa F+. ¿Cuál es el orden de estos marcadores en el cromosoma circular de la F+ original? SOLUCIÓN Una aproximación de dos pasos funciona bien: (1) se determina el principio subyacente y (2) se dibuja un diagrama. Aquí, el principio es claramente que cada cepa Hfr dona marcadores genéticos desde un punto fijado en el cromosoma circular y que los primeros marcadores son los que se donan con la frecuencia más alta. Como no se donan todos los marcadores con cada Hfr, sólo los primero marcadores son donados por cada Hfr. Cada cepa nos permite dibujar los siguientes círculos: Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 A partir de esta información, podemos consolidar cada círculo en un mapa de ligamiento circular con el orden Q, W, D, M, T, P, X, A, C, N, B, Q. Problema resuelto 3. En un cruce Hfr × F-, leu+ entra como el primer marcador, pero se desconoce el orden de los otros marcadores. Si Hfr es de tipo salvaje y F- es auxótrofa para cada marcador en cuestión, ¿cuál es el orden de los marcadores en un cruce donde se seleccionan los recombinantes leu+ si el 27% son ile+, el 13% son mal+, el 82% son thr+ y el 1% son trp+? SOLUCIÓN Recuerde que la rotura espontánea crea un gradiente natural de transferencia, haciendo menos probable que un receptor reciba los marcadores más lejanos. Como hemos seleccionado el primer marcador en el cruce, la frecuencia de recombinación es una función del orden de entrada de cada marcador. Por lo tanto, podemos determinar inmediatamente el orden de los marcadores genéticos simplemente si miramos el porcentaje de recombinantes de cada marcador en los recombinantes leu+. Como la herencia de thr+ es la mayor, thr+ debe ser el primer marcador en entrar tras leu. El orden completo es leu, thr, ile, mal, trp. Problema resuelto 4. Se realiza un cruce entre una Hfr que es met+ thi+ pur+ y una Fque es met- thi- pur-. Los estudios de apareamiento interrumpido muestran que met+ entra en el receptor el último, así que se seleccionan los recombinantes met+ en un medio que contiene suplementos que sólo satisfacen las necesidades para pur y thi. Estos recombinantes se examinan para la presencia de los alelos thi+ y pur+. Se encuentran los siguientes números de individuos para cada genotipo: met+ thi+ pur+ met+ thi+ purmet+ thi- pur+ met+ thi- pur- 280 0 6 52 a. ¿Por qué no se incluyó la metionina (Met) en el medio de selección? b. ¿Cuál es el orden de los genes? c. ¿Cuáles son las distancias de mapa en unidades de recombinación? SOLUCIÓN a. La metionina no se incluyó en el medio para permitir la selección de los recombinantes met+, ya que met+ es el último marcador que entra en el receptor. La selección de met+ garantiza que todos los loci que estamos considerando en el cruce ya hayan entrado en cada recombinante que analizamos. b. Aquí, un diagrama de los posibles órdenes de genes es útil. Como sabemos que met entra el último en el cromosoma receptor, sólo hay dos posibles ordenaciones de genes si el primer marcador entra por la derecha: met, thi, pur o met, pur, thi. ¿Cómo podemos distinguir entre estas dos ordenaciones? Afortunadamente, una de las cuatro posibles clases de recombinantes necesita dos entrecruzamientos adicionales. Cada orden posible predice una clase diferente que surge por cuatro entrecruzamientos en lugar de dos. Por ejemplo, si el orden fuera met, thi, pur, entonces los recombinantes met+ thi- pur+ serían muy raros. Por otro lado, si el orden fuera met, pur, thi, entonces la clase de cuatro entrecruzamientos sería met+ pur- thi+. A partir de la información dada en la tabla, la clase met+ pur- thi+ es claramente la clase de cuatro entrecruzamientos y, por lo tanto, el orden de genes correcto es met, pur, thi. c. Refiérase al siguiente diagrama: met+ 15.4 u.m. pur+ 1.8 u.m. thi+ Hfr met - pur - thi - F(pág. 214) (pág. 215) Para calcular la distancia entre met y pur, calculamos el porcentaje de met+ pur- thi-, que es 52/388 = 15.4 u.m. De forma similar, la distancia entre pur y thi es 6/338 = 1.8 u.m. Problema resuelto 5. Compare el mecanismo de transferencia y herencia de los genes lac+ en cruces con cepas lac+ Hfr, F+ y F’. ¿Cómo se comportaría una célula F- que no se pudiera someter a recombinación homóloga normal (rec-) en cruces con cada una de estas tres cepas? ¿Sería capaz la célula de heredar el gen lac+? SOLUCIÓN Cada una de estas tres cepas dona los genes por conjugación. En las cepas Hfr y F+, se donan los genes lac+ del cromosoma hospedador. En la cepa Hfr, el factor F se integra en el cromosoma de cada célula, así que los marcadores cromosómicos se pueden donar de manera eficiente, particularmente si un marcador está cerca del sitio de integración de F y se dona tempranamente. La población de células F+ contiene un pequeño porcentaje de células Hfr, donde F se integra en el cromosoma. Estas células son las responsables de la transferencia génica mostrada por los cultivos de células F+. En la transferencia génica mediada por Hfr y F+, la herencia requiere la incorporación de los fragmentos transferidos por recombinación (recuerde que se necesitan dos entrecruzamientos) en el cromosoma F-. Por lo tanto, una cepa F- que no puede llevar a cabo la recombinación no puede heredar los marcadores cromosómicos donados, aún cuando se transfieran de cepas Hfr o de células Hfr en cepas F+. El fragmento no se puede incorporar en el cromosoma por recombinación. Como estos fragmentos no poseen la capacidad de replicarse en la célula F-, se diluyen rápidamente durante la división celular. A diferencia de las células Hfr, las células F’ transfieren los genes que van en el factor F’, un proceso que no requiere la transferencia cromosómica. En este caso, los genes lac+ están ligados al factor F’ y se transfieren con él a una frecuencia elevada. En la célula F-, no se necesita la recombinación porque la cepa F’ lac+ puede replicarse y mantenerse en la población de células F- en división. Por lo tanto, los genes lac+ se heredan incluso en una cepa rec-. Problemas PROBLEMAS BÁSICOS 1. Describa el estado del factor F en una cepa Hfr, F+ y F-. 2. ¿Cómo un cultivo de células F+ transfiere los marcadores desde un cromosoma hospedador a uno receptor? 3. Con respecto a la transferencia génica y a la integración de los genes transferidos en el genoma receptor, compare a. Los cruces de Hfr por conjugación y la transducción generalizada. b. Los derivados de F’ como el F’ lac y la transducción especializada. 4. ¿Por qué la transducción generalizada es capaz de transferir cualquier gen, pero la transducción especializada está restringida sólo a un pequeño conjunto? 5. Una genetista microbióloga aísla una nueva mutación en E. coli y desea cartografiar su posición cromosómica. Utiliza los experimentos de apareamiento interrumpido con cepas Hfr y los experimentos de transducción generalizada con el fago P1. Explique por qué cada técnica, por si misma, es insuficiente para una cartografía precisa. 6. En E. coli, cuatro cepas Hfr donan los siguientes marcadores mostrados en el orden en que se donan: Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3: Cepa 4: M L A Z Z A L M X N B U W C R R C W U B Todas estas cepas provienen de la misma cepa F+. ¿Cuál es el orden de estos marcadores en el cromosoma circular de la F+ original? 7. Se le dan dos cepas de E. coli. La cepa Hfr es arg+ ala+ glu+ pro+ leu+ Ts; la cepa Fes arg- ala- glu- pro- leu- Tr. Todos los marcadores son nutricionales excepto T, que determina la sensibilidad o la resistencia al fago T1. El orden de entrada es el que se da, siendo arg+ el primero que entra en el receptor, y Ts, el último. Encuentra que la cepa F- muere cuando se expone a penicilina (pens), pero la cepa Hfr no muere (penr). ¿Cómo localizaría el locus para pen en el cromosoma bacteriano con respecto a arg, ala, glu, pro y leu? Formule su respuesta en pasos lógicos, bien explicados y dibuje diagramas específicos cuando sea posible. 8. Se realiza un cruce entre dos cepas de E. coli: Hfr arg+ bio+ leu+ × F- arg- bio- leu-. Los estudios de apareamiento interrumpido muestran que arg+ entra el último en el receptor, así que se seleccionan los recombinantes arg+ en un medio que solo contiene bio y leu. Estos recombinantes se examinan para la presencia de bio+ y leu+. Se han obtenido los siguientes números de individuos para cada genotipo: arg+ bio+ leu+ arg+ bio+ leu- arg+ bio- leu+ arg+ bio- leu- 320 8 0 48 a. ¿Cuál es el orden de los genes? b. ¿Cuáles son las distancias de mapa en porcentajes de recombinación? 9. Los mapas de ligamiento en una cepa bacteriana Hfr se calculan en unidades de minutos (el número de minutos entre dos genes indica la cantidad de tiempo que le lleva al segundo gen seguir al primero en la conjugación). Al realizar estos mapas, los genetistas microbiólogos asumen que el cromosoma bacteriano se transfiere de Hfr a F- a una (pág. 215) (pág.216) tasa constante. Así, se asume que dos genes separados por 10 minutos cerca del extremo de origen están separados por la misma distancia física que dos genes separados por 10 minutos cerca del extremo de fijación de F-. Sugiera un experimento crítico para comprobar la validez de este supuesto. 10. Una cepa Hfr particular normalmente transmite el marcador pro+ como el último en la conjugación. En un cruce de esta cepa con una cepa F-, se recuperan algunos recombinantes pro+ al principio del proceso de apareamiento. Cuando se mezclan estas células pro+ con células F-, la mayoría de las células F- se convierten en células pro+ que también llevan el factor F. Explique estos resultados. 11. Las cepas F’ en E. coli provienen de las cepas Hfr. En algunos casos, estas cepas F’ muestran una elevada tasa de reintegración en el cromosoma bacteriano de la segunda cepa. Además, el sitio de integración a menudo es el sitio ocupado por el factor sexual en la cepa Hfr original (antes de la producción de las cepas F’). Explique estos resultados. 12. Usted tiene dos cepas de E. coli, F- strr ala- y Hfr strs ala+, donde el factor F se inserta cerca de ala+. Idee un procedimiento de rastreo para detectar las cepas que lleven F’ ala+. 13. Cinco cepas Hfr de A a E provienen de una única cepa F+ en E. coli. El siguiente cuadro muestra los tiempos de entrada de los cinco primeros marcadores en una cepa F- cuando se utiliza cada cepa en un experimento de conjugación interrumpida: A B + + mal (1) ade (13) strs (11) his+ (28) ser+ (16) gal+ (38) C + pro (3) met+ (29) xyl+ (32) D + pro (10) gal+ (16) his+ (26) E + his (7) gal+ (17) pro+ (23) ade+ (36) pro+ (44) his+ (51) met+ (70) mal+ (37) strs (47) ade+ (41) ser+ (61) met+ (49) xyl+ (52) a. Dibuje un mapa de la cepa F+, indicando las posiciones de todos los genes y sus distancias de separación en minutos. b. Muestre el punto de inserción y la orientación del plásmido F en cada cepa Hfr. c. Al utilizar cada una de estas cepas Hfr, diga qué alelo seleccionaría para obtener la mayor proporción de ex conjugantes Hfr. 14. Las células de Streptococcus pneumoniae con genotipo strs mtl- se transforman con DNA donado de genotipo strr mtl+ y (en un experimento separado) con una mezcla de dos DNAs con genotipo strr mtl- y strs mtl+. La siguiente tabla muestra los resultados. DNA transformante strr mtl+ strr mtl- + strs mtl+ Porcentaje de células transformadas en strr mtlstrs mtl+ strr mtl+ 4.3 0.40 0.17 2.8 0.85 0.0066 a. ¿Qué le dice la primera línea de la tabla? ¿Por qué? b. ¿Qué le dice la segunda línea de la tabla? ¿Por qué? 15. Recuerde que, en el Capítulo 4, consideramos la posibilidad de que un suceso de entrecruzamiento pudiera afectar la probabilidad de otro entrecruzamiento. En el bacteriófago T4, el gen a está a 1.0 u.m. del gen b, que está a 0.2 u.m. del gen c. El orden de los genes es a, b, c. En un experimento de recombinación, se recuperan cinco entrecruzamientos dobles entre a y c de una progenie de 100 000 virus. ¿Es correcto concluir que la interferencia es negativa? Explique su respuesta. 16. Usted ha infectado células de E. coli con dos cepas de virus T4. Una cepa es minute (m), lisis rápida (r) y turbid (tu); la otra es de tipo salvaje para los tres marcadores. Los productos de la lisis de esta infección se siembran y se clasifican. Las 10 342 calvas resultantes se distribuyen entre ocho genotipos, como sigue: m r tu +++ mr+ m + tu 3467 3729 853 162 m++ + r tu +r+ + + tu 520 474 172 965 a. Determine las distancias de ligamiento entre m y r, entre r y tu, y entre m y tu. b. ¿Qué orden de ligamiento sugeriría para los tres genes? c. ¿Cuál es el coeficiente de coincidencia (véase Capítulo 4) en este cruce? ¿Qué significa? (El problema 16 está reimpreso con el permiso de Macmillan Publishing Co., Inc., de Monroe W. Strickberger, Genetics. Copyright 1968 por Monroe W. Strickberger). 17. Mediante el uso de P22 como un fago de transducción generalizada crecido en una bacteria donante pur+ pro+ his+, se infecta e incuba una cepa receptora con genotipo pur- pro- his-. Después, los transductantes para pur+, pro+ e his+ se seleccionan individualmente en los experimentos I, II y III, respectivamente. a. ¿Qué medios se utilizan para estos experimentos de selección? b. Los transductantes se examinan para la presencia de los marcadores donados no seleccionados, con los siguientes resultados: I II pro his 87% pur his43% pro+ his0% pur+ his0% pro- his+ 10% pur- his+ 55% pro+ his+ 3% pur+ his+ 2% ¿Cuál es el orden de los genes bacterianos? - III pur propur+ propur- pro+ pur+ pro+ - 21% 15% 60% 4% c. ¿Qué dos genes están más cercanos? d. Según el orden que ha propuesto en la parte c, explique las proporciones relativas de los genotipos observados en el experimento II. (pág. 216) (pág. 217) (El problema 17 es de D. Freifelder, Molecular Biology and Biochemistry. Copyright 1978 por W. H. Freeman and Company, New York). 18. Aunque la mayoría de transductantes gal+ mediados por son lisogénicos inducibles, un pequeño porcentaje de estos transductantes, de hecho, no son lisogénicos (es decir, no contienen el integrado). Los experimentos control muestran que estos transductantes no se producen por mutación. ¿Cuál es el posible origen de estos tipos? 19. Se sabe que una cepa bacteriana ade+ arg+ cys+ his+ leu+ pro+ es lisogénica para un fago descubierto recientemente, pero el sitio del profago no se conoce. El mapa bacteriano es La cepa lisogénica se utiliza como fuente del fago, y los fagos se añaden a una cepa bacteriana con el genotipo ade- arg- cys- his- leu- pro-. Tras una corta incubación, se siembran muestras de estas bacterias en seis medios distintos, con los suplementos indicados en la siguiente tabla. La tabla también muestra si las colonias se observaron en varios medios. Medio 1 2 3 4 5 6 Nutriente suplementado en el medio Ade Arg Cys His Leu Pro + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Presencia de colonias N N C N C N (En esta tabla un signo más significa la presencia del nutriente suplementado, un signo menos indica que el suplemento no está presente, N indica no colonias, y C indica colonias presentes). a. ¿Cuál es el proceso genético que actúa aquí? b. ¿Cuál es el locus aproximado del profago? 20. En un sistema de transducción generalizada que utiliza el fago P1, el donante es pur+ nad+ pdx+ y el receptor es pur- nad- pdx-. El alelo donado pur+ se selecciona inicialmente tras la transducción, y posteriormente se puntúan 50 transductantes pur+ para los otros alelos presentes. Aquí están los resultados: Genotipo nad+ pdx+ nad+ pdxnad- pdx+ nad- pdx- a. b. c. d. Número de colonias 3 10 24 13 50 ¿Cuál es la frecuencia de cotransducción para pur y nad? ¿Cuál es la frecuencia de cotransducción para pur y pdx? ¿Cuál de los loci no seleccionados está más cerca de pur? ¿nad y pdx están en el mismo lado o en lados opuestos de pur? Explíquelo. (Dibuje los intercambios que son necesarios para producir las diferentes clases de transformantes a partir de cada ordenación para ver cuál requiere el número mínimo para producir los resultados obtenidos). 21. En un experimento de transducción generalizada, los fagos se recogen de una cepa donante de E. coli con genotipo cys+ leu+ thr+ y se utilizan para transducir en una receptor con genotipo cys- leu- thr-. Inicialmente, la población receptora tratada se siembra en medio mínimo suplementado con leucina y treonina. Se obtienen muchas colonias. a. ¿Cuáles son los posibles genotipos de las colonias? b. Se realizan réplicas de estas colonias en tres medios distintos: (1) mínimo más treonina sólo, (2) mínimo más leucina sólo y (3) mínimo. ¿Qué genotipos podrían, en teoría, crecer en estos tres medios? c. De las colonias originales, se observa que el 56% crece en el medio 1, el 5% en el medio 2 y ninguna en el medio 3. ¿Cuáles son los genotipos reales de las colonias en los medios 1, 2 y 3? d. Dibuje un mapa que muestre el orden de los tres genes y cuál de los dos genes exteriores está más cerca del gen del medio. 22. Deduzca los genotipos de las siguientes cepas de E. coli de la 1 a la 4: Mínimo Mínimo más metionina Mínimo más arginina Mínimo más arginina y metionina 23. En un experimento de conjugación interrumpida en E. coli, el gen pro entra tras el gen thi. Una Hfr pro+ thi+ se cruza con una cepa F- pro- thi-, y los ex conjugantes se siembran en medio que contiene tiamina pero no prolina. Se observa un total de 360 colonias, y se aíslan y se cultivan en medio completamente suplementado. Estos cultivos se examinan para su capacidad de crecer en medio que no contenga ni prolina ni tiamina (medio mínimo), y se encuentra que 320 cultivos son capaces de crecer, pero no el resto. (pág. 217) (pág. 218) a. Deduzca los genotipos de los dos tipos de cultivos. b. Dibuje los sucesos de entrecruzamiento requeridos para producir estos genotipos. c. Calcule la distancia entre los genes pro y thi en unidades de recombinación. Problema 23 paso a paso 1. ¿Qué tipo de organismo es E. coli? 2. ¿Cómo es un cultivo de E. coli? 3. ¿En qué tipo de sustratos generalmente crece E. coli en su hábitat natural? 4. ¿Cuáles son las necesidades mínimas para que las células de E. coli se dividan? 5. Defina los términos protótrofo y auxótrofo. 6. ¿Qué cultivos en este experimento son prototróficos y cuáles son auxótroficos? 7. Dada algunas cepas de genotipo desconocido respecto a la tiamina y la prolina, ¿Cómo probaría cuáles son sus genotipos? De detalles precisos del experimento, incluyendo el equipamiento. 8. ¿Qué tipo de compuestos químicos son la prolina y la tiamina? ¿Tiene mucha importancia en este experimento? 9. Dibuje un diagrama que muestre el conjunto completo de manipulaciones realizadas en este experimento. 10. ¿Por qué cree que se realizó el experimento? 11. ¿Cómo se estableció que pro entra después que thi? De los pasos precisos del experimento. 12. ¿De qué manera difiere un experimento de apareamiento interrumpido del experimento descrito en este problema? 13. ¿Qué es un ex conjugante? ¿Cómo cree que se obtuvieron los ex conjugantes? (Puede incluir genes no descritos en este problema). 14. Cuando se dice que el gen pro entra después de thi, ¿quiere decir el alelo pro, el alelo pro+, cualquiera, o ambos? 15. ¿Qué es un “medio completamente suplementado” en el contexto de esta pregunta? 16. Algunos ex conjugantes no crecieron en medio mínimo. ¿En que medio crecerían? 17. Diga los tipos de entrecruzamiento que participan en la recombinación Hfr × F-. ¿Cómo difieren estos entrecruzamientos de los de eucariotas? 18. ¿Qué es una unidad de recombinación en el contexto del presente análisis? ¿Cómo difieren de las unidades de mapa usadas en la genética de eucariotas? 24. Un experimento de transducción generalizada utiliza una cepa metE+ pyrD+ como donante y metE- pyrD- como receptora. Se seleccionan los transductantes metE+ y se examinan para el alelo pyrD+. Se obtienen los siguientes números: metE+ pyrDmetE+ pyrD+ 857 1 ¿Estos resultados sugieren que estos loci están íntimamente ligados? ¿Qué otras explicaciones hay para el único “doble”? 25. Se infectó una cepa argC- con un fago transductante y se utilizó el lisado para transducir receptores metF- en un medio que contenía arginina pero no metionina. Los transductantes metF+ se examinaron para la necesidad de arginina: la mayoría era argC+ pero se encontró que un pequeño porcentaje era argC-. Dibuje diagramas para mostrar el posible origen de las cepas argC+ y argC-. PROBLEMAS PARA PENSAR 26. Cuatro cepas de E. coli con genotipo a+ b- se numeran 1, 2, 3 y 4. Cuatro cepas con genotipo a- b+ se numeran 5, 6, 7 y 8. Se mezclan los dos genotipos en todas las posibles combinaciones y (tras la incubación) se siembran para determinar la frecuencia de los recombinantes a+ b+. Se obtienen los siguientes resultados, donde M = muchos recombinantes, B = Bajo número de recombinantes, y 0 = no recombinantes: 5 6 7 8 1 0 0 B 0 2 M M 0 B 3 M M 0 B 4 0 0 M 0 De acuerdo con estos resultados, asigne un tipo sexual (ya sea Hfr, F+ o F-) a cada cepa. 27. Una cepa Hfr con genotipo a+ b+ c+ d- strs se aparea con una cepa hembra con genotipo a- b- c- d+ strr. El cultivo se agita vigorosamente en distintos tiempos para separar las parejas que se aparean. Posteriormente se siembran las células en agar de los siguientes tres tipos, donde el nutriente A permite el crecimiento de las células a; el nutriente B, de las células b-; el nutriente C, de las células c-, y el nutriente D, de las células d- (un signo más indica la presencia de estreptomicina o de un nutriente, y un signo menos indica su ausencia). Tipo de Agar 1 2 3 Str + + + A + + B + + - C + + D + + + a. ¿Qué genes donados se están seleccionando en cada tipo de agar? b. La siguiente tabla muestra el número de colonias en cada tipo de agar para las muestras tomadas en distintos tiempos tras la mezcla de las cepas. Utilice esta información para determinar el orden de los genes a, b y c. (pág. 218) (pág. 219) Tiempo de muestra (minutos) 0 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 25 Número de colonias en agar del tipo 1 2 3 0 0 0 0 0 0 100 0 0 200 0 0 300 0 75 400 0 150 400 50 225 400 100 250 400 100 250 c. De cada una de las placas de 25 minutos, se cogen 100 colonias y se transfieren a una placa de Petri que contiene agar con todos los nutrientes excepto D. Los números de colonias que crecen en este medio son 89 para la muestra del agar tipo 1, 51 para la muestra del agar tipo 2 y 8 para la muestra del agar tipo 3. Utilizando estos datos, sitúe el gen d dentro de la secuencia a, b y c. d. ¿En qué tiempo de muestra esperaría que aparecieran las primeras colonias en agar con C y estreptomicina pero sin A ni B? (El problema 27 es de D. Freifelder, Molecular Biology and Biochemistry. Copyright 1978 por W. H. Freeman and Company). 28. En el cruce Hfr aro+ arg+ eryr strs × F- aro- arg- erys strr los marcadores se transfieren en el orden dado (aro+ entrando el primero), pero los primeros tres genes están muy cercanos. Los ex conjugantes se siembran en un medio que contiene Str (estreptomicina, para matar las células Hfr), Ery (eritromicina), Arg (arginina) y Aro (aminoácidos aromáticos). Se obtienen los siguientes resultados de 300 colonias aisladas de estas placas y examinadas para el crecimiento en varios medios: en Ery solo, crecen 263 cepas; En Ery + Arg, crecen 264 cepas; en Ery + Aro, crecen 290 cepas; en Ery + Arg + Aro, crecen 300 cepas. a. Prepare una lista de genotipos e indique el número de individuos de cada genotipo. b. Calcule las frecuencias de recombinación. c. Calcule la proporción del tamaño de la región arg-a-aro respecto al tamaño de la región ery-a-arg. 29. Se realiza un experimento de transformación con una cepa donante que es resistente a cuatro fármacos: A, B, C y D. La receptora es sensible a los cuatro fármacos. La población celular receptora considerada se divide y se siembra en medios que contienen varias combinaciones de los fármacos. La siguiente tabla muestra los resultados. Fármaco añadido Número de colonias Fármaco añadido Número de colonias Ninguno A B C D AB AC AD 10 000 1156 1148 1161 1139 46 640 942 BC BD CD ABC ABC ACD BCD ABCD 51 49 786 30 42 630 36 30 a. Uno de los genes está obviamente bastante lejos de los otros tres, que parecen estar estrechamente ligados. ¿Cuál es el gen distante? b. ¿Cuál es el orden probable para los tres genes que están estrechamente ligados? (El problema 29 es de Franklin Stahl, The Mechanics of Inheritance, 2nd ed. Copyright 1969, Pretince Hall, Englewood Cliffs, N. J. Reimpreso con permiso). 30. Usted tiene dos cepas de que pueden lisogenizar E. coli; sus mapas de ligamiento son los siguientes: Cepa X Cepa Y El segmento que se muestra en la parte inferior del cromosoma, designado 1-2-3, es la región responsable del apareamiento y entrecruzamiento con el cromosoma de E. coli. (Mantenga los marcadores en todos sus dibujos). a. Esquematice la forma en que la cepa X de se inserta en el cromosoma de E. coli (de modo que se lisogeniza E. coli). b. Las bacterias que son lisogénicas para la cepa X pueden ser superinfectadas utilizando la cepa Y. Un determinado porcentaje de estas bacterias superinfectadas llega a ser lisogénica “doble” (es decir, lisogénica para ambas cepas). Esquematice cómo ocurrirá. (No se preocupe sobre cómo se detectan los lisogénicos dobles). c. Esquematice cómo los dos profagos se pueden aparejar. d. Se pueden recuperar los productos del entrecruzamiento entre los dos profagos. Esquematice un suceso de entrecruzamiento y las consecuencias. 31. Usted tiene tres cepas de E. coli. La cepa A es F’ cys+ trp1/cys+ trp1 (es decir, tanto F’ como el cromosoma llevan cys+ y trp1, un alelo que hace que se requiera triptófano). La cepa B es F- cys- trp2 Z (esta cepa necesita cisteína para crecer y lleva trp2, otro alelo que causa una necesidad de triptófano; la cepa B es lisogénica para (pág. 219) (pág. 220) el fago Z con transducción generalizada). La cepa C es F- cys+ trp1 (es un derivado F- de la cepa A que ha perdido el F’). ¿Cómo determinaría si trp1 y trp2 son alelos del mismo locus? (Describa los cruces y los resultados esperados). 32. Se utiliza un fago con transducción generalizada para transducir una cepa receptora a- b- c- d- e- de E. coli con una donante a+ b+ c+ d+ e+. El cultivo receptor se siembra en varios medios con los resultados que se muestran en la siguiente tabla. (Note que a+ indica una necesidad del nutriente A, y así sucesivamente). ¿Qué puede concluir sobre el ligamiento y el orden de los genes? Compuestos añadidos al medio mínimo CDE BDE BCE BCD ADE ACE ACD ABE ABD ABC Presencia (+) o ausencia (-) de colonias + + + - 33. En 1965, Jon Beckwith y Ethan Signer concibieron un método para obtener fagos con transducción especializada que llevaran la región lac. Sabían que el sitio de integración, llamado att80, para el fago atemperado Ф80 (un pariente del fago ) estaba cerca de tonB, un gen que confiere resistencia al fago virulento T1: tonB att80 Utilizaron un plásmido F’ lac+ que no podía replicar a temperaturas elevadas en una cepa que llevaba una deleción de los genes lac. Forzando la célula a mantenerse lac+ a altas temperaturas, los investigadores pudieron seleccionar cepas en las que el plásmido se había integrado en el cromosoma, permitiendo, de ese modo, que F’ lac permaneciera a altas temperaturas. Mediante la combinación de esta selección con una selección simultánea para la resistencia a la infección por el fago T1, encontraron que los únicos supervivientes eran células en las que el F’ lac se había integrado en el locus tonB, como se muestra aquí: tonB F’ lac att80 Este resultado situó la región lac cerca del sitio de integración del fago Ф80. Describa los pasos siguientes que los investigadores debieron seguir para aislar las partículas con transducción especializada del fago Ф80 que llevaban la región lac. 34. E. coli de tipo salvaje ingiere y acumula un determinado colorante alimentario rojo, que hace que las colonias sean de color rojo sangre. Se utilizó mutagénesis mediante transposón y se sembraron las células en colorante alimentario. La mayoría de colonias eran rojas, pero algunas colonias ingieren el colorante y eran blancas. En una colonia blanca, se secuenció el DNA de alrededor del transposón insertado mediante el uso de un cebador de la replicación del DNA idéntico a una parte del extremo de la secuencia del transposón, y se encontró que la secuencia adyacente al transposón correspondía a un gen de función desconocida llamado atoE, que iba desde la posición 2.322 hasta la 2.324 Mb del mapa (numerado desde una posición cero arbitraria). Proponga una función para atoE. ¿Qué proceso biológico se podría investigar de esta forma y qué otros tipos de colonias blancas se esperarían? PIES DE FIGURA Figura inicial Células bacterianas en división. (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.). Figura 5-1 Los frutos de la tecnología del DNA recombinante son una realidad por la genética bacteriana Los resultados espectaculares de la moderna tecnología del DNA, como la secuenciación del genoma humano, fueron posibles debido a que la genética bacteriana condujo a la invención de vectores de manipulación de DNA eficientes. (Science, vol. 291, nº 5507 (16 Febrero 2001), págs. 1145-1434. Imagen de Ann E. Cutting). Figura 5-2 Intercambio de DNA bacteriano por varios procesos El DNA bacteriano se puede transferir de una célula a otra célula de cuatro maneras: conjugación con transferencia plasmídica, conjugación con transferencia parcial del genoma, transformación y transducción. Figura 5-3 Colonias bacterianas, cada una deriva de una única célula Los fenotipos bacterianos se pueden determinar en sus colonias. Un stock de células bacterianas puede crecer en medio líquido que contenga nutrientes, y posteriormente se puede extender un pequeño número de células de la suspensión líquida en medio sólido con agar. Cada célula formará una colonia. Todas las células de una colonia tienen el mismo genotipo y fenotipo. Figura 5-4 Distinción de lac+ y lac- utilizando una tinción roja Las bacterias de tipo salvaje capaces de utilizar lactosa como fuente de energía (lac+) se tiñen de rojo en presencia de este colorante indicador. Las células no teñidas son mutantes incapaces de utilizar lactosa (lac-). (Jeffrey H. Miller). Figura 5-5 La mezcla de genotipos bacterianos produce recombinantes infrecuentes Mediante el uso de este método, Lederberg y Tatum demostraron que es posible la recombinación genética entre genotipos bacterianos. (a) El concepto básico: dos cultivos autotróficos (A- y B-) se mezclan, produciendo protótrofos de tipo salvaje (WT; del inglés Wild Type). (b) Las células del tipo A o del tipo B no pueden crecer en medio no suplementado (mínimo) (MM), ya que tanto A como B llevan mutaciones que causan la incapacidad de sintetizar constituyentes necesarios para el crecimiento celular. Sin embargo, cuando se mezclan A y B durante unas horas y posteriormente se siembran, aparecen unas cuantas colonias en la placa de agar. Estas colonias provienen de células individuales en las que se ha intercambiado el material genético; por lo tanto, son capaces de sintetizar todos los constituyentes requeridos en el metabolismo. Figura 5-6 No se producen recombinantes sin contacto celular Las cepas bacterianas auxotróficas A y B crecen a cada lado del tubo en U. El líquido puede pasar entre los brazos al aplicar presión o succión, pero las células bacterianas no pueden pasar a través del filtro. Tras la incubación y la siembra, no crecen colonias recombinantes en el medio mínimo. Figura 5-7 Las bacterias conjugan utilizando los pili Una célula donante extiende una o más proyecciones, o pili, que hacen contacto con una célula receptora y acerca ambas bacterias. (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.) Figura 5-8 Transferencia del plásmido F durante la conjugación (a) Durante la conjugación, el pilus acerca dos bacterias. (b) Posteriormente, se forma un puente (esencialmente un poro) entre las dos células. Se producen una copia de cadena sencilla del DNA plasmídico en la célula donante y pasa a la bacteria receptora, donde la cadena sencilla, actuando como molde, se convierte en una hélice de doble cadena. Figura 5-9 La integración del plásmido F crea una cepa Hfr En una cepa F+, el plásmido F libre se integra, ocasionalmente, en el cromosoma de E. coli, creando una cepa Hfr. Figura 5-10 El DNA donado se transfiere como una cadena sencilla Las fotografías muestran una visualización de la transferencia del DNA de cadena sencilla en las células de E. coli mientras conjugan, con el uso de anticuerpos fluorescentes especiales. Las cepas parentales Hfr (A) son negras con el DNA rojo. El rojo es de la unión de un anticuerpo a una proteína normalmente unida al DNA. Las células receptoras F- (B) son verdes debido a la presencia de un gen que codifica una proteína de medusa que es verde fluorescente, y, como no son mutantes para un determinado gen, su proteína de DNA no se une al anticuerpo. Cuando el DNA de cadena sencilla entra en la receptora, se promueve la unión atípica de esta proteína, que es amarilla fluorescente en ese fondo. La parte C muestra las Hfr (sin cambios) y los ex conjugantes (células que se han sometido a la conjugación) con el DNA transferido amarillo. Se observan unas pocas células F- que no han apareado. (De M. Kohiyama, S. Hiraga, I. Matic y M. Radman, “Bacterial Sex: Playing Voyeurs 50 Years Later”, Science 301, 2003, p. 803, Fig. 1). Figura 5-11 Los entrecruzamientos integran partes de los fragmentos donados transferidos Tras la conjugación, los entrecruzamientos son necesarios para integrar los genes del fragmento donado en el cromosoma receptor y, además, para que sean una parte estable de su genoma. Figura 5-12 El seguimiento temporal de la entrada de marcadores genera un mapa cromosómico En este experimento de conjugación con apareamiento interrumpido, las células Fresistentes a estreptomicina con mutaciones en azi, ton, lac y gal se incuban durante distintos tiempos con células Hfr que son sensibles a estreptomicina y llevan los alelos de tipo salvaje para esos genes. (a) Un gráfico de la frecuencia de los alelos donados en los ex conjugantes como función del tiempo tras el apareamiento. (b) Una vista esquemática de la transferencia de los marcadores (mostrados en distintos colores) con el paso del tiempo. ((a) de E. L. Wollman, F. Jacob y W. Hayes, Cold Spring Hargor Symp. Quant. Biol. 21, 1956, 141). Figura 5-13 Un entrecruzamiento sencillo inserta F en un locus específico, que posteriormente determina el orden de la transferencia génica La inserción de F crea una célula Hfr. Los hipotéticos marcadores 1 y 2 se muestran en F para representar la dirección de la inserción. El origen (O) es el punto de movilización donde ocurre la inserción en el cromosoma de E. coli; la región de apareamiento es homóloga a una región del cromosoma de E. coli; de a a d son genes representativos del cromosoma de E. coli. Las regiones de apareamiento (tramadas) son idénticas en el plásmido y el cromosoma. Provienen de elementos móviles llamados secuencias de inserción (véase Capítulo 14). En este ejemplo, la célula Hfr creada por la inserción de F transferiría sus genes en el orden a, d, c, b. Figura 5-14 El sitio de integración de F determina el orden de la transferencia génica en las HFRs Cada una de las cinco cepas Hfr de E. coli tiene distinto punto de inserción y orientación del plásmido F. Todas las cepas tienen el mismo orden de genes en el cromosoma de E. coli. La orientación del factor F determina qué gen entra primero en el receptor. El gen más cercano al término entra el último. Figura 5-15 Dos posibles tipos de transferencia de DNA durante la conjugación La conjugación puede ocurrir por transferencia parcial de un cromosoma que contenga el factor F o por transferencia de un plásmido F que permanezca como una entidad separada. Figura 5-16 Un entrecruzamiento sencillo no puede producir un recombinante viable Un entrecruzamiento sencillo entre el exogenote y el endogenote en un merocigoto produciría un cromosoma lineal, parcialmente diploide, que no sobreviviría. Figura 5-17 Generación de varios recombinantes por entrecruzamiento en diferentes regiones El diagrama muestra cómo se pueden cartografiar los genes por recombinación en E. coli. En los ex conjugantes, se seleccionan los merocigotos que llevan el marcador leu+, que se dona al final. Los primeros marcadores (arg+ y met+) pueden estar insertados o no, según el sitio donde haya ocurrido la recombinación entre el fragmento Hfr y el cromosoma F-. Las frecuencias de los sucesos esquematizados en a y b se utilizan para obtener los tamaños relativos de las regiones leu-arg y arg-met. Note que, en cada caso, sólo el DNA insertado en el cromosoma F- sobrevive; el otro fragmento se pierde. Figura 5-18 La formación de un bucle defectuoso produce F’, un plásmido F que contiene DNA cromosómico Un factor F puede tomar DNA cromosómico conforme sale del cromosoma. (a) F se inserta en un elemento repetitivo identificado como IS1 (secuencia de inserción 1; del inglés, Insertion Sequence 1) entre los alelos ton y lac+ de en una cepa Hfr. (b) El factor F insertado. (c) “Formación del bucle” anormal por entrecruzamiento con un elemento distinto, IS2, para incluir el locus lac. (d) La partícula F’ lac+ resultante. (e) Un diploide parcial F’ lac+/F- lac- producido por la transferencia de la partícula F’ lac+ a un receptor F- lac-. (De G. S. Stent y R. Calendar, Molecular Genetics, 2nd ed. Copyright 1978 por W. H. Freeman and Company). Figura 5-19 Plásmido con segmentos de muchos hospedadores bacterianos previos El diagrama muestra los orígenes de los genes del plásmido pK214 de Lactococcus lactis. Los genes proceden de muchas bacterias distintas. (Datos de la Tabla 1 en V. Perreten, F. Schwarz, L. Cresta, M. Boeglin, G. Dasen y M. Teuber, Nature 389, 1997, 801-802). Figura 5-20 Plásmido R con genes de resistencia llevados en un transposón Un transposón como el Tn5 puede adquirir varios genes de resistencia a fármacos (en este caso, los de resistencia a los fármacos kanamicina y neomicina) y transmitirlos rápidamente en un plásmido, llevando a la transferencia infecciosa de los genes de resistencia como un paquete. La secuencia de inserción 50 (IS50) flanquea TN5. Figura 5-21 Mecanismo de absorción de DNA por bacterias Una bacteria realizando la transformación (a) toma DNA libre de una célula bacteriana muerta. Mientras los complejos de unión a DNA de la superficie bacteriana toman el DNA (detalle aumentado), las enzimas rompen una cadena en nucleótidos y un derivado de la otra cadena puede integrarse en el cromosoma bacteriano (b). (De R. V. Miller, “Bacterial Gene Swapping in Nature”. Copyright 1998 por Scientific American, Inc. Todos los derechos reservados). Figura 5-22 Estructura y función del fago T4 Un fago infeccioso inyecta el DNA a través de la estructura del núcleo en la célula. (Izquierda) El bacteriofago T4 se muestra como un fago libre y después en el proceso de infectar una célula de E. coli. (Derecha) Los componentes estructurales principales de T4. (De R. S. Edgar y R. H. Epstein, “The Genetics of a Bacterial Virus”. Copyright 1965 por Scientific American, Inc. Todos los derechos reservados). Figura 5-23 Micrografía electrónica del fago T4 El aumento del fago T4 de E. coli revela detalles de la cabeza, cola y fibras de la cola. (Fotografía de Jack D. Griffith). Figura 5-24 Micrografía electrónica de una infección de fagos Los bacteriofagos se muestran en varios estados del proceso de infección, que incluye la adsorción y la inyección del DNA. (Dr. L. Caro/Science Photo Library, Photo Researchers). Figura 5-25 Ciclo de un fago que lisa las células hospedadoras La infección por un único fago redirecciona la maquinaria celular hacia la producción de progenie de fagos, que se liberan en la lisis. (De J. Darnell, H. Lodish y D. Baltimore, Molecullar Cell Biology. Copyright 1986 por W. H. Freeman and Company). Figura 5-26 Una calva es un área clara donde todas las bacterias se han lisado por fagos Mediante la repetición de infección y producción de progenie de fagos, un único fago produce un área clara, o calva, en el cultivo confluente opaco de células bacterianas. (Barbara Morris, Novagen). Figura 5-27 Cruce de fagos realizado por infección doble de la célula hospedadora con fagos parentales Figura 5-28 Calvas de progenie de fagos recombinantes y parentales Estos fenotipos de calva fueron producidos por la progenie del cruce h- r+ × h+r-. Se pueden diferenciar cuatro fenotipos de calva, representando los dos tipos parentales y los dos recombinantes. (De G. S. Stent, Molecular Biology of Bacterial Viruses. Copyright 1963 por W. H. Freeman and Company). Figura 5-29 Transducción generalizada por incorporación aleatoria de DNA bacteriano en las cabezas de los fagos Un fago recién formado puede coger DNA del cromosoma de su célula hospedadora (arriba) e inyectarlo en una nueva célula (abajo derecha). El DNA inyectado puede insertarse en el nuevo cromosoma hospedador por recombinación (abajo izquierda). En realidad, sólo una minoría muy pequeña de la progenie de fagos (1 en 10 000) lleva genes donados. Figura 5-30 A partir de las altas frecuencias de cotransducción se puede inferir el ligamiento estrecho El diagrama muestra el mapa genético de la región purB-a-cysB de E. coli determinado por la cotransducción con P1. Los números dados son los promedios en porcentaje para las frecuencias de cotransducción obtenidas en varios experimentos. Los valores en paréntesis se consideran poco fiables. (De J. R. Guest, Mol. Gen. Genet. 105, 1969, 285). Figura 5-31 La transferencia del profago durante la conjugación puede provocar la lisis Un profago se puede transferir a un receptor durante la conjugación, pero el profago provoca la lisis, un proceso llamado inducción cigótica, sólo si el receptor no tiene ya un profago –es decir, en el caso que se muestra en la parte a pero no en la parte b. Figura 5-32 El fago se inserta por entrecruzamiento en el sitio específico La recombinación recíproca ocurre entre el sitio de fijación específico en el DNA circular de y una región específica llamada el sitio de fijación en el cromosoma de E. coli entre los genes gal y bio. Figura 5-33 La formación de un bucle defectuoso produce fagos que contienen DNA bacteriano El diagrama muestra como se produce la transducción especializada en el fago . (a) Un entrecruzamiento en el sitio de fijación especializado produce una bacteria lisogénica. (b) La bacteria lisogénica puede producir normales (i) o, raramente, dgal (ii), una partícula transductante que contiene el gen gal. (c) Los transductantes gal+ se pueden producir por (i) la coincorporación de dgal y (actuando como ayudante) o (ii) entrecruzamientos que flanquean el gen gal, un suceso poco común. Las cajas dobles azules son el sitio de fijación bacteriano, la cajas dobles moradas son el sitio de fijación de , y los pares de cajas azul y morada son sitios de integración híbridos, que provienen parcialmente de E. coli y parcialmente de . Figura 5-34 Mapa del genoma de E. coli obtenido genéticamente El mapa genético de 1963 de los genes de E. coli con mutantes fenotípicos. Las unidades son minutos, basado en experimentos de apareamiento interrumpido y de recombinación. Los asteriscos se refieren a posiciones del mapa que no son tan precisas como otras posiciones. (De G. S. Stent, Molecular Biology of Bacterial Viruses. Copyright 1963 por W. H. Freeman and Company). Figura 5-35 Parte del mapa físico del genoma de E. coli, obtenido por secuenciación Un dibujo a escala lineal de una sección de 5 minutos del mapa de ligamiento de 1990 de E. coli de 100 minutos. Los paréntesis y asteriscos indican marcadores para los que se desconocía la posición exacta en el momento de publicación. Las flechas sobre los genes y grupos de genes indican la dirección de la transcripción. (De B. J. Bachmann, “Linkage Map of Escherichia coli K-12, Edition 8”, Microbiol. Rev. 54, 1990, 130197). Figura 5-36 Mapa físico del genoma de E. coli Este mapa se obtuvo de la secuenciación del DNA y representando las posiciones de los genes. Clave de los componentes desde el exterior hasta el interior: Se marcan el origen y término de la replicación del DNA. Las dos escalas están en pares de bases de DNA y en minutos. Los histogramas en naranja y amarillo muestran la distribución de los genes en las dos cadenas de DNA. Las flechas representan los genes para el rRNA (rojo) y el tRNA (verde). La “explosión estelar” central es un histograma de cada gen con líneas cuya longitud reflejan el nivel predicho de transcripción. (F. R. Blattner et al., “The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12”, Science 277, 1997, 1453-1462. Imagen cortesía de Dr. Guy Plunkett III). Figura 5-37 Las proporciones de los mapas genéticos y físicos son similares pero no idénticas Un alineamiento de los mapas genéticos y físicos. (a) Marcadores en el mapa genético de 1990 en la región cerca de 60 y 61 minutos. (b) La posición exacta de cada gen, basada en la secuencia completa del genoma de E. coli. (No se ha nombrado cada gen en este mapa, por simplicidad). Las cajas alargadas son genes y genes putativos. Cada color representa un tipo distinto de función. Por ejemplo, el rojo indica funciones regulatorias, y el azul oscuro indica funciones de replicación, recombinación y reparación del DNA. Las líneas entre los mapas en las partes a y b conectan el mismo gen en cada mapa. (F. R. Blattner et al., “The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12”, Science, vol. 277 September 5, 1997, pp. 1453-1462. Imagen cortesía de Dr. Guy Plunkett III). Figura 5-38 La mutagénesis por transposón se puede utilizar para cartografiar una mutación en la secuencia genómica La inserción de un transposón inserta una mutación en un gen de posición y función desconocida. El segmento que sigue al transposón se replica, se secuencia y se se le busca su concordancia con un segmento de la secuencia completa del genoma. Parcheados de las figuras Figura 5-2 Intercambio de DNA bacteriano por varios procesos 1. Transformación 2. Transferencia parcial del genoma por absorción del DNA 3. Conjugación 4. Transferencia plasmídica durante la conjugación 5. Plásmidos 6. Genoma 7. Virus 8. Conjugación 9. Transferencia parcial del genoma durante la conjugación 10. Transducción 11. Transferencia como parte del genoma vírico Figura 5-3 Colonias bacterianas, cada una deriva de una única célula 1. Suspensión de células bacterianas 2. Extensión de la suspensión en una placa de Petri con gel de agar 3. Incubación de 1 a 3 días 4. Placa de Petri con gel de agarosa 5. Células individuales (no visibles a simple vista) 6. Colonias visibles (cada una un clon de la célula individual correspondiente) Figura 5-5 La mezcla de genotipos bacterianos produce recombinantes infrecuentes 1. Mezcla 2. Alguna progenie 3. Mezcla 4. Lavado de células 5. Siembra ~108 células 6. No colonias 7. Colonias prototróficas 8. No colonias Figura 5-6 No se producen recombinantes sin contacto celular 1. Tapón de algodón poroso 2. Presión o succión 3. Cepa A 4. Cepa B 5. Filtro fino Figura 5-8 Transferencia del plásmido F durante la conjugación 1. Donante F+ 2. Plásmido 3. Cromosoma bacteriano 4. Pilus 5. Receptor FFigura 5-9 La integración del plásmido F crea una cepa Hfr 1. F integrado Figura 5-11 Los entrecruzamientos integran partes de los fragmentos donados transferidos 1. www. ANIMATED ART Conjugación y recombinación bacteriana 2. Transferencia de la copia de DNA de cadena sencilla 3. Ex conjugante 4. Fragmento transferido convertido en doble hélice 5. Recombinante 6. Perdido 7. Un doble entrecruzamiento inserta el DNA donado Figura 5-12 El seguimiento temporal de la entrada de marcadores genera un mapa cromosómico 1. Frecuencia (%) de caracteres genéticos Hfr entre los ex conjugantes strr 2. Tiempo (minutos) 3. Factor F 4. Origen Figura 5-13 Un entrecruzamiento sencillo inserta F en un locus específico, que posteriormente determina el orden de la transferencia génica 1. Regiones homólogas donde puede ocurrir el emparejamiento 2. Cromosoma de E. coli 3. Último en transferir 4. Dirección de transferencia 5. Primero en transferir Figura 5-14 El sitio de integración de F determina el orden de la transferencia génica en las HFRs 1. Factor de fertilidad 2. Origen (primero en entrar) 3. Término (último en entrar) Figura 5-15 Dos posibles tipos de transferencia de DNA durante la conjugación 1. Transferencia cromosómica 2. Transferencia plasmídica 3. Inserción del factor F 4. Conjugación y transferencia el factor F 5. Conjugación y transferencia cromosómica 6. Recombinación 7. No recombinación Figura 5-16 Un entrecruzamiento sencillo no puede producir un recombinante viable 1. No viable Figura 5-17 Generación de varios recombinantes por entrecruzamiento en diferentes regiones 1. www.ANIMATED ART Conjugación bacteriana y cartografiado por recombinación 2. (1) Inserción del último marcador sólo 3. 4. 5. 6. 7. Fragmento Hfr Cromosoma F(b) Inserción del último marcador y un marcador anterior (c) Inserción de todos los marcadores (d) Inserción del primer y el último marcador, pero no del marcador del medio Figura 5-18 La formación de un bucle defectuoso produce F’, un plásmido F que contiene DNA cromosómico 1. (a) Inserción 2. Factor F integrado 3. Cromosoma Hfr 4. (c) Escisión 5. (e) Diploide parcial F’lac+/lacFigura 5-19 Plásmido con segmentos de muchos hospedadores bacterianos previos 1. Plásmido pk214 Figura 5-20 Plásmido R con genes de resistencia llevados en un transposón 1. Plásmido conjugativo 2. Transposón Tn5 Figura 5-21 Mecanismo de absorción de DNA por bacterias 1. DNA libre 2. Complejo de unión al DNA 3. Pared celular 4. Nucleótido 5. Membrana citoplasmática 6. DNA libre de una bacteria muerta 7. Enzima de degradación del DNA 8. Cromosoma 9. Bacteria transformada 10. DNA transferido Figura 5-22 Estructura y función del fago T4 1. Fago libre 2. Fago infectando 3. DNA inyectado 4. Pared celular 5. Componentes del fago T4 6. Cabeza 7. Cuello y collar 8. Núcleo 9. Vaina 10. Placa basal 11. Fibras Figura 5-25 Ciclo de un fago que lisa las células hospedadoras 1. Célula no infectada 2. Adsorción del fago a la célula hospedadora 3. Entrada del ácido nucleico del fago 4. Proteínas del fago sintetizadas y material genético replicado; cromosoma hospedador degradado 5. Proteína del fago 6. Cromosoma hospedador degradado 7. Ácido nucleico del fago 8. Ensamblaje de los fagos en la célula hospedadora 9. Lisis de la célula hospedadora 10. Fagos libres 11. Ciclo lítico Figura 5-26 Una calva es un área clara donde todas las bacterias se han lisado por fagos 1. Áreas claras, o calvas Figura 5-27 Cruce de fagos realizado por infección doble de la célula hospedadora con fagos parentales 1. E. coli cepa 1 Figura 5-29 Transducción generalizada por incorporación aleatoria de DNA bacteriano en las cabezas de los fagos 1. Bacteria donante 2. Fagos que llevan los genes donados 3. Bacteria receptora 4. Bacteria transducida Figura 5-31 La transferencia del profago durante la conjugación puede provocar la lisis 1. No inmune 2. Lisis (inducción cigótica) 3. Inmune 4. No lisis Figura 5-32 El fago se inserta por entrecruzamiento en el sitio específico 1. Fago 2. Sitio de fijación 3. Cromosoma de E. coli 4. Enzimas de integración 5. integrado en el cromosoma de E. coli 6. Cromosoma de E. coli Figura 5-33 La formación de un bucle defectuoso produce fagos que contienen DNA bacteriano 1. (a) Producción de lisogenia 2. Sitios de fijación 3. (b) Producción del lisado inicial 4. (i) Bucle normal 5. (ii) Bucle anormal poco común 6. Mezcla 7. (c) Transducción mediante el lisado inicial 8. ayudante 9. (i) Transductantes lisogénicos 10. (ii) Transductantes producidos por recombinación Figura 5-36 Mapa físico del genoma de E. coli 1. Replicón 1 2. Fin 3. Replicón 2 4. Origen 5. E. coli K-12 MG1655 4 639 221 pb Figura 5-38 La mutagénesis por transposón se puede utilizar para cartografiar una mutación en la secuencia genómica 1. Célula de tipo salvaje 2. Transposón 3. Fenotipo mutante inducido por la inserción del transposón 4. Síntesis cebador 5. Identificación del gen completo a partir de la secuencia genómica TABLAS Tabla 5-1 Algunos símbolos genotípicos utilizados en la genética bacteriana Símbolo Carácter o fenotipo asociado con el símbolo bioNecesita biotina añadida como suplemento al medio mínimo argNecesita arginina añadida como suplemento al medio mínimo met Necesita metionina añadida como suplemento al medio mínimo lacNo puede utilizar lactosa como fuente de carbono gal No puede utilizar galactosa como fuente de carbono r str Resistente al antibiótico estreptomicina strs Sensible al antibiótico estreptomicina Tabla 5-2 Determinantes genéticos llevados por plásmidos Característica Ejemplos de plásmidos Fertilidad F, R1, Col Producción de bacteriocinas Col E1 Resistencia a metales pesados R6 Producción de enterotoxina Ent Metabolismo del alcanfor Cam Tumorigénico en plantas T1 (en Agrobacterium tumefaciens) Tabla 5-3 Marcadores acompañantes en la transducción específica de P1 Experimento Marcador seleccionado Marcador no seleccionado 1 leu+ 50% son azir; 2% son thr+ 2 thr+ 3% son leu+; 0% son azir + + 3 leu y thr 0% son azir