Bacterias[1]
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Bacterias Objetivos: Después de este laboratorio el estudiante podrá: 1. Conocer que es un dominio y cómo se clasifican los organismos en cada Dominio. 2. Conocer las características que distinguen a las células procariotas de las eucariotas. 3. Conocer cuáles son las características principales de los organismos dentro del Dominio Bacteria. 4. Identificar las formas principales de las bacterias. 5. Realizar prácticas asépticas básicas para manejar cultivos de bacterias. 6. Poder preparar una laminilla sencilla de una bacteria. 7. Conocer y realizar varios métodos simples para hacer cultivos de bacterias. 8. Conocer algunos ejemplos acerca de la importancia económica, ecológica y médica que tienen las bacterias. Introducción: Los organismos procariotas son por mucho los más abundantes en la Tierra. Se pueden encontrar en prácticamente todas partes, incluso en ambientes extremos químicos, de altas temperatura y de gran variabilidad en disponibilidad de oxígeno. Aunque quizás se reconozcan más por incluir organismos patógenos causantes de enfermedades y desastres agrícolas, la realidad es que obtenemos beneficios de muchos procariotas y su importancia, médica, ecológica y económica, es grande. Los organismos procariotas juegan un papel vital en la productividad y el ciclo de sustancias esenciales para todas las demás formas de vida; siendo las bacterias los únicos organismos capaces de fijar el nitrógeno atmosférico. Entre los beneficios económicos tenemos el uso de bacterias acido-lácticas para fermentar o crecer cultivos de alimentos como por ejemplo yogurt, queso y mantequilla. Algunos usos industriales son el uso de bacterias para la producción de etanol, para la aceleración del proceso de compostaje y para la producción de abono para la agricultura. Inclusive algunos procariotas pueden descomponer contaminantes lo cual es útil en la bioremediación. Los organismos procariotas están clasificados dentro de dos dominios: Bacteria y Archaea. Los organismos eucariotas se clasifican dentro del dominio Eukarya. Los organismos clasificados dentro del Dominio Archaea, antes se clasificaban junto a las bacterias, pero difieren de las mismas en composición de membranas, las secuencias de ARN y ADN. Las archaebacterias es un grupo diverso de organismos que aunque tiene organismos que crecen en ambientes no extremos incluye organismos metanógenos y extremófilos. Ejemplos de ambientes extremófilos donde viven archaebacterias son: altas temperaturas y alta salinidad En este laboratorio estudiaremos organismos pertenecientes al Dominio Bacteria: las bacterias y las cianobacterias o algas verde-azules. Repasando las características de las células procariotas tenemos que no poseen organelos rodeados por membranas y que el material genético se encuentra dentro de una molécula circular de ADN. Pueden, además tener pequeños anillos de ADN adicional, que se conocen como plásmidos. Las bacterias y cianobacterias tienen la mayoría una pared celular, pero su composición no es igual a la pared celular vegetal, ya que el componente principal de la pared en bacterias son peptidoglicanos, mientras el de las células vegetales es celulosa. Muchas de las bacterias son organismos heterótrofos, lo cual quiere decir que consiguen su alimento de otros organismos. Algunas de las bacterias heterótrofas son parasíticas, por lo cual se conocen como bacterias patógenas; mientras que otras son saprofíticas, alimentándose de organismos muertos, causando la descomposición de los mismos y así permitiendo que los elementos puedan estar disponibles para ser usados como materia prima por otros organismos. Algunas bacterias son autótrofas, o sea que producen su propio alimento por medio de fotosíntesis o quimiosíntesis. Todos los organismos vivos dependemos de las bacterias y cianobacterias fijadoras de nitrógeno, ya que ningún otro organismo vivo tiene esta capacidad que libera el nitrógeno para que este pueda ser usado como materia prima para compuestos orgánicos. Es en este contexto que podemos encontrar las micorizas que son bacterias fijadoras de nitrógeno viviendo en simbiosis con plantas. La forma de reproducción más común es la fisión binaria. Existen otras formas de reproducción menos comunes, como sería la conjugación por la se produce recombinación genética de todo o parte del material genético de las células. En condiciones adversas muchas bacterias pueden formar endosporas. Antes de proceder a realizar los ejercicios se debe conocer que hay varias reglas y procedimientos asépticos a seguir al trabajar con cultivos de bacterias: Su instructor proveerá e ilustrará las reglas y métodos correctos para trabajar con bacterias. Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que esté manejando bacterias. Tenga precaución al trabajar con los mecheros. Limpie su mesa de trabajo, antes y después de realizar los ejercicios, con un desinfectante. Lávese las manos bien, antes y después del laboratorio. Todo cultivo deberá ser manejado con cuidado y deberá ser tratado como posible patógeno. Ejercicio 1: Identificando bacterias. Debido al tamaño pequeño de las bacterias y su similaridad en estructura celular, para identificar bacterias se utilizan criterios diferentes que los usados en la identificación de organismos macroscópicos. Para identificar bacterias se usan diferencias en tinción, formas de crecimiento, nutrición y fisiología. En este ejercicio se observarán e identificarán formas comunes de bacterias. Se practicará además como realizar una preparación y tinción simple de una laminilla de bacterias. 1.a. Identificando morfología individual de bacterias Las bacterias se clasifican bajo tres formas básicas: bacilos, cocos o espirilos. Los bacilos tienen una forma ovalada y alargada formando bastoncillos. Los cocos tienen una forma circular y los espirilos o vibrios parecen espirales o comas. Estos pueden estar formando cadenas o grupos, aunque cada célula manteniendo su integridad. Materiales Microscopio compuesto Laminillas preparadas de bacilos, cocos y espirilos Aceite de inmersión Papel de lente Procedimiento: Consiga una laminilla preparada de bacterias. Tendrá varias laminillas a observar de bacterias mixtas o individuales de cocos, bacilos o espirilos. Monte la laminilla en su microscopio a una baja magnificación y observe. ¿Qué puede distinguir? ¿Qué implica esto acerca del tamaño de las bacterias? Cambie a una magnificación mayor, usando el objetivo 40X y observe. ¿Qué formas puede observar? Cambie ahora al objetivo 100X. Enfoque la laminilla usando solamente el botón de ajuste fino o micrométrico. Mueva el objetivo fuera de la laminilla y coloque una gota de aceite de inmersión sobre la laminilla. Ponga el lente objetivo en posición y enfoque otra vez. * Recuerde que al terminar de ver una laminilla con aceite de inmersión se debe limpiar la laminilla y el lente objetivo con papel de lente para remover los rastros del aceite. NO use otro tipo de papel ya que rayara los lentes. ¿Puede observar alguna diferencia al usar el aceite de inmersión? Dibuje los tres tipos de bacterias por su forma. 1.b. Identificando formas de bacterias que ocurren en nuestras encías Las partículas de alimento que se acumulan en las encías crean un ambiente ideal para el crecimiento de las bacterias. La mezcla de material de los alimentos y las bacterias forman lo que conocemos como placa dental. En este ejercicio se observará las formas de las bacterias que forman parte de la placa dental . Materiales Microscopio compuesto Aceite de inmersión Papel de lente Laminillas y cubreobjetos Palillos de dientes Pinche de ropa de madera Mechero Fósforos Botella con gotero con tinte de Cristal violeta Botella con gotero de agua destilada Bandeja para tensión Botella con agua destilada Papel secante o papel toalla. Procedimiento Usando un palillo de diente raspe el área del diente cercana a la encía. Ponga en una laminilla una gota de agua bien pequeña. Coloque su muestra sobre la laminilla. Deje que se seque la laminilla al aire. Usando un mechero y agarrando la laminilla por un extremo con el pinche de ropa flamee la laminilla a un ángulo de 45° Esto lo debe hacer rápidamente y varias veces. La laminilla debe estar caliente, pero que la pueda tocar. Con un gotero aplique 3-4 gotas de cristal violeta sobre la laminilla en la bandeja de tinción y deje teñir por 1 minuto. Lave con chorro suave de agua destilada hasta que la mayor parte del color se vaya de la laminilla. Seque gentilmente con papel secante (Bilobous paper) o papel toalla. Observe bajo el microscopio. Para poder observar la laminilla mejor deberá usar el objetivo 100X y aceite de inmersión. ¿Qué formas puede observar en la laminilla? ¿Las bacterias están individuales o agregadas? ¿Se pueden observar todas las formas de las bacterias? ¿Qué tipo de bacterias son las más abundantes? Ejercicio 2: Identificación de formas de colonias Aunque usualmente para la clasificación de las bacterias se deben realizar tinciones y otras pruebas, observaciones de la morfología de las colonias pueden ser útiles para la identificación preliminar de las especies. Una colonia se puede formar a partir de una sola bacteria y se compone de millones de células. Como regla general en estudios de bacterias no se cuentan organismos individuales sino cantidad de colonias. Es importante además poder describir estas colonias. En este experimento observaremos placas con algunas bacterias para ver las características que muestran las mismas en cuanto al crecimiento de las colonias. Para este ejercicio tendrá disponible en el laboratorio varias placas Petri con diferentes colonias de bacterias creciendo en cada placa. Busque una placa y sin abrirla observe usando el estereoscopio. Describa las colonias usando los siguientes criterios: forma, color, apariencia, forma del borde y textura de la colonia. Compare con otras placas disponibles. Los criterios a seguir son los siguientes: a. Forma de la colonia: puntiforme (a) (menos de 1mm de diámetro), redonda (b), irregular (c) o filamentosa (d). b. c. Margen de la colonia: entero (a), curveado (b), ondulado (c), lobulado (d) o filamentoso (e). La diferencia entre curveado, ondulado o filamentoso estriba en el tipo de curva en el borde. El lobulado es irregular, el curveado es regular y más apretado, mientras que el ondulado son curvas mas relajadas. d. Textura de la colonia: lisa (a), concéntrica (b), arrugada (c) o con curvas o contorno (d). La diferencia entre concéntrica y con curvas es que el diámetro de la concéntrica se va haciendo más pequeño de forma regular a medida que se sube en la colonia, mientras en la que tiene curvas el contorno es mas irregular. e. Color de la colonia. ¿Porque no usamos cantidad de colonias como criterio? ¿Pudo hacer todas las observaciones de las colonias para todos los cultivos? ¿Qué problemas encontró? ¿Es este el mejor método o el método primordial para identificar las colonias? Explique. Ejercicio 3. Bacterias en el medio ambiente. Las bacterias se encuentran en una gran variedad de medios ambientes. En este ejercicio compararemos diferentes medios para observar la presencia de bacterias en varios medios de nuestro entorno. Materiales: Platos Petri con agar Papel de parafina Isopos estériles de algodón Lápiz de cera Incubadora. Procedimiento: 1. Obtenga un plato petri de su instructor y escoja un lugar para muestrear. Algunos ejemplos pueden ser estanques de agua, exposición de la placa en algún lugar en particular como por ejemplo ambiente aéreo o de tierra. Asegúrese de que se escojan diferentes ambientes por mesa de laboratorio. Para transferir muestras líquidas a su placa siga el siguiente procedimiento para hacer la siembra en la placa. Con un isopo estéril de algodón recoja parte de la muestra. Sin presionar fuertemente el la superficie del agar distribuya su muestra con movimientos de izquierda a derecha sobre un tercio de la superficie del agar (1). Gire su placa y empezando en parte del área 1 haga lo mismo a la región 2. Gire su placa nuevamente y empezando en la región 2 haga lo mismo en la región 3. Este método le asegurara que las bacterias vayan reduciendo en densidad y para la región 3 pueda ver colonias aisladas. 2. Si la muestra proviene de algún lugar seco como por ejemplo tierra, tome un poco de muestra y humedezca con agua hasta poder sacar parte del material diluido en el agua y siembre como se mostró anteriormente para una muestra líquida. Es importante que no tome mucho particulado grande sino el que se encuentra diluido en agua y que pudo tomar con el isopo. 3. Si el lugar a muestrear es aire en algún lugar en específico abra la placa en el lugar deseado y exponga el agar por 10 a 15 minutos. 4. Luego de tomar la muestra cierre el plato con un pedazo de parafina, rotule y coloque en incubadora boca abajo por 48 horas a 25° C. Saque de la incubadora y guarde en la nevera hasta la próxima reunión de laboratorio. 5. Observe las placas y compare con los demás ambientes muestreados por sus compañeros. ¿Observó diferencias entre los ambientes muestreados? ¿Qué tipos de ambientes mostraron más crecimientos de bacterias? Ejercicio 4: Resistencia a antibióticos y antisépticos Aun cuando la mayoría de las bacterias son beneficiosas y necesarias para mantener un ambiente óptimo, un crecimiento descontrolado puede ser dañino o destructivo para otras especies. Algunas bacterias son patógenas, o sea causan enfermedades en plantas y animales. Se han desarrollado agentes para controlar el crecimiento de las bacterias. En este ejercicio se usaran antibióticos, antisépticos y desinfectantes para ver como estos afectan el crecimiento de las bacterias. Un antibiótico es un químico producido por una bacteria o un hongo que tiene el potencial de controlar el crecimiento de otra bacteria y hongo. Otros agentes que usamos para limpieza se usan para el control de bacterias. Aquellos usados para controlar bacterias sobre tejidos vivos se conocen como antisépticos y los que se usan es objetos o superficies no vivas son los desinfectantes. Para realizar este experimento se deben seguir los pasos de asepsia a continuación para evitar la contaminación de nuestros cultivos. 1. Al abrir cultivos esto se debe hacer por la cantidad mínima de tiempo posible. 2. Las agujas de inocular se deben pasar por una llama y dejar enfriar brevemente antes de introducirla en el cultivo de bacterias. Si utiliza hisopos de algodón, no tiene que realizar este paso. 3. Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que esté manejando bacterias y mantenga los cultivos lejos de su cara. 4. No agite los tubos con cultivos de bacterias antes de abrir y mantenga los mismos en una rejilla para sostenerlos mientras no lo estén usando. 5. Lávese las manos con agua y jabón antes y después de hacer el ejercicio. 6. Limpie su mesa de trabajo con un desinfectante antes y después de los ejercicios de este laboratorio. Materiales Plato Petri con agar Isopos estériles de algodón Parafina Mechero con alcohol Fósforos Tubo Con cultivo en caldo de bacterias Discos estériles Discos con antibióticos Lápiz de cera Procedimiento: 1. Rotule en plato petri y divida en 4 cuadrantes el fondo de su plato con el lápiz de cera. Rotule 1-4. 2. Prepare un sembrado en su plato como muestra la figura. Abra el tubo con el cultivo y flamee levemente la abertura. Con isopo estéril de algodón remueva un poco del caldo. Flamee abertura del tubo y cierre. Abra su plato y sin presionar fuertemente cubra toda la superficie del agar con movimientos de izquierda a derecha, tomando el cuidado de llegar hasta los bordes del plato petri. Rote el plato 45° y haga lo mismo. Cierre su plato. 3. En el centro del cuadrante 1 coloque un disco estéril. ¿Porque se coloca un disco estéril? 4. En el centro del cuadrante 2 coloque un disco con antibiótico provisto por su instructor. Es importante anote el nombre del antibiótico ya que puede variar por mesa de laboratorio. 5. En el cuadrante 3 coloque un antiséptico. 6. En el cuadrante 4 coloque un desinfectante. 7. Selle su placa con parafina y coloque boca arriba en incubadora a 37° C. Observe de 24-48 horas y transfiera a nevera. 8. En su próximo periodo de laboratorio examine su placa para ver si sus tratamientos afectaron el crecimiento de las bacterias. Mida el diámetro (en milímetros) de la zona de inhibición de cada tratamiento (zona alrededor del disco donde el crecimiento de las bacterias fue inhibido por el agente usado). 9. Compare sus resultados con las demás placas hechas en el laboratorio. ¿Fue la zona de inhibición igual para todos los tratamientos? ¿Fueron los tratamientos con antibióticos más efectivos que los antisépticos o desinfectantes? Basado en sus resultados, ¿qué antiséptico fue más efectivo? ¿Qué desinfectante? ¿El efecto de los agentes usados es el mismo para todo tipo de bacterias? ¿Por qué? Ejercicio 5. Efectividad en lavarse las manos para inhibir el crecimiento de las bacterias. En este ejercicio compararemos el crecimiento de las bacterias con distintas maneras de limpiarse las manos versus el no lavárselas. Materiales Plato Petri con agar Papel de parafina Jabón Lápiz de cera Incubadora Procedimiento: 1. Divida un el fondo de un plato petri en 4 partes y numere de la siguiente forma: a. Manos sin lavar b. Manos lavadas con agua c. Manos lavadas con agua y jabón d. Manos lavadas con agua y jabón luego de 5 minutos 2. Con mucho cuidado levante un poco la placa (para evitar exponer la placa a las bacterias del ambiente) y toque sin presionar fuertemente la placa con el dedo sin lavar. 3. Lave una mano con agua solamente y presione en otro cuadrante con un dedo húmedo 4. Lave sus manos con agua y jabón y con un dedo húmedo presione sobre otro cuadrante. 6. Espere 5 minutos y use ese mismo dedo para presionar el último cuadrante. 7. Cierre la tapa con papel de parafina, incube por 24 horas a 25°C, y transfiera a nevera hasta el siguiente periodo de laboratorio. 8. Analice el resultado y llene la siguiente tabla: Cuadrante Cantidad de colonias Cantidad de colonias diferentes Apariencia de las colonias A B C D ¿Pudo observar más de un tipo de bacterias en la placa? Describa los diferentes tipos de crecimiento. ¿Qué cuadrante tuvo menos colonias y cual tuvo más? Discuta sus resultados. ¿Se observaron diferencias notables entre el tratamiento C y D? ¿Qué espera que pase si pasa más tiempo?