s1-bio01 influencia de los parámetros cinéticos de la fermentación

INFLUENCIA DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA FERMENTACIÓN,
EN LA COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA DE LOS POLISACÁRIDOS
CONTENIDOS EN LA PARED CELULAR DE LA LEVADURA
SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
B, Aguilar Uscangaa. J, Solis Pachecoa. J, Franςiosb
a
Centro de Investigación y Asistencia y Diseño del estado de Jalisco, Av. Normalista 800,
44270, Guadalajalra, Jal. [email protected] b Institute National de Sciences
Appliquées de Toulouse. 135, Avenue de Rangueil, 31077 Toulouse, France.
[email protected].
RESUMEN
La pared celular de las levaduras es una estructura dinámica que representa de 20 a 30 % del total de la célula
en peso seco. Se compone de polisacáridos, en proporción de 58% en -glucanos, 40 % de manoproteínas y
un 2% de quitina. Algunos estudios consideran que la composición y estructura de la pared celular de
Saccharomyces cerevisiae puede variar notablemente con la edad, el estrés y con modificaciones del medio de
cultivo. En particular los (1,6)-glucanos y la quitina, juegan un rol importante durante el ensamblaje de la
pared y las uniones entre los (1,3)-glucanos y manoproteínas.
1. INTRODUCCIÓN
La pared celular es un órganelo que protege a la célula de los ataques enzimáticos, proporcionando
principalmente estructura y forma a la célula. El estudio de la síntesis, composición y ensamblaje de la pared
celular en levaduras, ha ido en aumento en los últimos años. La pared celular de Saccharomyces cerevisiae se
encuentra constituida principalmente por polisacáridos en proporción de 60 % en glucanos, 35 % en
manoproteínas y un 5 % de quitina (Flete y Manners, 1977, Klis 1994). Esta puede variar considerablemente
en estructura y composición en respuesta al estrés, condiciones de cultivo, edad y a modificaciones genéticas
(Fleet 1991, Klis et al, 2002, Aguilar y Franςios 2003).
La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una capa interna transparente y amorfa
constituida principalmente de (1,3) y (1,6)-glucanos, compuestos mayoritarios de la pared, responsables de
mantener la forma y rigidez a la célula, favorecen la resistencia a los cambios osmóticos y mecánicos
(Shreuder et al., 1996, Lipke y Ovalle, 1998). Las manoproteínas se encuentran ubicadas en la capa externa
ancladas a la capa interna de -glucanos o bien la atraviesan completamente. Son las responsables de la
porosidad de la pared, juegan un rol de filtro selectivo y protección contra los ataques químicos y enzimáticos
de tipo glucanasa (Cid et al., 1995, Nguyen, et al., 1998). No existe separación neta entre las dos capas de
polisacáridos (Zlotnik et al., 1984). Por otro lado la capa interna parece estar constituida de varios espacios,
formados por la quitina unida a -glucanos. La quitina juega un rol importante durante la morfología y
formación de células del ciclo celular, tiene la función de formar la cicatriz durante la separación de la célula
madre e hija (gemación), encontrándose la mayor concentración de esta en la formación de la gema (Flete
1991). A nivel molecular, la arquitectura de la pared celular parece estar constituida por bloques de
construcción flexibles, que reagrupan a los componentes a través de uniones covalentes como una estructura
ordenada (Cabib et al., 2001).
Se han desarrollado algunos métodos analíticos para la cuantificación de los polisacáridos presentes en la
pared celular de levaduras, con la finalidad de conocer el contenido y variación de estos compuestos, en
diferentes cepas de levaduras nativas y modificadas, relacionando la variación de estos polisacáridos con la
resistencia de la célula a la ruptura mecánica o enzimática y a la acción de los antibióticos (Ha et al., 2002,
Magnelli et al, 2002). Las técnicas usadas para el análisis de estos compuestos, se basan principalmente en
fraccionar e hidrolizar los polisacáridos por métodos químicos, los monómeros liberados de la hidrólisis son
cuantificados y analizados por cromatografía HPLC (Dallies et al., 1998, Magnelli et al, 2002, Aguilar y
Franςios 2003).
El interés de continuar con el estudio de los polisacáridos contenidos en la pared celular en cepas de
levaduras, es para obtener cepas con pared celular mas débil, poder extraer los metabolitos al interior de la
célula y aprovechar el contenido de glucanos, mananos y quitina, extrayéndolos de la pared celular por
métodos químicos o enzimáticos. Cabe mencionar que los polisacáridos pueden ser usados en la industria de
los alimentos, fármacos y cosmetología, como emulsificantes, agentes texturizantes, sustitutos de grasa y
como fuente de fibra dietética. (Cameron, et al., 1988, Ledoux, et al., 1992, Kasai, et al, 2000). Además la
quitina, la cual tiene la función de brindar soporte y defensa a la célula, ofrece resistencia ante los agentes
químicos y disolventes orgánicos, se emplea en la industria farmacéutica para la elaboración de pastillas
antiácidas (Muzzarelli, 1996, Ganzazzade, et al., 1997).
2. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1 Cultivo y recolección de células.
La cepa utilizada en este estudio pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae CNPK 113-7D, la cual fue
seleccionada por que ha sido modelo de estudio por un gran numero de laboratorios pertenecientes al
programa europeo de biotecnología “Yeast as a Cell Factory”. La levadura fue cultivada en matraz y
fermentador de 2 litros, utilizando un medio mineral enriquecido. Las condiciones de crecimiento fueron:
temperatura 30 oC, agitación 300 rpm y aireación 1vvm. Se trabajó a pH de 3, 4, 5 y 6 y se varió la fuente de
carbono utilizando glucosa, manosa, galactosa, sacarosa, maltosa y etanol a concentración de 20 g/L. Durante
la fase exponencial se recolectaron las células de levadura a una DO aproximadamente de 1.0 a 600 nm. Las
células se centrifugaron y se lavaron con agua destilada fría (8 oC), para eliminar los residuos del medio de
cultivo. Finalmente se realizó un lavado de las células con solución buffer Tris-HCL 1M pH 8, la suspensión
se centrifugó y se eliminó el sobrenadante para la recuperación de las células y posteriormente se llevó a cabo
la extracción y los análisis correspondientes de la pared celular.
2.2 Extracción, hidrólisis y análisis de los componentes de la pared celular.
La extracción de la pared celular se realizó en forma mecánica utilizando un “bead beater” y perlas de vidrio
de 0.5mm. Posteriormente los fragmentos de pared celular fueron lavados con solución buffer Tris-HCL 1M
pH 8 y centrifugados. Las muestras obtenidas del precipitado, que contenían la pared celular, fueron
hidrolizadas con una solución de H2SO4 al 72 % durante 4 horas a 100oC. Los monómeros liberados de
glucosa, manosa y glucosamina productos de la hidrólisis, fueron analizados por cromatografía HPLC de
anión, unida a una detección amperométrica, marca Dionex Bio-LC. La detección se lleva acabo en el
electrodo de AgCl/Ag por la oxidación de los azúcares. La columna utilizada fue una CarboPac PA-10,
elusión isocrática con NaOH 18 mM y un flujo de 1mL/mn.
2.3 Análisis de sensibilidad de la célula al rompimiento con Zymolyasa 20T.
Las células recuperadas de los diferentes cultivos, fueron sometidas a una prueba de lisis celular con
zymolyasa 20T, esta técnica nos permite observar la sensibilidad de las células al rompimiento por la enzima
y consiste en agregar 10 unidades de zymolyasa a 3 mL de una suspensión celular con aproximadamente 1.5
x107 células/mL a temperatura ambiente. Enseguida se mide la absorbancia y se va midiendo la disminución
de la DO en intervalos de 5 a 10 minutos durante 2 horas, de acuerdo al método descrito por Ovalle y
colaboradores en 1998.
3.DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
3.1 Variación de la fuente de Carbono
La figura 1 nos muestra que los polisacáridos contenidos en la pared celular (glucanos, mananos y quitina), de
la levadura cultivada en diferentes fuentes de carbono, varían considerablemente dependiendo de la fuente de
carbono utilizada. El porcentaje de pared celular en peso seco va desde 10% para el cultivo realizado en
etanol y hasta un 25 % en el cultivo efectuado con sacarosa. Las células cultivadas en galactosa, manosa y
etanol presentan una mayor cantidad de quitina, probablemente como respuesta a la adaptación de las células
para crecer y consumir estas fuentes de carbono. Por otro lado, la concentración de glucanos y mananos varia
Polisacáridos g/g célula)
significativamente según la fuente de carbono utilizada. Encontrando concentraciones de 38 g de glucanos
por gramo de célula en etanol, hasta 116 g/g de célula en los cultivos con sacarosa. Los mananos por su
parte varían también en composición, observando mayor cantidad de estos en los cultivos realizados con
sacarosa (138 g/g) hasta 78 g de mananos por gramo de célula en etanol. Estas variaciones se deben
probablemente a que la fuente de carbono afecta la actividad de la (1,3) y (1,6) glucan-sintasa, provocando
un aumento o disminución de estos polisacáridos durante su síntesis, como es el caso de los cultivos
realizados en etanol. La levadura no tubo ningún problema en consumir la sacarosa, manosa, galactosa,
maltosa y glucosa, por lo que no afectó a la síntesis de glucanos ni mananos, pero si tubo problemas para
consumir el etanol. Por lo tanto, la levadura sintetizó una pared celular mas gruesa en proporción entre 25 a
30% en peso seco de la célula, cuando fue cultivada con las diferentes fuentes de carbono, en comparación a
la levadura cultivada en etanol la cual presentó un porcentaje de pared celular de un 13 % en peso seco.
La prueba para determinar la resistencia de las células a la ruptura con la zymolyasa se observa en la figura.2.
Esta nos indica que las células mas resistentes al rompimiento celular son aquellas cultivadas en etanol,
siguiendo las células cultivadas en galactosa y maltosa y finalmente las mas sensibles a la zymolyasa fueron
las células cultivas en glucosa, manosa y sacarosa, mostrando una tasa de lisis dos veces mas alta con respecto
a las células crecidas en etanol. Por lo tanto, comparando este resultado con respecto al contenido de
polisacáridos en la pared celular (fig. 1), concluimos que un alto o bajo contenido en polisacáridos, no influye
ni es proporcional a la resistencia de las células a la lisis por la zymolyase, si no que está resistencia va ligada
a la cantidad de -glucanos, así como de los niveles entre los enlaces (1,3) y (1,6)-glucanos contenidos en
la estructura parietal.
160
140
120
100
80
60
40
20
0
glu
man
quitina
gal
sac
mal
Fuente de Carb
ono
glucanos
eta
mananos
Figura 1. Análisis de los polisacáridos de la pared celular de la levadura Saccharomyces cerevisiae
cultiva en medio mineral a diferentes fuentes de carbono.
glucose
1
mannose
0,8
galactose
Maltose
0,6
DO
660nm
0,4
Saccharose
Ethanol
0,2
0
0
100
200
300
400
500
t(mn)
Figura 2. Análisis de los polisacáridos de la pared celular, de las células cultivadas en diferentes fuentes
de carbono y sometidas al tratamiento enzimático con Zymoliasa 20T.
Polisacáridos g/g célula)
3.2. Variación del pH en el medio de cultivo.
Los resultados obtenidos del análisis de la composición de los polisacáridos contenidos en la pared celular de
la levadura CEN:PK-7D de Saccharomices cultivadas en medio mineral con glucosa a diferentes pH (3, 4, 5 y
6) se muestran en la figura 3. Podemos observar claramente la variación que muestran los polisacáridos
cuando la célula de levadura es sometida a pH diferentes. El pH optimo de la Saccharomyces cerevisiae es de
5, sin embargo esta puede crecer en un rango de pH de 3 hasta de 6. Como se muestra en la gráfica, el
contenido de quitina fue mayor a pH 6 (5.4 g/g de célula), en comparación al obtenido a pH 5 (2.4 g/g de
célula). Durante la cinética de crecimiento a los diferentes pH (datos no mostrados), la levadura presentó una
velocidad de crecimiento lenta a pH de 6, lo que nos indica que la Saccharomyces debe adaptarse a su medio
y a la condición de cultivo, adoptando cambios importantes en su composición y estructura en la pared
celular.
El resultado obtenido de la prueba de resistencia de las células al rompimiento por la zymolyasa, realizada
con las células de levadura cultivas a los diferentes pH, son mostrados en la figura 4. Podemos observar que a
pH 3 la levadura es mas resistente a la lisis con respecto a los otros cultivos. A pH 4, 5 y 6 la resistencia de las
células al rompimiento es casi la misma y como se dijo anteriormente la resistencia de las células a la lisis por
esta enzima, va ligada a la cantidad de (1,3) y (1,6)-glucanos contenidos en la estructura parietal, siendo
estos los que delimitan la lisis celular y determinan la resistencia de la célula a los ataques enzimáticos de tipo
glucanasa y a algunos antibióticos. En el caso de las células que presentan mayor resistencia a esta enzima, es
probable que el contenido de enlaces covalentes de (1,6) ligados a la estructura parietal sea mayor que los
enlaces (1,3), de esta forma la enzima no puede lisar la célula, ya que esta es específica para romper enlaces
(1,3) y por lo tanto la célula es mas resistente al rompimiento.
160
140
120
100
80
60
40
20
0
quitina
pH 3
pH 4
pH 5
Fuente de Carb
ono
pH 6
glucanos
mananos
Figura 3. Análisis de los polisacáridos de la pared celular de la levadura Saccharomyces cerevisiae
cultiva en medio mineral a diferentes pH.
pH3
pH4
1
0,8
pH5
pH6
0,6
DO
600nm 0,4
0,2
0
0
100
200
300
400
500
t(mn)
Figura 4. Análisis de los polisacáridos de la pared celular, de las células cultivadas en diferentes fuentes
de carbono y sometidas al tratamiento enzimático con Zymoliasa 20T.
4. CONCLUSIÓN:
Se ha demostrado que la levadura Saccharomyces cerevisiae, puede crecer y desarrollarse en diferentes
fuentes de carbono y condiciones de cultivo. Sin embargo cuando la levadura crece en un medio con una
fuente de carbono diferente a la glucosa o bien en condiciones de cultivo variando el pH o la temperatura,
estas pueden sufrir cambios importantes respecto a su morfología, principalmente en la composición y
estructura de su pared celular. Además la resistencia de las células de levadura a la zymolyasa, no depende de
la cantidad de -glucanos contenidos en la pared, si no de la cantidad de enlaces (1,3) y (1,6)-glucanos que
constituyen en gran parte a la arquitectura de la pared celular. En conclusión la pared celular es una estructura
dinámica que varia, haciendo mayor o menos resistente a la célula al rompimiento mecánico o enzimático,
dependiendo de las condiciones y del medio de cultivo.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilar-Uscanga, B. and Francios, J.M. A study of the yeast cell wall composition and structure in
response to growth conditions and mode of cultivation. Letter in Applied Microbiology Vol. 37 (3),
(2003), pp.268-274.
2. Cabib,E., Roh,D.H., Schmidt,M., Crotti,L.B., and Varma,A The yeast cell wall and septum as
paradigms of cell growth and morphogenesisJ. Biol. Chem. 276. (2001). pp. 19679-19682.
3. Cameron, D.R., Cooper, D.G., and Neufeld, R.J. The mannoprotein of Saccharomyces cerevisiae is
an effective bioemulsifier. Appl. Environ. Microbiol 54. (1988). pp. 1420-1425.
4. Cid,V.J., Duran,A., Del Rey,F., Snyder,M.P., Nombela,C., and Sanchez,M. Molecular basis of cell
integrity and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev. 59(1995). Pp.345-386.
5. Dallies,N., Francois,J., and Paquet,V. A new method for quantitative determination of
polysaccharides in the yeast cell wall. Application to the cell wall defective mutants of
Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14. (1998) pp. 1297-1306.
6. Fleet,G.H. and Manners,D.J. The enzymic degradation of an alkali-soluble glucan from the cell walls
of Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol 98, (1977). pp.315-327.
7. Fleet G.H. Cell Wall. in " The Yeast ".(2ed). Yeast Organelles. Rose A.H. and Harrison J.S. (eds).
Academic Press, London, (1991).pp.199-277.
8. Klis, F.M. Review: Cell wall assembly In Yeast 10, (1994). pp.851-869.
9. Klis, F.M. Hellingwerf, K. and Brul, S. Dynamics of the cell wall structure in Saccharomyces
cerevisiae Microbiol Mol. Biol. Rev. 26. (2002). pp.239-256.
10. Lipke, P. and Ovalle,R. Cell Wall architecture in yeast: New structure and new challenges.
J.Bacteriol. 180. (1998). pp. 3735-3740.
11. Nguyen, T., Fleet,G. and Rogers, P. Composition of the cell walls of several yeast species. Appl.
Microbiol.Biotechnol. 50 (1998). pp. 206-212.
12. Ha,C.H., Lim,K.H., Kim,Y.T., Lim,S.T., Kim,C.W., and Chang,H.I. Analysis of alkali-soluble
glucan produced by Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutants. Appl. Microbiol. Biotechnol.
58. (2002). pp. 370-377.
13. Heinisch J.J. and Hollenberg. Yeast. In " Biotechnology " Chap. 14, Vol. 1. Second, Completely,
Revised. Edited by REHM H.J. and REED G. Weinheim, New York, Basel, Cambridge, Tokyo.
(1993). pp. 470-503.
14. Kasai,T., Eguchi,T., Ishiwaki,N., Kaneshige,J., Ozeki,T., and Yuasa,H. Application of acid-treated
yeast cell wall (AYC) as a pharmaceutical additive I. AYC as a novel coating material. Int. J. Pharm.
204. (2000). pp. 53-59.
15. Ganzazade, A., Sklyar, A., Nasibov, S. Sushkov, I., Shashkov, A. and Knirel, Y. Structural features
of sulphated chitosans. Carbohydrate Polymers, 34 (1997). pp. 113-116.
16. Ledoux, V., Dulau, L and Dubourdieu, D. Interprétation de l’amélioration de la stabilité protèique
des vins au cours de l’élevage sur lies. J.Inten. Sci. Vigne Vin 26 (1992). pp. 239-251.
17. Magnelli, P., Cipollo, J.F. and Abeijon, C. A refined method for the determination of Saccharomyces
cerevisiae cell wall composition and b-1,6-glucan fine structure. Anal. Biochem. 301 (2002). pp.
136-150.
18. Muzzarelli, R, A. Chitosan-based dietary foods. Carbohydrate Polymers, 29. (1996). pp. 309-316.
19. Ovalle, R.,Lim, S.T., Holder, B., Jue, C.J., Moore, C.W. and Lipke, P.N. Spheroplast Rate Assay for
Determination of Cell Wall Integrity in Yeast. Yeast.Vol.14 (1998). p.p. 1159-1166.