Modificaciones experimentales del genoma.

Modificaciones
experimentales
del Genoma
El DNA recombinante al
servicio de la salud humana.
Luisa Herrera
15 y 17 de junio
comprensión de las causas y modo de
herencia de las enfermedades genéticas.
¿Como enfrentar esas enfermedades?
Nivel de intervención
Gen mutado
mRNA mutado
Proteína mutada
Estrategia de tratamiento
Modificación del genotipo somático.
•Transplate (de medula osea)
•Terapia por reemplazo celular. Stem cells
•Terapia genica
Modulación farmacológica de la expresión génica
(butirato aumenta expresión de HbF en anemia falciforme)
Reemplazo de la proteína. Ej factor VIII en hemofilia A
Aumento de la función residual
Disfunción bioquímica
o metabólica
Compensación de la enfermedad específica
Dieta: baja en fenilalanina en pacientes con fenilcetonuria
Farmacológico: benzoato de sodio (defectos en ciclo de la urea).
Intervención médica: Ej transfusión en anemia falciforme
Fenotipo clínico
La familia
Intervención quirúrgica: corrección de enfermedades cardiacas
congénitas
Consejo genético
Búsqueda de portadores
Diagnóstico presintomático: Ej Enfermedad de Huntington
Ejemplos de enfermedades genéticas tratables
Tratamiento
Reparación Quirúrgica y remoción
•Reparación quirúrgica
Enfermedad
•Remoción del bazo
Fisura de labio y fisura
palatina
Esferocitosis hereditaria
Tratamiento con drogas de un síntoma mayor
•Bloqueadores beta (reducir la presión en la aorta)
Síndrome de Marfán
•Hidroxiurea (inh. formación de GR en forma de Hoz)
Anemia falciforme
Restricción dietaria de un precursor
•Fenilalanina
Fenilcetonuria
•Galactosa
Galactosemia
Ejemplos de enfermedades genéticas tratables…cont
Tratamiento
Enfermedad
Eliminación de una sustancia en exceso
•Cobre (penicilamina)
Enfermedad de Wilson
•Colesterol (unión de bilis)
Hipercolesterolemia familiar
•Ácido úrico (varias drogas)
Gota
Reemplazo de un producto génico faltante
•Insulina
Diabetes juvenil
•Hormona de crecimiento
Enanismo pituitario
•Factor de coagulación VIII
Hemofilia A
•Adenosina desaminasa (ADA)
Deficiencia de ADA. Inmunodeficiencia
combinada severa (SCID)
Ejemplos de enfermedades genéticas tratables…cont
Tratamiento
Transplante de tejidos y órganos
•Medula ósea
Enfermedad
•Terapia por reemplazo celular
Inmunodeficiencia combinada severa
(SCID) y XSCID
Parkinson
Terapia génica
•Agregando ADA a linfocitos T
Deficiencia de ADA
Terapia antisentido
•Bloquea la síntesis de una proteína de
adhesión celular
RNAs de interferencia ?
Enfermedad de Crohn
¿Como se usa la
Biotecnología en medicina?
•Producción de proteínas en procariontes y
eucariontes (Transgenia).
•Terapia génica.
•Fabricación de animales knockout para
estudiar las funciones de proteínas
•Fabricación de vacunas.
Sistemas para producción de proteínas. Transgenia
(Organismos transgénicos: organismos que contienen DNAs extraños)
Procariontes:
• Bacterias
Eucariontes:
• Levaduras
• Células de insecto
• Hongos
• Células de mamífero en cultivo
• Animales
Usos: - reemplazar productos génicos faltantes.
- inmunógenos para ser usados como vacunas.
Requisitos que deben cumplir los sistemas
biológicos elegidos para producir proteínas
1) Expresar la mayoría de los miembros del universo de
proteínas, particularmente proteínas eucariontes.
2) Expresar proteínas en una forma biológicamente activa.
3) Producir proteínas de manera rápida y económica.
4) Producir proteínas en grandes cantidades, de modo que
puedan ser comercializadas.
5) Las proteínas producidas no pueden significar riesgo para la
salud (libres inmunógenos o contaminaciones con patógenos)
Producción de proteínas con
fines terapéuticos en :
•Bacterias
•Animales
Bacterias....
¿Como insertar DNAs sin intrones a las bacterias?
Aislando cDNA
•Origen de replicación
•Marcador de selección
•Promotor fuerte (regulado)
•Sitio de clonamiento
Biochemistry.
Berg, J M.; Tymoczko, J L.; and Stryer, L.
New York: W. H. Freeman and Co.; 2002.
Bacterias....
Regulación de la Transcripción
Control negativo
Operon lac
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.; Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Bacterias....
Expresión de
proteínas en E. coli
G-CSF
Factor VIII (T7)
Bacterias....
Expresión de la hormona de crecimiento humana secretada (hGH)
en E. Coli…
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.; Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Bacterias....
Ventajas de las bacterias sobre otros sistemas: Primera
opción.
• Funciona bien para producir muchas proteínas.
• Promotores inducibles. Alta capacidad de expresión.
• Es un sistema más económico, el procedimiento es simple y rápido.
• Expresión en citoplasma o periplasma.
Desventajas de las bacterias con respecto a otros sistemas:
•Proteínas pueden no ser procesadas correctamente (glicosilación,
formación de puentes disulfuros, acetilación, miristoilación) y forman
cuerpos de inclusión,.
•Presencia de contaminantes pirogénicos (causan fiebre) provenientes
de las membranas bacterianas en el producto final.
•Sintetizan correctamente proteínas hasta 1.000 aminoácidos.
Comparación de los sistemas de expresión
Sistema de
expresión
Ventajas
Desventajas
Bacterias
Fácil, rápido, bajo costo. Puede producir
grandes cantidades de proteínas en corto
tiempo.
No hay modificaciones
postraduccionales como glicosilación
y fosforilación. No procesa intrones
Levaduras
Grandes cantidades de proteínas Algunas
modificaciones postraduccionales ocurren
más rápido que en mamíferos
Manipulación puede ser complicada.
Procesamiento limitado de intrones.
Hiperglicosilación.
Hongos
Grandes cantidades de proteínas
Procesa intrones y glicosila
Experimental
Baculovirus
Grandes cantidades de proteínas,
modificaciones postraduccionales
Si procesa intrones.
Difícil de manipular vectores de gran
tamaño.
Células de
mamíferos
Modificaciones postraduccionales y
procesamiento de intrones. Si procesa
intrones
Lento, mas complejo y costoso.
Elección de las células en las cuales se va a producir una proteína depende
de las propiedades de la proteína: prueba-error.
Procedimientos de transgenia en animales.
Aplicaciones comerciales de los animales transgénicos:
1. Producción de nuevos productos en la leche
-Farmacéuticos
-Proteínas sanguíneas
-Antígenos para la producción de vacunas
-Nuevos productos alimenticios
2. Animales productores de alimentos mejorados en materia
productiva. Leche, carne, huevos etc.
Animales...
Vectores
plasmidiales o virales
Producción de proteínas
importantes farmaceuticamente.
Animales transgénicos
La primera generación puede
presentar anormalidades epigenéticas
Activador de Plasminógeno y factor
VIII, ambos en oveja
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.;
Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Salmón del Pacífico que sobreexpresa el gen de GH
(proveniente de Salmón). Promotor de metalotioneina
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.;
Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Generación de animales transgénicos.
Vectores plasmidiales.
•Inserción al azar
•A menudo se encuentran
en regiones con
reordenamiento de DNA
•A menudo se insertan en
repeticiones en tandem o
en múltiples sitios.
Generación de animales transgénicos.
Vectores retrovirales.
Inserción al azar
El DNA alrededor de
la inserción no se
altera
Normalmente se
inserta una copia
única
Requisitos de animales transgénicos en la producción farmacéutica:
1. Producción de altos niveles de la droga (proteína) deseada sin poner en riesgo
su propia salud.
2. El animal debe ser capaz de transferir esa capacidad a su descendencia.
La idea es combinar las instrucciones de síntesis de la droga (proteína) con la
capacidad de dirigir a la proteína sintetizada hacia la glándula mamaria.
Beneficios de enfocar la producción de proteínas a la glándula
mamaria:
•Alto potencial de producción. Ej. 100.000 conejos se necesitarían para producir
150 kg de fibrinógeno, mientras que solo 17 vacas son potencialmente capaces de
satisfacer las necesidades mundiales.
•Uso de promotores de genes que codifican para proteínas de la leche
(promotores de β-caseína y β-lactoglobulina). No existe el riesgo de expresar estas
proteínas extrañas en otros tejidos.
Terapia génica
Introducción de material genético en las células con fines
terapéuticos. Permite tratar enfermedades adquiridas (SIDA)
o heredadas (Hemofilia, CF, Errores en metabolismo)
Terapia Génica Clásica:
Producir un producto que el paciente no tiene
Matar células enfermas directamente usando un gen que codifique
para una toxina.
Activar células del sistema inmune para eliminar células enfermas
Terapia Génica NO Clásica:
Inhibir la expresión de genes asociados con la patogénesis
Tipos de terapia génica en mamíferos.
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.;
Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Terapia génica en ratón.
Introducción del gen de hormona de crecimiento de rata.
lit/lit no producen mGH
1%
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.;
Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Terapia génica en ratón
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.
Griffiths, A J.F.; Miller, J H.; Suzuki, DT.;
Lewontin, R C.; Gelbart, W M.
New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.
Terapia génica:
•La terapia génica es una aplicación especial de la tecnología de transgenia.
•Introducción de material genético en las células con fines terapéuticos. El
procedimiento involucra ya sea reemplazo, manipulación o suplementación
de genes no funcionales con genes “saludables”.
Célula blanco
vector
Proteína
gen
•DNA es una molécula cargada negativamente por lo tanto, requiere del uso
de vectores que transporten los genes a través de la membrana plasmática.
Formas de aplicar terapia génica
Terapia génica somática
Ex Vivo
In Situ
In vivo
Tej. enfermo
Sangre
Terapia ex vivo
requisitos que deben cumplir
utilizados en terapia genica:
los
vectores
• Eficiencia de entrada a las células: los vectores virales y no
virales.
• Eficiencia de expresión en el tejido apropiado.
• Duración de expresión.
• Seguridad. Integración en un lugar correcto, toxicidad e
inmunogenicidad.
No existen vectores ideales utilizados universalmente
Métodos utilizados para transferir DNA
en terapia Génica
Vectores virales:
•Virus RNA
• Virus DNA
Fabricación de liposomas
DNA desnudo estabilizado
Métodos no virales de transferencia de genes
Liposomas catiónicos:
Lípidos cargados
positivamente, interactúan con
DNA cargado negativo.
DNA en
H2O
Fosfatidil Colina
Atraviesan membranas
Ventajas:
•Complejos estables
•Transportan DNA de gran tamaño
•Pueden ser dirigidos a células especificas
•No producen reacciones inmunológicas
Desventajas:
•Baja eficiencia de transfección
•Expresión transiente
•Algo de toxicidad.
Fosfatidil Colina
Plásmido-liposomas
Pulmon 15 días
Vectores utilizados en terapia Genica
Vector
Capacidad de
empacamiento
Rango de huésped
Clinical
trials
Features
Baja <4 kb
Amplia, células con o sin
división
+
Slow expression onset, genome integration (±),
long-term expression, inefficient large-scale virus
production
Adenovirus
Media <7.5 kb
Amplia. Baja transducción
en neuronas
+
Expresión transitoria, No se integra en el
genoma huésped, muy inmunogénico
Alphaviruses
Media <7.5 kb
Amplia, cepas célula
especifica de neurona y
glia
+
Transient, but extreme, expression levels; low
immunogenicity
Herpes simplex
virus
Alta >30 kb
Amplia, neuronas, stem
cells, músculo
-
Latent infection, long-term expression, low toxicity
(mutants)
Lentivirus
Media 8 kb
Amplia, células con o sin
división
-
Genome integration, long-term expression, safety
concerns low titers, production inefficient
Retrovirus
Media 8 kb
Restringidas a células en
división
+
Integración en el genóma, expresión a largo
plazo. Puede gatillar respuesta inmune
AAV
Vectores retrovirales
Transducción: transferencia
de genes
•Mas usados en terapia génica, específicamente se usa el Moloney murine
leukaemia virus (MoMuLV) (Usado en el tratamiento de ADA-SCID, XSCID).
•Su genoma esta constituido por ssRNA
Ciclo de vida de
los retrovirus
•Genoma viral ssRNA, convertido a cDNA por RT viral.
• Las secuencias” Long terminal repeat” (LTR) facilitan la integración del cDNA formando un
intermediario viral circular inestable. Se integra en puntos al azar del genoma huésped.
Ciclo de vida de los retrovirus
•Retrovirus: potencial de expresión permanente en células somáticas.
•Requieren de células en replicación para la infección.
Genoma viral
5`-LTR
Ψ
Gag
Pol
E nv
3`-LTR
LTR
: Integración directa en genoma
Ψ
: región que dirige el empacamiento y que resulta en la
formación del virus
Gag
: proteínas necesarias para la encapsidación viral
Pol
: codifica para transcriptasa reversa
Env
: codifica para un receptor que se une a la célula blanco.
Empacamiento: Eliminacion de genes gag, pol y env.
Introduccion del gen X.
Ψ
5`-LTR
5`-LTR
Ψ
3`-LTR
Gen X
3`-LTR
LTR
: Integración directa en genoma
Ψ
: región que dirige el empacamiento y que resulta en la
formación del virus
Gag
: proteínas necesarias para la encapsidación viral
Pol
: codifica para transcriptasa reversa
Env
: codifica para un receptor que se une a la célula blanco.
Un plasmidio viral recombinante se transfecta en células
empacadoras (Aportan la infraestructura necesaria para la
replicación y empacamiento del genoma viral).
gag
Pol
5`-LTR
Ψ
env
Gen X
3`-LTR
La célula empacadora
contiene los genes gag,
pol y env.
Retrovirus Tumor - selectivo
Glicoproteína
Heregulina: ligando para
EGF-R
Enzima / prodroga
Cancer Medicine. 5th ed.
Bast, R C.; Kufe, DW.; Pollock, R E.; Weichselbaum, R R.;
Holland, J F.; Frei, E, editors.
Hamilton (Canada): BC Decker, Inc; c2000.
Vectores Adenovirales
Adenovirus :
In situ
• virus icosahédricos
• no llevan envoltura
• DNA doble hebra lineal de 36kb.
• Infectan células que no se
encuentran en división.
• Producción de vectores
adenovirales es similar a la de los
vectores retrovirales. Los genes
tempranos E1a y E1b son
esenciales para la replicación del
virus, esos genes son
delecionados y su función es
complementada por una línea
celular (helper) que si lleva esos
genes.
Vectores Adenovirales…cont
•Unión a receptores de superficie celular y endocitosis.
•DNA de dobre hebra, dsDNA es desnudado. Genes virales comienzan a
expresarse.
•El genoma viral NO se integra en el genoma huésped. Expresión transitoria.
•Terapia adenoviral requiere aplicación permanente (CF, por ejemplo).
Adenovirus Tumor - selectivo
Estructura globular
Anticuerpo neutralizante quimérico:
•Anti-Estructura globular
•Fusionado a un segmento que codifica
para un ligando específico
Enzima / prodroga
Cancer Medicine. 5th ed.
Bast, R C.; Kufe, DW.; Pollock, R E.; Weichselbaum, R R.;
Holland, J F.; Frei, E, editors.
Hamilton (Canada): BC Decker, Inc; c2000.
Combinaciones enzima/pro-droga
Converting enzyme
Pro-drug
Action of drug
HSV-thymidine kinase
Ganciclovir, acyclovir,
bromovinyl-deoxyuridine
Anti-metabolite
E. coli cytosine deaminase
5-FC
Anti-metabolite
Human cytochrome P-450
2B1
Cyclophosphamide, ifosfamide
Alklyator
E. coli XGPRT
6-thioxanthine
Anti-metabolite
E. coli DeoD
6-methylpurine-2'deoxyribonucleoside
Anti-metabolite
E. coli nitroreductase
CB1954 (5-aziridin-1-yl)- 2,4dintrobenzamide
Alklyator
Terapia Genica Dirigida a controlar el
ciclo celular y la apoptosis
p53.
Detención del ciclo celular, reparación de DNA, inducción
de apotosis.
E2F-1. Apoptosis
p21.
Detención del ciclo celular
Regulación negativa de genes involucrados en el desarrollo de
los tumores. Oligonucleótidos antisentido, ribozimas.
Casos de terapia génica
Jesse Gelsinger *primer paciente en morir a consecuencia de terapia
génica.
(puede haber otros).
Deficiencia de ornitina transcarbamilasa hepática: metabolismo de amonio
Vector vector usado para transferir el gen de la enzima –adenovirus
modificado
Debido a la baja eficiencia de transferencia (1%) para obtener un
funcionamiento suficiente de la enzima se infectó con una dosis viral
mayor.
Resultados:
-El vector llevó el virus al hígado y también a otros tejidos
-Se gatilló una respuesta inflamatoria sistémica. Fiebre, coma y
muerte.
Casos de terapia génica
Tratamiento de Inmuno deficiencia combinada severa (SCID)
•Defectos genéticos causan una disminución de células T, B y NK.
•Afecta a 1 en 75.000 nacidos vivos.
•Forma ligada al cromosoma X: XSCID (deficiencia de cadena gamma,
receptores de interleukinas ).
•Autosómica recesiva: Deficiencia de ADA (adenina desaminasa).
•Se ha tratado exitosamente niños en Italia, Israel, Inglaterra, Francia y
USA (Un paciente XSCID desarrollo una condición “tipo leucemia”).
Terapia ex vivo: Colección de medula ósea de pacientes, aislamiento de
células troncales, infección de ellas con el vector retroviral que contiene
que codifica para la cadena gamma.
Terapia antisentido. Silenciar expresión no deseada
Requisitos. Ser capaz de ingresar a la célula blanco
•Evitar la degradación del DNA
•No producir efectos colaterales negativos
Para lograr lo anterior, los oligonucleótidos antisentido son:
•Modificados químicamente para resistir la digestion por DNAsa.
•Unido a algo que le permita llegar a la célula de interés.
Un ligando que sea reconocido por receptores en la célula blanco
Anticuerpos dirigidos contra moléculas de la superficie de la célula deseada.
Terapia antisentido. Silenciar expresión no deseada
Enfermedad de Crohn
Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1):
•tráfico y activación de leucocitos
•inducida en mucosa inflamada en pacientes
con enfermedad de Crohn.
•ISIS 2302 oligodeoxynucleótido antisentido
fosforotioatos
La FDA aprobó fomivirsen (Vitravene®) para ser usado contra
infecciones oculares con CMV. Fomivirsen es un oligonucleótido
antisentido que degrada el mRNA de 2 proteínas virales esenciales.
Varios laboratorios están desarrollando oligonucléotidos
antisentido como armas contra:
•HIV-1
•Citomegalovirus (CMV); el cual causa serias complicaciones
en paciente con SIDA.
•Asma; la inhalación de oligonucléotidos antisentido reduce
(en conejos) la síntesis de receptores involucrados en asma.
•Ciertos tipos de cáncer.
•Ciertos tipos de inflamación.
Oligonucleótidos antisentido aprobados o en proceso de aprobación
Terapia por reemplazo celular
1998 Gearhart y Thomson anunciaron la obtención de células
troncales pluripotentes Humanas. (Embryonic stem cells, ES cells).
•Masa intracelular de embriones no implantados
•Células germinales de fetos obtenidos de abortos espontáneos
Eran capaces de diferenciarse para formar células troncales más
restringidas, que cuando se inyectaban en ratones inmunodeficientes
eran capaces de formar glóbulos rojos y neuronas.
Usar como terapia para producir neuronas en pacientes con
desordenes neurodejenerativos o con daño en la médula espinal.
Usar para producir globulos rojos en personas con anemia.
Producción de neuronas
y glóbulos rojos:
Ratón funciona OK
¿Reachazo?
Clonar un embrión desde una
célula somática del mismo
paciente y así generar sus
propias ES cells.
Developmental Biology, 6th Edition
Juntando terapia génica con Terapia por reemplazo celular.
• Capacidad de modificar nuestro cuerpo.
• *Capacidad de insertar genes nuevos en huevos fertilizados para
producir ES cells embionarias
• Genes deletéreos podrían ser corregidos en células germinales y así
eliminardos de las siguientes generaciones.