Soluciones

Soluciones
Objetivos
Que el alumno:
1. Identifique la existencia de soluciones en
los sistemas biológicos.
2. Explique los cálculos y procedimientos
para preparar soluciones porcentuales,
molares y normales, así como las diferentes
diluciones de éstas.
3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas
en medicina (solución isotónica, Ringer,
Darrow y Hartman).
Responda a las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es una solución?
2. ¿Cuántas clases de soluciones existen?
3. ¿Qué significan los siguientes términos:
mol, solución molar y solución normal?
4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
5. ¿Cuál es la composición de las siguientes
soluciones: solución isotónica de cloruro de
sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato?
6. ¿Cuáles son los tipos de soluciones que
existen in vivo? Mencionar ejemplos.
7. ¿Qué es una solución isotónica?
8. ¿Qué es una solución osmolar?
9. ¿Cómo se calcula la osmolaridad de una
solución?
10. ¿Qué les pasa a los eritrocitos cuando se
ponen en contacto con soluciones salinas de
diferente osmolaridad?
11. ¿Qué se entiende por dilución y dilución
seriada de las soluciones?
Material
Por equipo:
• 3 vasos de precipitado de 10 ml
• 3 pipetas de 1.0 ml
• 3 pipetas de 5.0 ml
• 3 pipetas de 10.0 ml
• Gradilla con 6 tubos de ensayo
•Eritrocitos humanos lavados en solución.
• Salina isotónica
• Solución de azul de metileno al 1.0%
• Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
• Balanza granataria
Por grupo:
• 1 Microscopio marca Leica.
Procedimiento
1. Hacer los cálculos para preparar una
solución de KCl al 3%.
2. Hacer los cálculos para prepara una
solución de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml.
3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere
para preparar una solución 3N 40 ml volumen
final.
4. Hacer los cálculos correspondientes para
comprobar que la solución a 0.9% de NaCl
es isotónica con respecto al plasma (ver pag.
92). Considerar que:
a) El cloruro de sodio se disocia en solución
acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo
que la concentración iónica se duplica (1
mmol/l = 2 mosm/l).
b) La presión osmótica normal del plasma es
de 290-310 mosm/l.
5. Preparar 20 ml de una solución de NaCl a
4.5% (etiquetar como solución 1).
6. A partir de la solución anterior, preparar 25
ml a 0.9% (solución 2) y 50 ml a 0.045%
(solución 3).
7. Colocar en tres tubos de ensayo las
diferentes soluciones de cloruro de sodio
preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda
de un gotero (dejando caer lentamente por
las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos
lavados.
Mezclar con cuidado y dejar
reposar a temperatura ambiente unos
minutos. Valorar el grado de hemólisis que
sufren los eritrocitos cuando se ponen en
contacto con las diferentes soluciones.
8. Hacer los cálculos necesarios para
preparar otras soluciones, por ejemplo: 500
ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96
%).Expresar en meq/l una concentración de
calcio de 11 mg/dl. Una solución contiene 14
g de glucosa en 25 ml. ¿Cuál es la
concentración molar de la solución?
A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl
y 126 g de glucosa (C6O6H12).
¿Cuánta agua habrá que añadirles para que
resulte un suero 0.4 osmolar?
9. Calcular la osmolaridad a partir de la
composición de algunas soluciones como
Dextrosa a 10 % en solución salina a 0.45%.
Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2 %.
Hartman, Ringer y Darrow.
10. Hacer la dilución y redilución (dilución
seriada) de la solución de azul de metileno
como se muestra en el siguiente cuadro:
DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE
METILENO
Tubo
H2O
Sol de azul
Volumen de
(ml)
de metileno
transferencia
1
2
0.5 ml*
2
2
0.5 ml
3
2
0.5 ml
4
2
0.5 ml
5
2
0.5 ml
6
2
0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se
debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en
cada tubo varias veces antes de transferir la
dilución al siguiente tubo.
Resultados
1. Expresar en forma ordenada los cálculos
efectuados para cada uno de los ejercicios.
2. Deducir el movimiento o no del solvente
cuando se ponen en contacto eritrocitos con
soluciones hipo, hiper e isoosmóticas.
3. Calcular la dilución y la concentración de
azul de metileno en cada uno de los seis
tubos de la dilución seriada (ver pág. 93).
Asegúrese que la coloración obtenida
disminuya gradualmente conforme avanza la
dilución.
REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH
Editores; 2000.
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA,
Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima
reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial
Limusa; 2004.
3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna.
5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de química
general, orgánica y bioquímica para ciencias
de la salud. México: Editorial Limusa Wiley;
2001.
5. Farias GM. Química clínica. Décima
edición México: Editorial El Manual Moderno;
1999.
6. Bloomfield MM.Química de los organismos
vivos. México: Editorial Limusa; 1997.
INSTRUCCIONES PARA EL USO
DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA
1. Nunca use un adaptador entre el cable y
la fuente de alimentación.
2. Use siempre el microscopio sobre una
superficie dura y estable.
3. Conecte el cable de alimentación del
microscopio a una toma de corriente con
conexión a tierra. Se suministra un cable de
tres terminales con toma a tierra.
4. Encienda el microscopio girando el
interruptor de control de la iluminación
situado en la parte inferior izquierda del
instrumento.
5. Coloque el interruptor de control de la
iluminación en el nivel más bajo. El control
de iluminación le permite ajustar la intensidad
de luz.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el anillo
hacia el extremo derecho.
7. Usando el botón
de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta el
extremo superior de su desplazamiento.
Iluminación critica
únicamente: si el
desplazamiento
del
condensador
es
excesivo, limítelo con el tornillo situado
debajo de la platina hasta que la lente
superior del condensador
se encuentre
debajo de la superficie de la platina.
8. Coloque la preparación de la muestra con
la muestra en la platina.
muestra con precisión utilizando el mando de
enfoque micrométrico.
11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de
los ojos.
12. Al término del uso del microscopio retirar
la muestra de la platina.
13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla
a su posición original si es necesario.
14. Colocar el revolver de los objetivos de
manera que el objetivo de 4X sea el que
quede en dirección de la lámpara.
15. Desconectar
cable.
el equipo y
enrollar el
16. Limpiar la platina y oculares con un paño
humedecido con metanol o con un limpia
cristal comercial.
17. Colocar al microscopio la funda contra el
polvo
para
mantenerlo
en
buenas
condiciones físicas y mecánicas.
Partes del microscopio:
1) -Oculares.
2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y
100X.
3) -Platina.
4).-Diafragma.
5) -Lámpara.
6).-Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
7).-Interruptor de control de la iluminación.
8).-Tornillo macrométrico.
9).-Tornillo micrométrico.
9. Gire el revólver hasta situar el objetivo 4X
en la posición de trabajo. (pag X)
1
10. Suba la platina girando el mando de
enfoque macrométrico hasta que observe la
preparación y, finalmente, enfoque la
2
6
9
8
7
3
4
Práctica 2
5
Práctica 2
Regulación del equilibrio ácido-base
después del ejercicio muscular intenso y
de la ingestión de bicarbonato de sodio
Objetivos
1. Al finalizar la práctica, el alumno
constatará las actividades reguladoras del
pulmón y el riñón para mantener el equilibrio
ácido-base en condiciones que tienden a
romperlo.
2. Mediante la determinación del pH
observará la variación de la concentración de
hidrogeniones en la orina de un individuo que
ha realizado ejercicio muscular intenso.
3. Relacionará los resultados obtenidos con
los cambios metabólicos originados por el
ejercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué es importante que se mantenga
constante, dentro de ciertos límites, el pH en
el organismo?
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H + en el
organismo?
3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que
facilitan la eliminación del H+ producido en el
organismo con el fin de mantener constante
el pH sanguíneo?
4. ¿Cuáles son las reacciones de formación
del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y
H2O, y de su disociación para formar el ion
bicarbonato? Escríbalas.
5. ¿Qué sistemas amortiguadores participan
directamente en la regulación del pH
sanguíneo?
6. ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos
que tienden a mantener el pH extracelular?
Escriba la ecuación de Henderson
Hasselbalch aplicada al sistema
y
HCO3–/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
siguiente pregunta:
1. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y
el riñón en el control del pH sanguíneo?
Material
• Diez probetas o vasos de precipitado.
• Orina.
• Potenciómetro.
• Piceta.
Método
Un alumno por equipo desayunará o comerá
normalmente (evitar ingestión de jugos
ácidos); después hará lo que se indica a
continuación:
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase práctica.
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100
ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como
subir y bajar varias veces las escaleras de
tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido
por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, como en el inciso 3, hasta completar
por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinará el pH
inmediatamente después de haber sido
obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a
aumentar debido a la pérdida de dióxido de
carbono y a que el crecimiento bacteriano
produce amoniaco a partir de la urea.
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para cada
una de las 5 muestras de orina, trazar una
gráfica de pH contra tiempo; interpretar los
resultados y discutirlos en grupo.
Segunda parte
Objetivos
1. El alumno constatará el papel del riñón en
el mantenimiento del equilibrio ácido-base en
una situación de alcalosis metabólica
provocada por la ingestión de bicarbonato de
sodio.
2. Mediante la medición del pH, observar la
variación
de
la
concentración
de
hidrogeniones en la orina de un individuo que
ha ingerido una carga de bicarbonato de
sodio.
Hipótesis
Elabore la hipótesis apropiada.
Material
• Orina.
• Solución de bicarbonato de sodio a 3%.
• Potenciómetro.
Método
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase práctica.
3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el
volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, hasta completar por lo menos 5
muestras.
6. A cada muestra se le determinará el pH
inmediatamente después de haber sido
obtenida.
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para cada
una de las cinco muestras de orina, trazar
una gráfica de pH contra tiempo; interpretar
los resultados y discutirlos en grupo.
REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Montgomery R. Bioquímica: casos y texto.
6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4.
3. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón
Práctica 3
Titulación de un aminoácido con una
base y la aplicación de la ecuación de
Henderson y Hasselbalch.
Determinación del pK1 y del pK2
Objetivos
Que el alumno:
1. Experimente y entienda cómo se comporta
un sistema amortiguador de pH.
2. Aprenda el uso de la ecuación de
Henderson-Hasselbalch.
3. Aprenda a calcular el pK de un par ácidobase.
4. Mida el pH de diferentes sustancias y
calcule su concentración de H+.
5. Aplique estos conocimientos al estudio de
las propiedades de los aminoácidos.
Para lograr lo anterior conteste las
siguientes preguntas y planteamientos:
1. ¿Qué es el pH de una solución?
2. ¿Qué es un sistema amortiguador ácidobase y para qué sirve?
3. ¿Cuáles son los sistemas amortiguadores
más importantes en biología?
4. Escribir la ecuación de HendersonHasselbalch.
5. ¿Qué es el pK de un par ácido base?
6. ¿Por qué es importante la concentración
de H+ en los seres vivos?
7. Dibujar la fórmula de la glicina, de la lisina,
de la histidina y del ácido aspártico
e identificar a los grupos -amino y carboxilo de estos aminoácidos, así como su
radical, e indicar la naturaleza del mismo.
8. ¿Qué les pasa a estos grupos funcionales
cuando se someten a pH ácido o básico?
9. ¿Se pueden usar los aminoácidos como
amortiguadores de pH?
10.
¿Son
los
aminoácidos
buenos
amortiguadores a pH de 7.0?
11. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de los
aminoácidos que tienen un grupo amino y un
grupo carboxilo?
12. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos carboxilo
a pH de 7.0?
13. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos amino a
pH de 7.0?
Material
• Cuatro vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipeta de 1 ml (para el NaOH).
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo.
• Glicina 0.025 mol/l pH 2.
• Lisina 0.025 mol/l pH 2.
• Ácido aspártico 0.025 mol/l pH 2.
• Histidina 0.025 mol/l pH 2.
• NaOH 1.0 mol/l.
Método
1. Poner 20 ml de la solución de glicina en un
vaso de precipitado de 100 ml.
2. Proceder a la medición del pH.
3. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el
vaso y volver a medir el pH; anotar los
resultados.
4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH
aproximado de 12.
5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los
otros tres aminoácidos.
Análisis de resultados
1. Hacer una gráfica de pH vs volumen en
ml de NaOH gastados luego de tomar en
cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en
20 ml aumenta la concentración de OH en 5
mM.
2. Localizar en la gráfica el pI y los
diferentes pK de los aminoácidos.
3. Mediante la ecuación de HendersonHasselbalch cuantificar la relación entre cada
par de especies ionizables de los
aminoácidos a diferentes pH.
4. Identificar a qué pH tienen poder
amortiguador.
Medición del pH y cálculo de la concentración
de H+ en diferentes líquidos
Método
1. Pedir a los alumnos desde la clase
anterior que traigan diferentes muestras,
tales como leche, café, refresco, orina, saliva,
jugo de frutas, etcétera.
2. Colocar los líquidos en un vaso de
precipitado y medir el pH en el
potenciómetro.
Análisis de resultados
Calcular la concentración molar de H + en
cada uno de las muestras estudiadas.
REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005
Práctica 4
Estudio de las proteínas corporales
Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales sobre
las proteínas al estudio de las proteínas
corporales.
2. Conocer las alteraciones más frecuentes de
las
proteínas
plasmáticas
y
sus
consecuencias.
3. Conocer los métodos generales para el
estudio de las proteínas plasmáticas.
4. Determinar la concentración sérica de
proteína total y de albúmina e interpretar los
resultados obtenidos.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son polímeros lineales
constituidos por los aminoácidos, que se unen
entre sí por medio de enlaces tipo amida
denominados enlaces peptídicos.
Los
polímeros
compuestos
por
dos
aminoácidos forman un dipéptido, por tres, un
tripéptido; cuando el número de aminoácidos
es mayor, oligopéptidos y polipéptidos o
simplemente se denominan péptidos. Las
proteínas son moléculas constituidas por una o
más cadenas polipéptidicas.
Las proteínas pueden ser clasificadas en
función de aspectos tan diversos como su
composición, su disposición espacial, su
función biológica y su localización.
Atendiendo a su localización dentro del
organismo humano, las proteínas pueden
clasificarse en:
• Hísticas o tisulares, son las proteínas de los
tejidos.
• Plasmáticas o hemáticas, son las proteínas
de la sangre.
Aunque las proteínas tisulares son de gran
importancia en el organismo, las localizadas en
la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y
las proteínas plasmáticas), por su gran
accesibilidad, proporcionan con facilidad
información importante y, por lo tanto, son las
más utilizadas en el laboratorio clínico.
Proteínas plasmáticas
La sangre está constituida por formas celulares
en suspensión (eritrocitos, leucocitos y
plaquetas) en un medio líquido llamado
plasma. El plasma se obtiene cuando,
inmediatamente después de extraer la sangre,
se le agregan anticoagulantes como oxalato,
citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se
recoge sangre sin anticoagulante y se deja que
ésta coagule, el líquido que se separa se llama
suero. El suero carece de células y de factores
de la coagulación incluyendo la proteína
fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en
fibrina insoluble en el proceso de la
coagulación. El fibrinógeno constituye sólo de
3 a 6% del total de las proteínas en plasma.
El agua constituye 92 a 93% del plasma o
suero y en ella encontramos electrolitos,
metabolitos, nutrientes, hormonas y proteínas
en una proporción de 7 a 8%; de estos solutos
presentes, las proteínas son las que están en
máxima proporción, aproximadamente 6 a 8
g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl
mayor en plasma por la presencia de
fibrinógeno.
Las proteínas plasmáticas son un grupo de
más de 100 moléculas distintas con
características y funciones muy diversas,
aunque para fines prácticos el término
"proteína plasmática" se usa para todas
aquellas proteínas cuya concentración en el
plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan
con alguna función específica dentro de él.
Aproximadamente son 20 las proteínas que
cumplen con ambas definiciones. Todas estas
proteínas, a excepción del fibrinógeno, se
encuentran tanto en plasma como en suero.
La mayoría de las proteínas plasmáticas son
sintetizadas por el hígado. Las proteínas del
plasma, al igual que otras proteínas del
organismo, son destruídas y reemplazadas
constantemente, con una vida media de
aproximadamente 10 días.
Las funciones de las proteínas plasmáticas
pueden agruparse en tres grandes grupos: de
transporte como la transferrina, lipoproteínas y
la albúmina; de defensa del organismo en el
ataque a agentes extraños o para limitar la
respuesta
inflamatoria,
como
las
inmunoglobulinas,
la
a1-antitripsina,
la
haptoglobina y el complemento. Por último,
para mantener la presión oncótica de la
sangre, necesaria para prevenir pérdidas de
líquido del espacio vascular al intersticial: la
albúmina es el ejemplo más importante de este
grupo.
Métodos para el estudio de las proteínas
plasmáticas
El laboratorio clínico cuantifica en una muestra
de suero las concentraciones de proteína total
y de albúmina. A partir de estos datos, se
calcula la fracción globulina como la diferencia
entre los dos resultados anteriores y la relación
albúmina/globulina se calcula a partir de
estos últimos. La concentración de otras
proteínas se determina por grupos (por
ejemplo,
las
gamma-globulinas)
o
individualmente por métodos inmunoquímicos
(por ejemplo algunas hormonas o marcadores
tumorales).
Las enzimas se estudian evaluando su
actividad catalítica o su concentración de masa
mediante métodos inmunoquímicos. También
es posible el estudio fraccionado de las
proteínas, para lo que se recurre a otros
procedimientos más precisos de gran ayuda
clínica,
como
la
electroforesis,
la
inmunoelectroforesis y la inmunodifusión radial
de proteínas plasmáticas.
Proteína total
La suma de las concentraciones de todas y
cada una de las proteínas presentes en el
plasma se conoce como proteínas totales y la
cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl,
siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl.
Las proteínas totales están integradas por
albúmina (más de la mitad) y las globulinas;
estas últimas agrupan a todas las proteínas
que no son albúmina.
La concentración de las proteínas plasmáticas
en un momento determinado es el resultado de
tres procesos: la velocidad de síntesis, el
volumen del líquido en que se distribuyen y la
velocidad de degradación. En diversos estados
patológicos,
estos
procesos
pueden
superponerse. En la práctica, la determinación
de la concentración de la proteína total es un
parámetro que sólo refleja los cambios de las
proteínas más abundantes, como la albúmina y
las inmunoglobulinas.
La determinación de proteína total es útil en el
diagnóstico de enfermedades del hígado, de
los riñones y de la médula ósea.
En clínica se puede observar hiper o
hipoproteinemias, pero tanto en unas como en
otras, frecuentemente existe disminución de la
generalmente aumento de globulinas, en
alguna de sus fracciones.
La determinación de las proteínas totales suele
realizarse en el suero que carece de
fibrinógeno y de cualquier anticoagulante que
pueda diluir levemente las proteínas en el
plasma.
Albúmina
La albúmina es la principal proteína plasmática
y es sintetizada y secretada por el hígado a
razón de 12 g al día. Supone alrededor de 25%
de la producción proteica hepática total y la
mitad de toda su proteína secretada. La
albúmina es una proteína globular compuesta
por 585 aminoácidos en una sola cadena
polipeptídica con 50% de α-hélice y 15% de
estructura β, posee 17 puentes disulfuro y
tiene una vida media entre 14 y 20 días.
En el adulto normal se degradan diariamente
12 g de albúmina que pueden proveer de
aminoácidos para la síntesis de otras
proteínas. Además de esta función nutritiva, la
albúmina ayuda a conservar la distribución
normal de agua ya que produce cerca de 80%
del efecto osmótico de las proteínas
plasmáticas totales, debido a su alta
concentración y bajo peso molecular. La
albúmina interviene en el equilibrio ácidobásico y se encarga también del transporte de
varias sustancias como son los ácidos grasos,
la bilirrubina, varias hormonas e incluso
algunos fármacos (sulfonamidas, penicilina G,
aspirina, entre otras).
Alteraciones en la concentración de albúmina.
La más común es la disminución en su
concentración o hipoalbuminemia. En general,
la disminución de 1 g de albúmina sérica
equivale a una pérdida de 30 g de proteína
tisular.
Las
principales
causas
de
hipoalbuminemia son las enfermedades
renales, la desnutrición por baja ingestión de
proteínas y la síntesis deficiente como
consecuencia de la insuficiencia hepática,
sobre todo en casos de cirrosis. La
manifestación clínica más llamativa de la
hipoalbuminemia es el edema.
Las cifras normales de albúmina son de 4.5
g/dl y las cifras límite entre 3.5 y 5 g/dl. La
relación normal A/G es mayor de uno y es un
indicador importante en algunos estados
patológicos. Una relación A/G baja puede
obtenerse porque existe hiperglobulinemia,
hipoalbuminemia o ambas.
Separación electroforética de las proteínas
del suero
Las técnicas de electroforesis, enfoque
isoeléctrico y cromatografía de intercambio
iónico son algunas de las más importantes
para el estudio de las proteínas basadas en su
carga eléctrica.
En la electroforesis, si se colocan las proteínas
en un soporte (geles poliméricos, almidón o
papel)
inmersas
en
una
solución
amortiguadora a un pH determinado dentro de
un campo eléctrico, las proteínas se desplazan
hacia un polo cargado. En función de la
relación entre el pH del amortiguador y el pI de
la molécula, ésta se moverá hacia el cátodo,
hacia el ánodo, o permanecerá estacionaria
(pH=pI), por influencia del campo eléctrico
externo.
Cuando se realiza la electroforesis en papel o
acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH
significativamente superior al pI de las
principales proteínas plasmáticas cuyo peso
molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las
proteínas están cargadas negativamente y se
mueven hacia el polo eléctrico positivo. En
función de su velocidad de desplazamiento, las
proteínas del suero se separan en cinco
fracciones principales: albúmina, globulina α-1,
globulina α-2, globulina β, fibrinógeno θ (para
plasma solamente) y globulina γ (Fig. 5.1). La
electroforesis no separa los componentes
proteicos en sustancias químicamente puras:
algunas de estas fracciones representan
decenas a cientos de proteínas individuales y
diferentes que sólo tienen en común la misma
velocidad de desplazamiento electroforético.
Hay que tener en cuenta que la migración a
distinta velocidad en el campo eléctrico,
obedece a la forma y carga de la molécula y
menos a su tamaño o peso molecular.
Las membranas de acetato de celulosa tienen
la ventaja de ser químicamente homogéneas y
poder transparentarse, con lo que las
sustancias
que
se
separan
pueden
cuantificarse por densitometría, una vez
teñidas. Este aparato condujo históricamente a
la separación y clasificación operacional de las
proteínas del plasma humano (Fig. 5.1). El
área de cada pico determina la concentración
de la proteína que posee esa movilidad
particular.
La electroforesis separa las proteínas del
suero en patrones que pueden ser altamente
específicos para ciertas enfermedades como
sucede en el mieloma, el síndrome nefrótico,
la cirrosis o las quemaduras corporales
extensas (Fig. 5.1).
Proteínas específicas
Las proteínas plasmáticas de interés clínico
pueden determinarse por procedimientos
cuantitativos específicos que proporcionan una
información clinica más precisa que los
métodos anteriores. La cuantificación se
realiza
mediante
métodos
como
la
nefelometría,
la
turbidimetría
y
la
inmunodifusión
radial
y
métodos
de
inmunoanálisis con reactivos marcados, como
el
radioinmunoanálisis,
el
enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis
y el luminoinmunoanálisis.
Tabla
5.1
Algunas
proteínas
cuya
concentración
se
determina
en
el
suero
NOMBRE DE LA
PROTEÍNA
g/L
PROPIEDADES Y
FUNCIÓN
MOTIVO PARA LA
PRUEBA
Albúmina
35-50
Transporte de
múltiples
sustancias
Desnutrición
Hepatopatía
Neoplasias
Ig G
8-17
Inmunidad
humoral
Inmunodeficiencias
Mieloma
C3
0.50.9
Proteína del
complemento
Obstrucción biliar
Lupus eritematoso
Proteína C
reactiva
<0.005
Implicada en la
respuesta
inmune
Infecciones agudas
Proteína fijadora
de vitamina D
0.20.55
Une y
transporta
vitamina D3
Daño hepático
grave
Haptoglobina
0.53.2
Fija la
hemoglobina
Hemólisis
Síndrome nefrótico
Fibronectina
0.250.4
Promueve la
adhesión
celular, une
fibrina
Sepsis
Leucemia
Pancreatitis aguda
Transferrina
2.34.3
Transporte de
hierro
Hemocromatosis
malnutrición
Ceruloplasmina
0.20.55
Transporte de
cobre
Daño hepático
grave
Síndrome nefrótico
La tabla 5.1 describe algunas de las proteínas
cuya cuantificación es de utilidad clínica.
Alteraciones de las proteínas plasmáticas
Dada la gran diversidad de funciones
desempeñadas por las proteínas plasmáticas
en el organismo, son también muchas las
alteraciones o disfunciones que pueden
aparecer.
Las alteraciones pueden clasificarse en:
• Alteraciones en la cantidad de proteínas
totales.
• Alteraciones en las fracciones obtenidas tras
una electroforesis, disproteinemias.
• Presencia en el plasma de alguna Ig anormal
y/o
de
alguno
de
sus
fragmentos,
paraproteinemias.
• Circulación en plasma de Ig que precipitan al
descender la temperatura. Crioglobulinemia.
• Defectos aislados de alguna fracción.
Material
• Gradilla con 6 tubos de ensayo
• 2 Pipetas de 5 ml,
• Pipetas automáticas
• Puntas para pipetas automáticas
• Reactivo de Biuret para determinación de
proteína: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de
sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l
y sulfato de cobre 5 mmol/l.
• Espectrofotómetro a 540 nm.
• Solución reactiva para albúmina: verde de
bromocresol a pH 4.2
• Espectrofotómetro a 630 nm.
• Suero problema.
• Solución estándar de proteínas 7 g/dl.
• Solución estándar de albúmina 5 g/dl.
• Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol.
Precauciones. Evítese la hemólisis. La
concentración de las proteínas del plasma se
modifica por la postura, de forma que existe un
incremento de entre un 10% y un 20% tras 30
minutos de pasar de la posición acostada a la
ortostática. Además la aplicación de la ligadura
para extraer la sangre puede producir un
aumento significativo al cabo de unos minutos.
En ambos casos, la modificación se debe a un
aumento del paso de líquido desde el
compartimiento vascular hacia el intersticial.
Método
Para la determinación de proteína total se
utiliza el método de Biuret modificado, el cual
es de gran especificidad y precisión. Los
polipéptidos que contengan, por lo menos, dos
enlaces peptídicos reaccionan con las sales de
cobre en medio alcalino para formar un quelato
2+
coloreado (violeta) entre el ion Cu y los
átomos de oxígeno del carbonilo y de
nitrógeno de la amida del enlace peptídico. La
concentración
de
este
complejo
es
proporcional a la concentración de proteína
total en la muestra. La absorbencia se
determina a 540 nm con un blanco de
reactivos.
Preparar la siguiente serie de tubos:
No.
de
tubo
Estándar
Suero
problema
Reactivo
de Biuret
1. Blanco
2. Estándar
-
25 µl
-
3. Suero
problema
25 µl
1 ml
1 ml
1 ml
Mezclar e incubar 15 min a temperatura
ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm.
El color es estable durante 30 min.
Cálculo:
ASuero X [Estándar g/dl] = [Proteína Total g/dl]
A Estándar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El método es lineal hasta valores de 15 g/dl
(150 g/l).
Valores esperados:
Recién nacidos
5.2 - 9.1 g/dl
Niños (hasta 3 años) 5.4 - 8.7 g/dl
Adultos
6.0 - 8.0 g/dl
Para la determinación de albúmina se requiere
de la fijación específica del verde de
bromocresol a esta proteína a determinado pH
produciéndose un cambio de coloración, de
amarillo verdoso a verde azulado. El cambio
en la coloración es directamente proporcional a
la concentración de albúmina en la muestra. La
absorbencia se determina a 630 nm con un
blanco de reactivos.
Preparar la siguiente serie de tubos:
No. de
tubo
Estándar
Suero
problema
Reactivo
de
albúmina
1. Blanco
2. Estándar
-
10 µl
-
3. Suero
problema
10 µl
2 ml
2 ml
2 ml
Mezclar e incubar 10 min a temperatura
ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm.
El color es estable durante 60 min.
Cálculo:
ASuero X [Estándar g/dl] = [Alb’umina g/dl]
A Estándar
Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El método es lineal hasta valores de 6 g/dl (60
g/l).
Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2
con solución salina.
Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).
REFERENCIAS
1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147.
2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed.
México: Editorial El Manual Moderno; 2004.
3. González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana;
1999.
4. Laguna-Piña. Bioquímica. 4a. ed. México:
Salvat; 1990. Cap. 4.
5. Pacheco Leal D. Bioquímica médica.
México: Editorial Limusa; 2004.
Práctica 5
Cinética enzimática.
Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de reacción enzimática
Objetivos
El alumno:
1. Explicará el efecto de la concentración de
sustrato sobre la velocidad de una reacción
enzimática.
2. Calculará por métodos gráficos la velocidad
máxima y la constante de Michaelis de una
reacción enzimática.
3. Conocerá los diferentes tipos de inhibidores
que existen y estudiará su efecto sobre la Km y
V máx.
4. Conocerá
aspectos
básicos
de
fotocolorimetría (ver pág, 115).
Para lograr los objetivos de esta práctica
contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción
enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis
(Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V
máx) de una reacción?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de algunas
enzimas?
5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación
tiene valor diagnóstico?
Hipótesis
Si la velocidad de una reacción enzimática es
proporcional a la concentración del sustrato;
cuando la concentración del sustrato es muy
alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza
su velocidad máxima.
La enzima que sirve de modelo en esta práctica
es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la
glucosa, en presencia del oxígeno del aire y con
la participación de la glucosa oxidasa, se oxida
hasta ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno
que se forma en el curso del proceso se
descompone mediante la peroxidasa. El oxígeno
atómico que se desprende en esta última
reacción se combina con un cromógeno que se
colorea al oxidarse. La intensidad de la
coloración
del
cromógeno
oxidado
es
proporcional a la concentración de glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno
óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma dimérica
y contiene dos moles de FAD como grupo
prostético por mol de enzima. La glucosa
oxidasa es altamente específica, hecho que ha
permitido su empleo para el análisis cuantitativo
de glucosa. La reacción consiste de dos pasos:
1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD
δ–
gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
glucosa oxidasa-FAD + H2O2
La
δ4-gluconolactona
se
hidrata
espontáneamente dando ácido glucónico. La
reacción global se expresa:
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2
Acido glucónico + H2O2
La peroxidasa cataliza la transferencia de
oxígeno del peróxido a un aceptor que es
cromógeno
como
la
ortotoluidina,
la
ortodianisidina,
la
2,2-azino-bis
(3-
etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse.
La reacción se expresa:
E+S
ES
1. Cálculo de la concentración inicial de
sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que la
solución de glucosa contiene 40 µmolas ml–1.
2. La velocidad será igual a las unidades Klett
por .5 min-1 de incubación.
3. Con los datos obtenidos completar el cuadro
5.2 y hacer las dos gráficas en papel milimétrico.
4. Hacer una segunda gráfica con los valores
de 1/v vs 1/[S].
5. Calcular el valor de la velocidad máxima
(Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km) con
y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo
con las gráficas del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos están de
acuerdo con la hipótesis planteada.
E+P
Material y reactivos
• 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una.
• 1 Pipeta de 5 ml.
• 2 Pipetas de 5 ml.
• 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml.
• Fotocolorímetro con filtro azul.
• Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una
dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3 y 4.
• 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml–1
de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de peroxidasa,
ortodianisidina 0.21 mmol/l.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l como
inhibidor.
• Gotero con HCl.
Método I (con azida de sodio)
1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml
preincubar 20 minutos la solución de enzimas
con 0.3 ml del inhibidor.
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar la enzima.
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
temperatura ambiente y de inmediato detener la
reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado
Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar el HCl.
Método II (sin inhibidor)
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos
como lo indica la tabla 1.
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I
Leer ambas series de tubos en el
fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo 1.
Resultados (cuadro 5.2)
REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial
Reverté; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a.
ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003.
Tubo
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Solución
glucosa (ml)
de
H2O
(ml)
Soución de
enzimas
(ml)
0.0
1.0
3
dil 1:10
0.1
0.9
3
dil 1:10
0.25
0.75
3
dil 1:10
0.5
0.5
3
0.1
0.9
3
0.25
0.75
3
05.
0.5
3
1.0
0.0
3
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of
biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.
Cuadro 5.2 Resultados
Tubo
No
Concentración
de sustrato
molas de
glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)
Velocidad de
la reacción
unidades Klett
5 min-1
ORDENADAS
(y)
Velocidad de
la
reacción
con
INHIBIDOR
Unidades
Klett 5 min -1
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.3 Resultados (inverso)
Tubo
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentración
de sustrato
molas de
glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)
Velocidad de la
reacción
unidades Klett 5
min-1 1/V
ORDENADAS (Y)
Velocidad de
la reacción
con
INHIBIDOR
1/V
Unidades
Klett 5 min–1
(Y)