PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN

PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD
EN BACTERIOLOGIA
INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
BOLETIN INFORMATIVO Nro. 5 OCTUBRE - 2012
COMENTARIOS ENCUESTA 44
Cepa Nº1: Proteus mirabilis
Esta cepa correspondía a un aislamiento de P. mirabilis aislado de orina de un
paciente de sexo femenino con infección urinaria baja no complicada. P. mirabilis
es uno de los agentes más frecuentes de infecciones urinarias de la comunidad aunque
también se lo puede asociar a infecciones intrahospitalarias. Este microorganismo es,
dentro la familia Enterobacteriaceae, uno de los más sensibles a los antibióticos ßlactámicos, probablemente por la gran permeabilidad de su membrana externa y por una
expresión prácticamente indetectable de su ß-lactamasa cromosómica. Por ello, las cepas
salvajes de P. mirabilis presentan sensibilidad incluso a ampicilina. La resistencia a los
antibióticos ß-lactámicos es casi siempre debida a la adquisición de distintas enzimas
plasmídicas. Para esta cepa, el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) recibió la
respuesta de 377 laboratorios. El 97,4 % (n=367) de los laboratorios informaron
correctamente género y especie. Tabla 1.a
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Tabla 1.a. Cepa 1: Concordancia en la Identificación bioquímica.
Género
Género
Género
Género
y especie correctos
correcto
correcto y especie incorrecta
incorrecto
Concordancia
Nº
Porcentaje (%)
367
97,3
0
0
9
2,4
1
0,3
Nueve laboratorios (2,4%) contestaron “género correcto y especie incorrecta”, estos
informaron P. penneri (4), P. vulgaris (4) y P. mulieris (1). Sólo un laboratorio informó
género
incorrecto
(Staphylococcus
epidermidis)
probablemente
debido
a
una
contaminación accidental, por lo que este dato fue retirado del análisis global de pruebas
de sensibilidad.
Con respecto a la sensibilidad, la Cepa 1 posee un mecanismo de resistencia enzimático a
β-lactámicos ya que es portadora de una β-lactamasas tipo AmpC de naturaleza
plasmídica, perteneciente a la familia CIT/CMY.
Las β-lactamasas tipo AmpC plasmídicas (BLAP) son enzimas de clase C de Ambler y grupo
1 de Karen Bush y tienen su origen en las β-lactamasas AmpC cromosómicas propias de
Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Morganella morganii y Hafnia Alvei. En el caso
de las enzimas de la familia CIT/CMY el origen es C. freundii. Las BLAP, al igual que sus
progenitores cromosómicos, confieren un patrón característico de resistencia a los
antibióticos β-lactámicos que incluye: resistencia a amino, carboxi y ureidopenicilinas;
cefalosporinas de primera y segunda generación y, en la mayoría de los casos, resistencia a
cefamicinas (cefoxitina). La actividad in vitro sobre las cefalosporinas de tercera generación
(C3G) y el aztreonam es variable. A diferencia de las β-lactamasas de espectro extendido
(BLEE) más frecuentes en nuestro país (CTX-M y PER), las BLAP tienen muy débil actividad
sobre cefalosporinas de cuarta generación (C4G). Los inhibidores clásicos de enzimas de
clase A como ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam tienen escaso poder inhibitorio sobre
las BLAP, aunque algunas pueden ser levemente inhibidas por sulbactam y tazobactam. Los
inhibidores por excelencia de estas enzimas son los compuestos derivados del ácido
borónico y oxacilina o cloxacilina (Beesley y cols. Biochem J.17:316; 1982; Yagi y cols.
JCM, 43:2551; 2005).
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El P. mirabilis enviado presenta resistencia neta a los antibóticos ß-lactámicos solicitados en
la encuesta (ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefalotina) y sensibilidad a ciprofloxacina,
trimetoprima/sulfametoxazol y gentamicina. Los rangos de halos de inhibición obtenidos en
el LNR se muestran en la Tabla 1.b.
Tabla 1.b. Cepa 1: Rangos de referencia y resultados de interpretación de las zonas de
inhibición del LNR.
Antimicrobiano
Rango de referencia (mm)
Interpretación
Ampicilina
6-6
Resistente
Ampicilina/sulbactam
6-9
Resistente
Cefalotina
6-6
Resistente
Ciprofloxacina
31-41
Sensible
Trimetoprima/sulfametoxazol
23-30
Sensible
Gentamicina
19-25
Sensible
Con el envío de esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios
participantes de sospechar y detectar mecanismos de resistencia a C3G partiendo de los
datos de un antibiograma mínimo como es el que puede utilizarse en aislamientos de
bacilo gram negativos en muestras de infección urinaria no complicada de la comunidad.
A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de
sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 98.8%. Solo se
detectaron 1,2% de errores en la interpretación (27/2242), de los cuales el 55,6% fueron
errores menores (15/27), 25,9% muy graves (7/27) y 18,5% graves (5/27). Todos los
errores menores y muy graves estuvieron asociados a los datos de sensibilidad de
ampicilina/sulbactam. En el resto de los antimicrobianos no se observaron dificultades de
interpretación, excepto 5 errores graves en los antibióticos no ß-lactámicos (Tabla 1.c).
Una explicación posible para los errores graves podría ser que en las lecturas de los halos
de inhibición se haya tenido en cuenta el “swarming” (invasión superficial de los halos de
inhibición), típico del género Proteus (debemos recordar que éste no debe ser tenido en
cuenta en la determinación del diámetro de inhibición).
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Tabla 1.c. Cepa 1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los
labs. del PCC-NAC y el LNR.
Nº
Respuestas
Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam
Cefalotina
Ciprofloxacina
Trimetoprima/Sulfametoxazol
Gentamicina
373
371
375
375
374
374
S
Nº
0
7
0
374
372
372
I
%
0
1,9
0
99,7
99,5
99,5
Nº
-15
-----
R
%
-4
-----
Nº
373
349
375
1
2
2
%
100
94,1
100
0,3
0,5
0,5
S: sensible, I: intermedio, R: resistente
Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves
Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos
establecidos por el LNR con una concordancia global de 89,2%. Hubo más de un 98% de
concordancia para ampicilina y cefalotina, mientras que el 22,5% de los participantes
obtuvieron valores de halos de inhibición por fuera del rango esperado para
ampicilina/sulbactam. La concordancia para los antimicrobianos no ß-lactámicos fue entre
83,8 y 89,4 % (Tabla 1.d).
Tabla 1.d. Cepa 1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y
el rango calculado por el LNR.
Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam
Cefalotina
Ciprofloxacina
Trimetoprima/Sulfametoxazol
Gentamicina
Nº
Respuestas
355
351
355
359
358
359
Dentro del rango
Nº
%
353
99,4
272
77,5
350
98,6
301
83,8
320
89,4
312
86,9
Fuera del rango
Nº
%
2
0,6
79
22,5
5
1,4
58
16,2
38
10,6
47
13,1
Como ya se mencionó, el aislamiento en estudio presentaba una BLAP. Un total de 349
laboratorios respondieron sobre el mecanismo de resistencia utilizando el campo sugerido
ad hoc (Tabla 1.e). El 76,5% de los laboratorios respondió correctamente “AmpC
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plasmídico”. 45 laboratorios (12,9%) indicaron como mecanismo sugerido “BLEE” o
“BLEE+impermeabilidad” posiblemente porque algunos participantes detectaron una leve
inhibición (efecto “huevo”) entre amoxicilina/ác. clavulánico y las C3G. Si bien el inhibidor
característico de la BLAP son los derivados del ácido borónico, estas enzimas puede ser
levemente inhibibles por ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam, por lo que puede
observarse dicho efecto. El aislamiento presentaba otros indicios que descartaban la
presencia de BLEE como único mecanismo, como ser: halos de sensibilidad para
cefepime similares a las cepas salvajes (30mm) y falta de agrandamiento ≥5mm para las
combinaciones
cefotaxima/cefotaxima+ac.
clavulánico
y
ceftacidima/ceftacidima+ac.
clavulánico.
Tabla 1.e. Cepa 1: Mecanismo de resistencia sugerido.
Mecanismo de referencia inferido
AMPC PLASMIDICO
BLEE
HIPERPRODUCCION/DERREPRESION DE AMPC
AMPC+ IMPERMEABILIDAD
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
AMPC PLASMIDICO + SENSIBILIDAD DISMIN. A FQ
Nº
Respuestas
267
42
18
5
3
2
1
%
76,5
12
5,2
1,4
0,9
0,6
0,3
BETALACTAMASA (Haemophilus spp./ Enterococcus spp. /
Moraxella spp.)
NO APLICA
1
10
0,3
2,9
Los laboratorios que informaron como mecanismo inferido hiperproducción/derrepresión de
AmpC no tuvieron en cuenta que P. mirabilis no posee naturalmente una AmpC
cromosómica por lo que el término hiperproducción/derrepresión no sería aplicable a esta
especie. El aislamiento no poseía señales de impermeabilidad ni sensibilidad disminuida a
las fluorquinolonas (ác. nalidíxico: 24mm,
ciprofloxacina: 36mm). La cepa no presenta
ningún mecanismo que afecte la actividad de los carbapenemes. Es importante recordar
que el género Proteus presenta sensibilidad disminuida de manera natural a imipenem (los
otros carbapenemes como meropenem o ertapenem no se ven afectados). Sin embargo
esta sensibilidad disminuida difícilmente confiera valores de resistencia.
Nota: se recuerda a los participantes que la sospecha de carbapenemasa en este genero
requiere de halos disminuidos a dos carbapenemes simultaneamente, a saber imipenen
<=22 + meropenem <=27 mm.
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Detección de BLAP
P. mirabilis no presenta resistencia natural a ningún antibiótico β-lactámico activo sobre
bacilos Gram negativos, por lo que la resistencia neta (6mm) observada a cefalotina
debería haber sido un llamado de atención a la hora de analizar los posibles mecanismos
de resistencia involucrados. Halos de cefalotina de 6mm son una alerta para la
presencia de ß-lactamasas tipo BLEE o BLAP en las enterobacterias carentes de
AmpC inducible (E. coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, Shigella spp, Salmonella sp y C.
koseri), por lo que amerita completar el antibiograma para caracterizar el mecanismo
implicado de resistencia a los ß-lactámicos.
Al completar el antibiograma se pudo observar la resistencia a cefoxitina y sensibilidad
reducida a C3G. Se observaron halos de resistencia a cefotaxima (22mm) y sensibilidad a
ceftacidima (21mm), con halos de inhibición muy cercanos al punto de corte. Se obtuvieron
los valores de CIM para C3G por método automatizado (Vitek) y por dilución en agar. El
valor de CIM para cefotaxima fue 8 μg/ml para ambos métodos siendo interpretado como
resistente, mientras que la CIM de ceftacidima fue de 16 μg/ml y 8μg/ml respectivamente
siendo resistente e intermedio según el método ensayado. El aislamiento NO presentó
agrandamiento ≥5mm para las combinaciones cefotaxima/cefotaxima+ac. clavulánico ni
ceftacidima/ceftacidima+ac. clavulánico, característicos de las BLEE y se observó
sensibilidad a cefalosporinas de cuarta generación (cefepime: 30mm, ≤1μg/ml). De esta
manera, se confirma la ausencia de BLEE en esta cepa.
Todos estos indicios nos conducen a sospechar de la presencia de una β-lactamasa tipo
AmpC plasmídica. Debido a que P. mirabilis no posee una β-lactamasa tipo AmpC en su
cromosoma, la detección de esta enzima implica la adquisición de un elemento móvil
(plásmido). Para la confirmación fenotípica se debe realizar la búsqueda de sinergia
(efecto “huevo”) entre cefoxitina y/o las C3G y el ácido 3-amino-fenil-borónico
(APB) (300 μg/disco) (como se ve en el ejemplo de la Foto 1 – disco 33= APB). El APB se
desempeña como inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC, independientemente de su
codificación cromosómica o plasmídica, y aunque también actúa como inhibidor de
carbapenemasas de clase A (KPC, SME, IMI/NMC, etc), esta característica no dificulta la
detección de BLAP en aislamientos que no presenten compromiso en la sensibilidad a los
carbapenemes. Otro inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC es la cloxacilina, que inhibe
específicamente a estas enzimas pero no a las carbapenemasas de clase A. El desempeño
de este inhibidor fue recientemente evaluado en el LNR al desafiar la capacidad de
detección de BLAP de dos métodos comerciales (AmpC Confirm ID Pack y ESBL+AmpC
Screen Pack, ROSCO Diagnostica) que comparan los halos de inhibición obtenidos con
discos de C3G solas y su combinación con cloxacilina. Ambos métodos tuvieron un muy
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buen desempeño en la detección de las BLAP. Las fallas de detección correspondieron a
mecanismos de baja prevalencia y a cepas multirresistentes con más de un mecanismo
adquirido de resistencia a C3G (BLEE más BLAP) (Ver Posters adjuntos: Rapoport y col.
SADEBAC 2012).
Otra prueba simple para corroborar la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina
son los métodos microbiológicos (Masuda, Hodge, y modificaciones de éstos). En presencia
de BLAP, estos métodos presentan un resultado positivo, como el caso de la cepa en
estudio. Las BLAP no son el único mecanismo que afecta cefoxitina: la resistencia puede
ser de naturaleza no enzimática debida a impermeabilidad de la membrana externa. Para el
aislamiento en estudio, la sinergia con APB y el método de Hodge dieron positivos por lo
que se confirma la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina, que posteriormente
fue caracterizada por PCR, dando un resultado positivo para el gen cit/cmy
CAZ
APB
CTX
Foto 1.
Sinergia
entre discos
de 3-amino
fenil
borónico
(APB) vs.
cefotaxima
(CTX) y
ceftacidima
(CAZ).
Informe de BLAP
En el aislamiento en estudio se confirmó la presencia de BLAP y la ausencia de BLEE, por lo
que las C3G deberían ser informadas según los halos de inhibición obtenidos (Tabla 2A
M100-S22). Sin embargo se observa un error minor para la interpretación de ceftacidima
frente al método de referencia (dilución en agar) ya que por disco debería interpretarse
como sensible, mientras que por CIM se informaría intermedio. A la fecha no existe
consenso sobre el reporte de las C3G en cepas productoras de AmpC plasmídico. Del
mismo modo, es escasa la bibliografía internacional sobre la utilidad clínica de C3G en
infecciones provocadas por enterobacterias con BLAP. Sin embargo los nuevos puntos de
corte de CLSI para C3G (vigentes en el documento del CLSI desde el año 2010 y
mantenidos en ediciones posteriores: CAZ: R≤17mm, S≥21mm, R≥16μg/ml, S≤4μg/ml y
CTX: R≤22mm, S≥26mm, R≥4μg/ml, S≤1μg/ml) mejoraron significativamente la detección
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de BLAPs con respecto a los puntos de corte previos (M100-S19, 2009). Teniendo en
cuenta estos conceptos, a la hora de guiar el tratamiento antimicrobiano, sería prudente
evitar el uso de las C3G en infecciones severas basado en las siguientes certezas: las
resistencias enzimáticas como las BLAP elevan poblacionalmente las CIMs de los sustratos
afectados y a su vez, estos valores son plausibles de ser afectados por inóculos bacterianos
de alta densidad.
Uno de los puntos críticos en este tipo de aislamientos de infecciones severas es descartar
la presencia de BLEE para poder informar correctamente la sensibilidad de las C4G. Ante la
confirmación de ausencia de BLEE, el cefepime debe ser informado como sensible, en el
caso que presentara sensibilidad in vitro.
Conclusiones finales. La búsqueda de este tipo de enzimas es especialmente significativa
en aquellos géneros y especies que carecen naturalmente de β-lactamasas tipo AmpC
cromosómicas, como es el caso de P. mirabilis, Klebsiella spp., y Salmonella y en aquellas
que la producen en forma basal o en pequeñas cantidades, como Escherichia coli y Shigella
spp. Se recomienda la utilización de discos de APB cuando se sospecha la presencia de este
mecanismo en estos géneros bacterianos. Por el contrario, en aquellas especies
productoras de AmpC cromosómico (Enterobacter spp. C. freundii, M. morganii,
P. aeruginosa, Serratia spp., Providencia spp.) no tendría sentido probar el disco
de APB para tal fin.
En Argentina, la emergencia documentada de BLAP se remite a la descripción de una
enzima tipo FOX-1 en un aislamiento de K. pneumoniae en el año 1994 (Gonzalez Leiza M.
y col. AAC 1994; 38:2150). Más recientemente, se describe un brote de Shigella flexneri
productora de CMY-2 del Hospital Materno Infantil de Mar del Plata (Rapoport M. y col.
IJAA 2008; 31:385). Desde el año 2006, han sido confirmados en el INEI-ANLIS Malbrán
un número creciente de casos de BLAP en P. mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella y
Shigella. Estos datos de emergencia nacional establecen la necesidad de estar alertas ante
la aparición de perfiles de resistencia compatibles con el mecanismo aquí descripto. Este
reconocimiento permitirá alertar al cuerpo médico no sólo para la seguridad en la elección
del tratamiento del paciente, sino para el diseño de medidas de control a fin de evitar la
diseminación vertical u horizontal de este mecanismo, ya que cepas con estas
características probaron su habilidad para ocasionar brotes de distinta magnitud.
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Cepa Nº 2: Aerococcus urinae
Se trataba de un Aerococcus urinae aislado de orina, cuyo desafío era la identificación
bioquímica.
De los 377 laboratorios que contestaron la encuesta, 265 realizaron la identificación
bacteriana; 26 laboratorios (6,9%) no reportaron dato y 86 la informaron como no viable
(22,8%).
El 84,9% de los laboratorios (225/265) informó correctamente género y especie, el 3,8 %
(10/265) informó género correcto y omitió especie y el 1,5% (4/265) informó género
incorrecto (Tabla 2.a). En la Tabla 2.b se detallan los errores en la identificación
bacteriana.
Tabla 2.a. Cepa 2: Concordancia en la Identificación bioquímica.
Concordancia
Género
Género
Género
Género
y especie correctos
correcto
correcto y especie incorrecta
incorrecto
Nº
225
10
4
26
Porcentaje
(%)
84,9
3,8
1,5
9,8
Tabla 2.b. Cepa 2: Errores en la Identificación
Género y especie
Nº laboratorios
Aerococcus viridans
4
Streptococcus viridans
8
Streptococcus viridans, alfa hemolíticos
1
Streptococcus mitis
2
Streptococcus sp.
2
Streptococcus acidominimus
1
Streptococcus agalactiae
1
Staphylococcus saprophyticus
1
Staphylococcus aureus
1
Staphylococcus coagulase negative
1
Staphylococcus epidermidis
1
Enterococcus sp.
1
Globicatella sp.
1
Leuconostoc sp.
1
Neisseria gonorrhoeae
1
Oligella urethralis
1
Proteus mirabilis
1
Aeromonas ureae
1
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Comentarios Cepa 2 (Dr. Carlos Vay)
La familia Aerococcaceae (definida principalmente sobre la base del análisis filogenético de
las secuencias del ARNr 16S) incluye dos grupos parafiléticos: Uno de ellos contiene
únicamente al género Aerococcus, el otro a los géneros Abiotrophia, Dolosicoccus,
Eremococcus, Facklamia, Globicatella e Ignavigranum.
El género Aerococcus, y la especie Aerococcus viridans fueron propuestos en 1953 para
contener a aquellos cocos gran-positivos catalasa negativos que se diferenciaban de los
estreptococos por su modo de agrupamiento. Mucho más tardíamente, otras especies
fueron incorporándose a ese género: Aerococcus christensenii, Aerococcus sanguinicola,
Aerococcus suis, Aerococcus urinae, Aerococcus urinaeequi y Aerococcus urinaehominis.
Todos ellos son cocos gran-positivos, inmóviles, que forman grupos, tétradas o pares en
medio líquido (la especie A. christensenii forma a menudo cadenas cortas), aerobios y
anaerobios, pero preferentemente, microaerófilos (Aerococcus viridans crece en el primer
centímetro superior del caldo tioglicolato), catalasa negativos en su mayoría, sensibles a
vancomicina, capaces de crecer en caldo hipersalado (ClNa 6,5%). Acidifican la glucosa
(con excepción de Aerococcus suis, especie de importancia en veterinaria) y no poseen
ningún antígeno de grupo de Lancefield. Las reacciones de acidificación de hidratos de
carbono en caldo púrpura de bromocresol suelen demorar algunos días. Con excepción de
algunos aislados de A. viridans, hidrolizan el hipurato.
Es muy importante destacar que para abordar la identificación de los cocos gram-positivos
catalasa negativos se requiere indefectiblemente, de la observación de la morfología que
adoptan en medio líquido (caldo tioglicolato), pues de lo contrario sería imposible identificar
correctamente a los diferentes integrantes de este grupo.
La Tabla 2.c muestra la utilidad de tres características fenotípicas para diferenciar a los
cocos gran-positivos catalasa negativos que forman pares, tétradas o grupos.
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Tabla 2.c: Identificación preliminar de cocos gran-positivos catalasa negativos que forman
pares, grupos o tétradas, basada en tres características fenotípicas.
Reacción fenotípica
PYR
+
LAP
+
Microorganismo(s) posible
ClNa(6,5%)
+
Aerococcus sanguinicola, Dolosigranulum pigrum,
Facklamia languida.
+
+
-
Gemella haemolysans, Rothia mucilaginosa.
+
-
+
Aerococcus viridans, Helcococcus kunzii.
-
+
+
Aerococcus urinae, Aerococcus christenseniia,
Pediococcus, Tetragenococcusb
-
-
+
Aerococcus urinaehominis
Adaptado de Ruoff K. Manual of Clinical Microbiology, 10ª Edición, 2011.
a A. christensenii puede presentar cortas cadenas.
b Tetragenococcus halophilus (Enterococcus solitarius) se diferencia de Aerococcus urinae por las
reacciones positivas de bilis-esculina y de arginina dehidrolasa(ADH) y la incapacidad de hidrolizar
hipurato. En el Manual de Microbiología de la ASM, 10ª Edición, 2001; Ruoff informa que el género
Tetragenococcus es PYR -, sin embargo Facklam et al. describen a Tetragenococcus halophilus como
PYR +; en este caso la reacción positiva de la prueba ADH y de Voges-Proskauer y la ausencia de
hidrólisis del hipurato lo diferencian de A. sanguinicola.
La Figura 2 muestra un esquema dicotómico para abordar la identificación de los cocos
gram-positivos catalasa negativos, aerobios, que se agrupan o forman tetradas.
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Figura 2.
PYRa
+
-
LAP
Va(30µg)
+
Hemólisis
ClNa 6,5%
γ
+
-
βGUR
Esculina
-
+
S
Pediococcus
α
Helcococcus kunzii
-
+
R
βGUR
-
+
Aerococcus christensenii
Aerococcus viridansb
LAP
Gemella haemolysans
Aerococcus
sanguinicola
Rothia mucilaginosac
-
Esculina
+
-
+
Aerococcus urinaehominis
Dolosigranulum
Aerococcus urinae
Facklamia
languida
a
Abreviaturas: PYR: Pyrrolidonil aril amidasa; LAP: Leucina aminopeptidasa, βGUR: Beta-
glucuronidasa, Va (30 µg): disco de vancomicina de 30 µg; resistencia indica ausencia de halo de
inhibición.
b
Helcococcus kunzii es exigente, a menudo lipofílico y crece en anaerobiosis. Aerococcus viridans
forma colonias similares a las de los enterococos con un halo marcado de hemólisis alfa. Crece en la
superficie del caldo tioglicolato, pues desarrollan pobremente o no lo hacen en anaerobiosis.
c
Rothia mucilaginosa (Stomatococcus mucilaginosus) forma colonias grandes blanco grisáceas que
suelen adherirse al medio de cultivo. Son sensibles a bacitracina (0,04UI).
Aerococcus spp. forma parte de la microbiota ambiental: se pueden hallar en el suelo, el
polvo, el agua, la vegetación y por ende también en el ambiente hospitalario. De allí que a
veces son contaminantes del Laboratorio de Microbiología, por lo que su hallazgo debe ser
evaluado en contexto clínico.
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Aerococcus viridans, la especie más vieja del género, causa enfermedad mortal en las
langostas marinas (gafkemia) y es oportunista para el hombre. Endocarditis, artritis
séptica, bacteriemia, infección urinaria y espondilodiscitis son las infecciones ocasionadas
por esta especie más descriptas.
Aerococcus urinae fue descripto por Christensen en Dinamarca en 29 pacientes con
sospecha de infecciones urinarias. Se lo denominó “ALO”, es decir microorganismo similar a
los aerococos. En 11 de estos pacientes fue aislado como único microorganismo de la orina
en un recuento superior a 100.000 ufc/ml. El 50 % de los pacientes presentaban trastornos
locales o sistémicos (diabetes, neoplasias del sistema urinario o de otros sitios, litiasis
urinaria). Los pacientes con septicemia o endocarditis por estos microorganismos eran
gerontes con enfermedades subyacentes tales como diabetes, cáncer de próstata e infarto
de miocardio. Luego varias comunicaciones han sido publicadas en la que se demuestra
definitivamente la capacidad de esta especie de causar infecciones urinarias con o sin
bacteriemia y endocarditis.
Recientemente, Senneby et al., han presentado un trabajo que muestra las características
clínicas y microbiológicas de las bacteriemias por Aerococcus urinae. De 16 paciente con
bacteriemia 15 eran hombres de más de 70 años y 12 presentaban condiciones urológicas
subyacentes. El foco urinario fue sospechado en la mayor parte de los casos, sin embargo
el microorganismo fue raramente aislado de la orina en esta serie. Nueve pacientes
presentaron sepsis y uno falleció. Tres pacientes presentaron endocarditis, uno presentó
espondilodiscitis como complicación de la misma y otro paciente embolia cerebral. En esta
revisión los pacientes fueron tratados con antibióticos beta-lactámicos, aunque también
fueron utilizadas quinolonas y clindamicina.
Aerococcus urinae suele ser sensible a penicilina, amoxicilina y vancomicina. Las
fluorquinolonas muestran moderada o buena actividad y algunas cefalosporinas pobre
actividad, con excepción de cefepima. Cattoir et al.,
estudiaron la sensibilidad de 30
aislamientos de Aerococcus spp. (A. urinae 20, A. sanguinicola 8 y A. viridans 2) y
demostraron que todos ellos, fueron sensibles a amoxicilina, vancomicina y teicoplanina y
presentaron bajo nivel de resistencia a los aminoglucósidos(gentamicina). En este trabajo
las fluorquinolonas, la fosfomicina y el co-trimoxazol (TMS) tuvieron actividad variable. A.
urinae fue a menudo resistente a TMS y sensible a fosfomicina, en tanto que, A.
sanguinicola fue resistente a fosfomicina y sensible a TMS. Sin embargo, Facklam describe
que 10 de 15 aislados de A. sanguinicola mostraron sensibilidad intermedia a TMS y que la
totalidad fueron muy sensibles a penicilina (CIM ≤ de 0,03 ug/ml ) y cefotaxima (CIM ≤ de
0,25 ug/ml). La resistencia a penicilina puede observase en la especie A. viridans con
relativa frecuencia.
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
13
A. christensenii ha sido aislado de vagina humana y A. urinaehominis de sangre y de orina
respectivamente. A. sanguinicola fue aislado principalmente de sangre y de orina.
Bibliografía:
Cattoir V, Kobal A, Legrand P. Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, two
frecuently misidentified uropathogens. Scand J infect Dis. 42:775.780, 2010.
Christensen J, Jensen I, Faerk J et al. Bacteremia/septicemia, due to Aerococcus like
organism: report of seventeen cases. Clin Infect Dis. 21:943-947, 1995.
Christensen J, Vibits H, Ursing J, et al. Aerococcus –like organism, a newly recognized
urinary tract pathogen. J Clin Microbiol.29:1049-1053, 1991.
Facklam R, Lovgren M, Shewmaker P, Tyrell G. Phenotipic description and antimicrobial
susceptibilities of Aerococcus sanguinicola isolated from human clinical samples.
J Clin Microbiol 41:2587-2592, 2003.
Ludwig W, Schleifer K, Whitman W.: Family II. Aerococcaceae fam. nov. In: De Vos P,
Garrity G, Jones D, Krieg N, Ludwig W, Rainey F, Scheleifer K, Whitman W. (eds): Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 3, p.533. (The Firmicutes),
Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, 2009.
Ruoff K. En En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML, Warnock D.
Manual of Clinical Microbiology. 10º Edición. Vol 1. Capítulo 22. ASM Press, Washington DC,
2011.
Senneby E, Petersson A, Rasmussen M. Clinical and microbiology features of bacteremia
with Aerococcus urinae. Clin Microbiol Infect. 18:546-550, 2012.
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
14
Cepa Nº 3: Pseudomonas aeruginosa
La cepa Nº 3 de esta encuesta provenía de hemocultivos de un paciente con bacteriemia.
Se enviaron dos aislamientos de Pseudomonas aeruginosa productores de carbapenemasa
tipo metalo-beta-lactamasa (MBL), diferentes en cuanto al tipo de enzima involucrada en
dicho
mecanismo
de
resistencia
a
los
antibióticos
β-lactámicos
y
a
la
sensibilidad/resistencia al resto de los antibióticos solicitados:
Cepa 3.1. P. aeruginosa MBL tipo IMP
Cepa 3.2. P. aeruginosa tipo VIM
.
La mitad de los participantes del Programa recibió la Cepa 3.1 y la otra mitad, la cepa 3.2.
En la Tabla 3 se muestra un cuadro comparativo con las características fenotípicas y
genotípicas diferenciales de las dos cepas en cuestión: la Cepa 3.1 era resistente de
alto nivel a ceftacidima y ciprofloxacina y sensible a amicacina y la Cepa 3.2 era
resistente de alto nivel a amicacina, resistente de bajo nivel a ceftacidima y
sensible a ciprofloxacina.
Tabla 3: Características fenotípicas/genotípicas de P. aeruginosa 3.1 y 3.2
Antibiótico
Cepa 3.1
Cepa 3.2
P. aeruginosa
P. aeruginosa
MBL IMP
MBL VIM
Zona de
Interpretación
Zona de
inhibición
inhibición
(mm)/
(mm)/
Interpretación
Imipenem
11 – 18
Resistente
6 – 15
Resistente
Meropenem
12 – 20
Resistente
6 – 17
Resistente
Ceftazidima
6
Resistente
9 – 17
Resistente
Piperacilina/
20 – 26
Intermedio/Sensible
13 – 20
Resistente/Intermedio
6
Resistente
24 – 34
Sensible
27 – 33
Sensible
6
Resistente
Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina
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15
Epidemiología de las MBL en Pseudomonas aeruginosa: En las últimas décadas se
ha demostrado la emergencia y diseminación de cepas de bacilos gram negativos
productores de carbapenemasas tipo MBL en diferentes partes del mundo. Sin embargo, P.
aeruginosa, continúa siendo el huésped bacteriano más frecuentemente asociado a MBL a
nivel mundial, sólo amenazado en los últimos años por la dispersión de NDM en múltiples
especies de Enterobacterias. Los primeros hallazgos de MBL en P. aeruginosa provienen de
Japón (Wantabe, 1991) y Verona, Italia (Laurenti, 1999), para enzimas de tipo IMP y VIM
respectivamente. Posteriormente otras enzimas han sido reconocidas como parte de la
familia de MBLs en aislamientos clínicos de P. aeruginosa como SPM, GIM, AIM y NDM.
Estas enzimas poseen capacidad hidrolítica sobre penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes
y cefamicinas (cefoxitina). Sólo el monobactam aztreonam (AZT) evade la acción de estas
carbapenemasas, siempre que se encuentre como mecanismo único. Las enzimas de la
familia MBL pertenecen a la clase molecular 3b de la clasificación de Karen Bush. De
manera distintiva, las MBLs requieren de metales divalentes (Zn2+) en su sitio activo,
indispensable para su capacidad hidrolítica. Es por ello que en presencia de EDTA u otros
quelantes
de
metales
divalentes,
como
la
combinación
de
EDTA+SMA
(ácido
etilendiaminotetraacético/mercaptoacetato de sodio), estas enzimas presentan una
inhibición característica.
P. aeruginosa: Detección de carbapenemasas del tipo MBL
(Grupo 3b de Karen Bush.)
EDTA/SMA
imipenem
meropenem
ceftacidima
Pip+tazob.
aztreonam
Ceftacidima +
ac clavulanico
cefepima
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
16
Las variantes más comúnmente reportadas son IMP-1, IMP-13 y VIM-2, todas ellas
microbiológica y clínicamente similares que han alcanzado proporciones pandémicas debido
a la movilización de clones hiper-epidémicos.
En Argentina, los primeros hallazgos de MBL se produjeron a finales del año 2002. En la
Ciudad Autónoma de Buenos Aires se detecta por primera vez la presencia de una nueva
variante de VIM (VIM-11) en P. aeruginosa recuperada de un paciente pediátrico (Pasterán,
2005). Desde entonces, se ha vigilado activamente en Argentina la aparición de MBL en P.
aeruginosa y también en otros bacilos gram negativos. En la actualidad, se ha podido
identificar la dispersión en Argentina de P. aeruginosa productoras de diversas MBLs con
un patrón regional característico y único en el país. Independientemente de la zona
geográfica y las variantes involucradas, se observa una tendencia sostenida y creciente de
casos reportados durante los últimos dos años. Ello motivó el envío de la presente cepa a
los laboratorios participantes del Programa.
Consecuencias clínicas: Las consecuencias clínicas producto de la emergencia de MBL
han sido exploradas en los últimos años. La mortalidad asociada a infecciones severas por
P. aeruginosa productoras de MBL asciende al 70-95% (Carmeli, 2010; Zavaschi, 2006).
Según estas publicaciones, las únicas variables con capacidad de ser modificadas, en todo
intento por reducir la mortalidad asociada, resultan el inicio precoz del tratamiento
antimicrobiano y la apropiada selección de antibióticos. Es por ello que la detección precoz
de este tipo de resistencia es crítica y debe ser realizada con la mayor precisión diagnóstica
por parte de los laboratorios de microbiología clínica. El régimen antimicrobiano ideal para
el tratamiento de infecciones producidas por P. aeruginosa con MBL aún no se ha
determinado, pero sin lugar a dudas, el uso clínico como monoterapia de sustratos
afectados por la enzima como penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes, no debería ser
considerado de primera elección. Debido a la multiresistencia asociada a cepas productoras
de MBL, colistina resulta el antimicrobiano con mayor actividad in vitro y ha sido utilizado
para el tratamiento de estos gérmenes (Sabuda, 2008). Al igual que para enterobacterias
productoras de carbapenemasa, la terapia combinada se asocia a mayor éxito clínico
(Carmelli 2010). La inclusión de un carbapenem en la combinación no ha sido explorado,
tal vez por los altos valores de CIM a carbapenem frecuentemente asociados a P.
aeruginosa con carbapenemasa, a diferencia de las Enterobacterias que han adquirido
estos mecanismos.
Detección fenotípica: en el Boletín Informativo Nº 3 -2011, en los comentarios de la
Cepa 3-Encuesta Nº42: P. aeruginosa KPC+ (enviado en noviembre de 2011), se incluyó
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
17
una
actualización
sobre
la
Detección
fenotípica
de
carbapenemasas
en
Pseudomonas aeruginosa. Este Boletín contenía: el ALGORITMO DE BÚSQUEDA
DE CARBAPENEMASAS - PAE 2012 con información vigente para el análisis
interpretado del antibiograma de P. aeruginosa. Para más detalles sobre la búsqueda
y confirmación de carbapenemasas en PAE, por favor remitirse a dicho Boletín. De todas
formas, anexamos nuevamente el algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas en P.
aeruginosa.
Con esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios para
detectar carbapenemasas de trascendencia clínica y epidemiológica, como las
MBLs.
Este punto es de suma importancia, porque la presencia de carbapenemasas involucradas
en procesos infecciosos severos, determina alta probabilidad de falla de tratamiento a
aquellas drogas incluidas en el espectro de sustratos de estas enzimas. Mas aún, estas
carbapenemasas tienen una gran capacidad de diseminación, por lo que su hallazgo, debe
acompañarse con los mayores esfuerzos del equipo de salud a fin de contener una posible
diseminación del microorganismo o de la carbapenemasa.
Pruebas de sensibilidad de Cepa 3.1: P. aeruginosa MBL tipo IMP
La identificación bacteriana fue realizada por 187 laboratorios. El 98,9% de los laboratorios
(185/187) informó correctamente género y especie y 1,1% (2 laboratorios) informaron
género correcto pero reportaron especie incorrecta. (Tabla 3.1.a).
Tabla 3.1.a. Cepa 3.1: Concordancia en la Identificación bioquímica.
Concordancia
Género
Género
Género
Género
y especie correctos
correcto
correcto y especie incorrecta
incorrecto
Nº
185
2
-
Porcentaje
(%)
98,9
1,1
-
El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi--penicilinas y cefalosporinas
por la portación de MBL y además a ciprofloxacina (CIM ≥4µg/ml) y sensibilidad a
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
18
piperacilina/tazobactam (CIM 16µg/ml), gentamicina (CIM ≤ 4µg/ml), amicacina (CIM ≤
2µg/ml) y colistín (CIM 2µg/ml). Presentaba sensibilidad intermedia a aztreonam (CIM
16µg/ml, halo 19 mm).
CAZ
FEP
CIM
≥64 (R) ≥64 (R)
(µg/ml)
TAZ
ATM
GEN
AKN
CIP
COL
16(S)
16 (I)
4 (S)
≤ 2(S)
≥4 (R)
2(S)
CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam, GEN:
gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin
La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se
presenta en la Tabla 3.1.c. A pesar de algunas diferencias observadas en los valores
absolutos de las CIMs a los carbapenemes, todas las metodologías fueron capaces de
detectar esta cepa como “sospechosa de carbapenemasa” con las señales de alarma de
cada una de las metodologías propuestas en el algoritmo del LNR. Ver Anexo 3: Algoritmo
para la búsqueda de carbapenemasas.
Tabla 3.1.c. Cepa 3.1: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metodologías
CEPA 3.1
MEROPENEM
IMIPENEM
Sospecha
carbapenemasa
según Algoritmo
A.dilución
(μg/ml)
4
4
Microdilución
(μg/ml)
16
16
Vitek2C
(μg/ml)
2
8
Phoenix
(μg/ml)
4
8
Etest
(μg/ml)
3
16
Sensititre
(μg/ml)
8
16
Rango LNR
(mm)
12-20
11-18
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
La presencia de MBL también se confirmó fenotípicamente con el Método de discos
combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos (Póster ICAAC 2011, Pasterán y
cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):
Meropenem: 19 mm
Meropenem + APB (600ug/disco): 19 mm
Delta: 0 mm
Interpretación: Negativo (<=3).
Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 19 mm
Delta: 0 mm
Interpretación: Negativo (<=2)
Meropenem + EDTA (750ug/disco): 32 mm
Delta: +13 mm
Interpretación: Positivo (>= 8)
A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de
sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 92,7 %. Se
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
19
detectaron 7,2% de errores en la interpretación (n=80), de los cuales 46 fueron errores
menores (57,5%), 9 graves (11,3%) y 25 muy graves (31,2%). La mayoría de los errores
menores estuvieron asociados a piperacilina/tazobactam (36/46), los graves estuvieron
asociados a amicacina (9/9) y los muy graves se distribuyeron principalmente entre
imipenem (8 errores), meropenem (8 errores) y ciprofloxacina (7 errores). Se detectó que
siete laboratorios cometieron error muy grave en la interpretación de ciprofloxacina y error
grave en amicacina, simultáneamente. Esto podría deberse a que si bien se les envió la
cepa 3.1, informaron resultados compatibles con el fenotipo de la cepa 3.2. Más del 90%
de los laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima
(92,5, 94,6% y 98,4 respectivamente). (Tabla 3.1.d)
Para piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue 20-26 mm correspondiéndose con
la categoría de I o S del CLSI. De los 175 laboratorios que reportaron zonas de inhibición
para este antibiótico, 148 (84.6%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de
referencia. 125 laboratorios (69,8%) lo interpretaron como S, 18 (10,1%) I y 36 (20,1%)
R. La cepa presentó un valor de CIM de 16 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de
referencia, correspondiéndose con la categoría “sensible” del CLSI (la CIM “borderline” que
presenta este antibiótico sería responsable del comportamiento descripto en el método de
difusión). Piperacilina/tazobactam podría ser una opción terapeútica (alta dosis) en cepas
de P. aeruginosa con MBL que presenten sensibilidad a esta droga (Zavaschi, 2006).
Tabla 3.1.d. Cepa 3.1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre
los labs. del PCC-NAC y el LNR.
Nº
Respuestas
Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina
187
186
186
179
187
186
S
Nº
8
8
2
125
7
177
I
%
4,3
4,3
1,1
69,8
3,8
95,2
Nº
6
2
1
18
1
-
R
%
3,2
1,1
0,5
10,1
0,5
Nº
173
176
183
36
179
9
%
92,5
94,6
98,4
20,1
95,7
4,8
S: sensible, I: intermedio, R: resistente
Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves
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20
Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos
establecidos por el LNR con una concordancia entre 79% y 94% para todos los antibióticos
solicitados. La concordancia global en las zonas de inhibición fue 85,4% (Tabla 3.1.e)
Tabla 3.1.e. Cepa 3.1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCCNAC y el rango calculado por el LNR.
Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/ Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina
Nº
Respuestas
177
177
176
175
176
178
Dentro del rango
Nº
%
146
82,5
141
79,7
165
93,8
148
84,6
164
93,2
140
78,7
Fuera del rango
Nº
%
31
17,5
36
20,3
11
6,2
27
15,4
12
6,8
38
21,3
Con respecto al item “Mecanismo de resistencia sugerido” fue respondido por 180/187
laboratorios (96,3%). Se consideraron como respuestas correctas el informe de
“carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL)” o “carbapenemasa”. 147 laboratorios
(87,1%) informaron correctamente alguna de estas opciones. La cepa no poseía BLEE
como mecanismo adicional.
Tabla 3.1.f. Cepa 3.1: Mecanismo de resistencia sugerido.
Mecanismo de referencia inferido
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL)
CARBAPENEMASA
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
MLSb INDUCIBLE + RESISTENCIA A FQ
SENSIBILIDAD DISMINUIDA A FLUORQUINOLONAS
NO APLICA
Nº
Respuestas
139
8
27
2
1
1
1
1
%
77,2
4,5
15,0
1,1
0,5
0,5
0,5
0,5
Llama la atención la alta proporción de laboratorios (n=27) que reportó la coexistencia de
BLEE en esta cepa. La caracterización molecular permitió demostrar que la cepa 3.1
presentó sólo una beta-lactamasa adquirida, la carbapenemasa tipo IMP. La disociación de
la sensibilidad a PIPERACILINA (dentro de la categoría S) contrastando con la resistencia a
ceftacidima que presentó la cepa 3.1, también es una característica frecuentemente
asociada a MBL del tipo IMP. Recordamos a los participantes que la detección de BLEE en
cepas con MBL requiere de métodos fenotípicos muchas veces no disponibles en la rutina
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
21
como el agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repetición del antibiograma
estratégico. Los intentos de inhibir la MBL con el disco de EDTA como reemplazo al medio
suplementado para posterior examinación de los discos de IMP-CAZ bajo el gradiente de
EDTA, son poco reproducibles y en extremo subjetivos.
Cepa 3.2: P. aeruginosa MBL tipo VIM
La identificación bacteriana fue realizada por 189 laboratorios. El 98,4% de los laboratorios
(186/189) informó correctamente género y especie, el 1,1% (2 laboratorios) informó
género correcto pero omitió especie. Un laboratorio informó género incorrecto. (Tabla
3.2.a).
Tabla 3.2.a. Cepa 3.2: Concordancia en la Identificación bioquímica.
Concordancia
Género
Género
Género
Género
y especie correctos
correcto
correcto y especie incorrecta
incorrecto
Nº
Porcentaje
(%)
186
2
1
98,4
1,1
0,5
El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi-, ureido-penicilinas y
cefalosporinas por la portación de MBL y además a amicacina (CIM ≥64 µg/ml),
gentamicina (CIM ≥16 µg/ml) y sensibilidad a aztreonam (CIM 8 µg/ml), ciprofloxacina
(CIM 1 µg/ml) y colistín (CIM 2 µg/ml).
CAZ
FEP
CIM
≥64 (R) ≥64 (R)
(µg/ml)
TAZ
ATM
GEN
AKN
CIP
COL
64(I)
8 (S)
≥16 (R)
≥64 (R)
1 (S)
2(S)
CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam, GEN:
gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin
La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se
presenta en la Tabla 3.2.c. Al igual que en la cepa 3.1, todas las metodologías detectaron
este aislamiento como “sospechoso de carbapenemasa” a pesar de las diferencias en los
valores absolutos de las CIMs a carbapenemes
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
22
Tabla 3.2.c. Cepa 3. 2: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metodologías
CEPA 3.2
MEROPENEM
IMIPENEM
Sospecha
carbapenemasa
según Algoritmo
A.dilución
(μg/ml)
16
32
Microdilución
(μg/ml)
ND
ND
Vitek2C
(μg/ml)
>16
8
Phoenix
(μg/ml)
8
>8
SI
ND
SI
SI
Etest
(μg/ml)
8
>32
Sensititre
(μg/ml)
8
16
Rango LNR
(mm)
6-17
6-15
SI
SI
ND: no determinado
La presencia de MBL también se confirmó en este aislamiento con el método de discos
combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos (Póster ICAAC 2011, Pasterán y
cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):
Meropenem: 15 mm
Meropenem + APB (600ug/disco): 15 mm
Delta: 0 mm
Interpretación: Negativo (<=3).
Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 17 mm
Delta: +2 mm
Interpretación: Negativo (<=2)
Meropenem + EDTA (750ug/disco): 34 mm
Delta: +19 mm
Interpretación: Positivo (>=8)
A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de
sensibilidad de esta cepa. La concordancia global fue 91,8%. Se detectó 8,2 % de errores
en la interpretación (n=91), de los cuales 65 fueron errores menores (71,4%), 5 graves
(5,5%) y 21 muy graves (23,1%). La mayoría de los errores menores estuvieron asociados
a piperacilina/tazobactam (48/65), los graves estuvieron asociados a ciprofloxacina (5/5) y
los muy graves se distribuyeron de manera uniforme entre imipenem (7 errores),
meropenem (4 errores), ceftacidima (5) y amicacina (5 errores). Más del 92 % de los
laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima (94,6%,
97.3% y 92,4
respectivamente). (Tabla 3.2.d.) Se detectó que los cinco laboratorios
cometieron error muy grave en la interpretación de amicacina y error grave en
ciprofloxacina, simultáneamente. Esto podría deberse a que si bien se les envió la cepa 3.2,
informaron
resultados
compatibles
con
el
fenotipo
de
la
cepa
3.1.
Para
piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue 13 - 20 mm correspondiéndose con la
categoría de I o R del CLSI. De los 184 laboratorios que reportaron zonas de inhibición
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
23
para este antibiótico, 135 (75.8%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de
referencia. 48 laboratorios (26,1%) lo interpretaron como S, 36 (19,6%) I y 100 (54,3%)
R. La cepa presentó un valor de CIM de 64 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de
referencia, correspondiéndose con la categoría intermedio del CLSI (la CIM “borderline”
que presenta piperacilina/tazobactam sería responsable del comportamiento descripto en el
método de difusión).
Tabla 3.2.d. Cepa 3.2: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre
los labs. del PCC-NAC y el LNR.
Nº
Respuestas
Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina
184
184
185
184
184
183
S
Nº
7
4
5
48
175
5
I
%
3,8
2,2
2,7
26,1
95,1
2,7
Nº
3
1
9
36
4
-
R
%
1,6
0,5
4,9
19,6
2,2
Nº
174
179
171
100
5
178
%
94,6
97,3
92,4
54,3
2,7
97,3
S: sensible, I: intermedio, R: resistente
Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves
Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos
establecidos por el LNR con una concordancia entre 80 y 92% para ciprofloxacina,
imipenem, amicacina y meropenem y entre 76% y 78% para piperacilina/ tazobactam y
ceftacidima. La concordancia global fue 83,2% (Tabla 3.2.d).
Tabla 3.2.e. Cepa 3.2: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCCNAC y el rango calculado por el LNR
Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/ Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina
Nº
Respuestas
176
176
176
178
177
173
Dentro del rango
Nº
%
149
84,7
162
92,0
138
78,4
135
75,8
143
80,8
151
87,3
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Fuera del rango
Nº
%
27
15.3
14
8.0
38
21.6
43
24.1
34
19.2
22
12.7
24
Con respecto al item “Mecanismo de resistencia sugerido” fue respondido por 184/190
laboratorios (96.8%). Se consideraron como respuestas correctas el informe de
“carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL)” y “carbapenemasa”. 159 laboratorios
(86.4%) informaron correctamente alguna de estas opciones.
Tabla 3.2.f. Cepa 3.2: Mecanismo de resistencia sugerido.
Mecanismo de referencia inferido
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL)
CARBAPENEMASA
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
BLEE
MLSb INDUCIBLE
MLSb CONSTITUTIVO
RESISTENCIA NO ENZIMATICA A CARBAPENEMES
NO APLICA
Nº
Respuestas
154
5
15
2
1
1
2
1
1
2
%
83.7
2.7
8.2
1.1
0.5
0.5
1.1
0.5
0.5
1.2
Llama nuevamente la atención la alta proporción de laboratorios (n=15) que reportó la
coexistencia de BLEE en esta cepa. La cepa 3.2 por PCR presentó solamente una betalactamasa adquirida, la carbapenemasa tipo VIM. Además en esta cepa no se observó
disociación entre PIPERACILINA y ceftacidima (ambas dentro de la categoría R) que
frecuentemente se asocia con BLEE en P. aeruginosa, pero como vimos en la cepa anterior,
también con MBL tipo IMP. Recordamos a los participantes que la detección de BLEE en
cepas con MBL requiere de métodos fenotípicos muchas veces no disponibles en la rutina
(agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repetición del antibiograma estratégico).
Conclusiones finales
Debido a la persistente diseminación de MBL en Argentina y el elevado impacto en la
morbi/mortalidad de las infecciones asociadas a estos gérmenes, alentamos a los
laboratorios a realizar un esfuerzo y confirmar fenotípicamente los mecanismos de
resistencia en aquellos aislamientos sospechosos de carbapenemasa según los puntos de
corte epidemiológicos propuestos en el algoritmo (o remitir a Centros Centinela en caso de
no poder efectuar estos pasos confirmatorios). La dinámica de diseminación de los
mecanismos descriptos y la emergencia de nuevos, hacen imprescindible la confirmación
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molecular por parte del Centro Nacional de Referencia frente a todo hallazgo confirmado
fenotípicamente de carbapenemasa en P. aeruginosa.
Anexo 3
Algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas. Actualización 2012.
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Pregunta Nº 21
Marque el microorganismo más probable que presenta las siguientes características
fenotípicas: No invade, no fermenta lactosa, TSI A/A (SH2 negativo), LIA desaminada,
ureasa +, citrato+, fenilalanina +, Indol+, ODC-, fermentación manosa-,
presenta
resistencia a: cefalotina, ampicilina, colistina y nitrofurantoína.
a- Providencia stuartii
b- Providencia rettgeri
c- Proteus vulgaris
d- Proteus penneri
Recibimos 375 respuestas. 221 (58,9%) laboratorios informaron la opción correcta: c)
Proteus vulgaris, 110 (29,3%) optaron por la Rta “b”, 37 (9,9%) laboratorios respondieron
“a” y 7 (1,9%) respondieron “d”. Dos laboratorios no enviaron respuesta a la pregunta.
Nº de Laboratorios
221
(58,9%)
110
(29,3%)
37
(9,9%)
7
(1,9%)
Rta
S/D: sin dato
Proteus vulgaris es una de las 5 especies que poseen nombre, que integran el género
Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri, P. hauseri y P. myxofaciens), puesto que
existen además, tres especies genéticas que aún no han sido nomencladas (Proteus
genoespecies 4, 5 y 6). Es la segunda especie en frecuencia de aislamiento, de las 4 que
pueden infectar al hombre (la especie P. myxofaciens no ha sido aún reconocida en
especímenes clínicos humanos).
Dado que no existen diferencias fenotípicas entre P.
vulgaris “sensu stricto”, y las especies genéticas 4, 5 y 6 se considera que las 4 especies
forman el Complejo Proteus vulgaris. Asimismo, desde un punto de vista práctico a este
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complejo podría incluirse la especie P. hauseri pues sus características fenotípicas son
idénticas a las del Complejo P. vulgaris.
Junto con Providencia y Morganella, el género Proteus, conforma la conocida tribu Proteae.
Este grupo (Tribu Proteae) de la familia Enterobacteriaceae presenta las siguientes
características diferenciales con el resto de los integrantes de esta familia:
 Móviles (la mayor parte de los aislamientos)
 Ausencia de fermentación de lactosa
 ONPG ( β galactosidasa): Ausente
 Decarboxilación de lisina e hidrólisis de L-arginina: Ausente
 Deasaminación de fenil- alanina o triptófano
Para aquellos laboratorios que utilizan el medio Agar Hierro Lisina (Agar LIA) la
desaminación de este aminoácido sólo se presenta en los géneros Proteus y Providencia y
está ausente en el género Morganella.
Cabe mencionar que unas pocas Enterobacteriacea que infectan con mucha menor
frecuencia al hombre que las
pertenecientes a la tribu Proteae
pueden desaminar la
fenilalanina. A continuación, la Tabla 1, enumera las pruebas de primera línea utilizadas en
la identificación fenotípica en los laboratorios de microbiología clínica, que excluyen a estas
Enterobacteriacea infrecuente, de la Tribu Proteae:
Especie / fenilalanina deaminasa(%)a
Rahnella aquatilis (95%)
Prueba diferencial b
lactosa +, ONPG+, malonato+, urea-, β Glu +,
inmóvil a 35ºC
Butiaxella noackiae (100%)
ONPG+, urea –, malonato+
Complejo Enterobacter agglomerans(20%)
ONPG +, Pig amarillo (75%), urea (20%)
Cronobacter(Enterobacter)sakasakii (50%)
lactosa+,ONPG+, ODC+, ADH+, Pig amarillo+
Pragia fontium (20%)c
urea –
Tatumella ptyseos (90%)
urea -, inmóvil a 35ºC
Adaptado de Farmer JJ III, Wright K, Janda M. Enterobacteriaceae. Manual of Clinical Microbiology.
2007.
b
+: indica más del 90 % de los aislados producen la reacción positiva; -: indica menos del 10% de
los aislados producen la reacción positiva. Pig: pigmento, ONPG: o-nitro fenil β- galactosidasa, ODC:
ornitina decarboxilasa, ADH: arginina dehidrolasa, β Glu: β- glucosidasa.
c
No se ha encontrado en muestras de origen humano.
a
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Como corolario se puede resumir que las especies raras de Enterobacteriaceae que
desaminan fenilalanina a diferencia de la tribu Proteae producen ONPG con excepción de
Pragia y Tatumella. Estas últimas no desaminan lisina.
Los aislamientos pertenecientes al género Proteus se identifican presuntivamente por su
olor típico desagradable, la invasión en medios no selectivos y la producción de sulfuro de
hidrógeno en agar TSI. Sin embargo, el olor desagradable también está presente en los
cultivos de Morganella y Providencia; el fenómeno de la invasión puede estar ausente en
los aislados clínicos y la producción de gas sulfídrico también. Si bien en las tablas del
manual de la ASM se consigna con un porcentaje de positividad del 98, 95 y 30% a la
prueba de SH2 en agar TSI para P. mirabilis, P. vulgaris y P. penneri, respectivamente,
estos porcentajes suelen diferir de los observados por otros microbiológos. De hecho en la
última edición de Manual de Microbiología de ASM (Versalovic J. et al., 10ª edición, 2011)
en la tablas de diferenciación de Proteus, Providencia y Morganella y sus respectivas
especies, la prueba de SH2 en P. vulgaris se consigna como V (11-89% de positividad para
la prueba). Al parecer, el porcentaje del 98% para las producción de SH2 en P. mirabilis es
excesivamente alto, pues en nuestro medio es bastante habitual encontrar la ausencia de
tal característica en esta especie. De hecho, Castro et al. describieron sobre un total de 87
P. mirabilis aislados de muestras clínicas que la producción de SH2 fue detectada en el
67%. Algo similar sucedió con P. vulgaris puesto que de 103 aislados la producción de SH2
fue del 76%. La Tabla 2 muestra las principales características fenotípicas diferenciales
entre los géneros que integran la tribu Protege
Tabla 2. Características fenotípicas diferenciales de los géneros que integran la Tribu Proteae.
Prueba
Proteus
Morganella
Providencia
Ureasa
+
+
Va
SH2 (TSI)
V
-b
-
Invasión( 35ºC)
V
-
-
Citrato(Simmons)
V
-
+c
Des lis(LIA) d
+d
-
-
ODC
Ve
+f
-
Manosa/xilosa
-/+
+/-
+/-
Gelatinasa
+g
-
-
-
+ (al menos uno de
Manitol,arabitol, inostol,adonitol -
ellos según especie)
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a
Providencia rettgeri +, Providencia stuartii V, Providencia alcalifaciens –
Algunos biotipos pueden producir una pequeña cantidad de SH2 en agar TSI
c
Algunos aislamientos pueden ser negativos
d
Des Lis: Lisina deaminasa. P penneri puede no desaminar la lisina o producir la reacción después
de las 24 hs incubación.
e
P mirabilis +, P. vulgaris P. hauseri y P penneri-. P mirabilis puede producir la reacción negativa.
f
Algunos aislados puede producir la reacción negativa.
g
Uno de cada dos P. penneri producen la reacción positiva. Si se utiliza el método de Frazier sólo es
válido para las cepas que no producen invasión.
b
La Tabla 3 muestra las características diferenciales de las especies del género Proteus
Tabla 3: Características diferenciales de las especies del género Proteus que infectan humanos.
Característica a
P. mirabilis
Complejo P. vulgaris
P. penneri
(Incluye P. hauseri)
TSI
alcalino/ácido b
ácido/ácido
ácido/ácido
SH2 (TSI)
V
V
Vc
Citrato(Simmons)
V
V
-
ODC
+d
-
-
Indol
-
+
-
Sacarosa
-e
+
+
Maltosa
-
+
+
a
TSI: agar hierro tres azúcares, ODC: ornitina decarboxilsa. Sacarosa y maltosa: fermentación de,
preferentemente en medio base de Andrade.
b
Sólo un pequeño porcentaje de P. mirabilis puede fermentar sacarosa y producir un TSI
ácido/ácido.
c
La mayoría de los aislados no generan SH2 en TSI.
d
Algunos aislados no decarboxilan la ornitina. En el esquema de identificación la diferenciación se
puede hacer a través de las reacciones obtenidas en agar TSI. La prueba confirmatoria es la
fermentación de la maltosa.
e
Un pequeño porcentaje fermenta sacarosa.
Para tener en cuenta:
Existen aislamientos de P. vulgaris que no invaden y no producen SH2. Estos aislamientos
presentan muchas similitudes fenotípicas con los aislamientos de Providencia spp ureasa+
(P. rettgeri o P. stuartii). La Tabla 4 muestra las similitudes y las diferencias fenótipicas
entre ambos.
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Tabla 4: Características diferenciales y similitudes entre P. vulgaris SH2- y no invasivo y
Providencia spp ureasa+.
Prueba
Proteus vulgaris
(SH2-, No invasivo)
Agar TSI
a
(ureasa +)
ácido/ ácido
alclino/ácido a
V
+
Citrato(Simmons)b
LIA c
Providencia spp
desaminada
desaminada
Indol c
+
+
ODC c
-
-
Manosa d
-
+
Xilosa d
+
-
Gelatinasa d
+
-
Maltosa
+
-
Es posible que aislamientos que fermentan la sacarosa (más frecuentemente se observan en P.
stuartii) produzcan un TSI ácido/ ácido, es decir idéntico al que produce P. vulgaris.
Citrato + 20%, en Farmer JJ et al. Manual of Clinical Microbiology, 2007. Aislados de Providencia
spp pueden no crecer en citrato.
c
Características fenotípicas idénticas entre Providencia spp y P. vulgaris
d
Características diferenciales de género.
b
Con referencia al perfil de sensibilidad P vulgaris es portador de una β lactamasa de clase A
de Ambler (grupo 2e de Karen Bush), tipo cefuroximasa, que se inhibe con ácido
clavulánico. Esta β-lactamasa confiere a los aislados salvajes resistencia a las
aminopenicilinas, a las cefalosporinas de primera generación, como la cefalotina, pero no a
la combinación de aminopenicilinas con ihnibidores de β-lactamasas (como ampicilina con
sulbactama y amoxicilina con ácido clavulánico).
En cambio, Providencia rettgeri y P. stuartii son portadoras de una cefalosporinasa de clase
C de Ambler (grupo 1 de Karen Bush), de tipo AmpC. De ello se deduce que posee
resistencia a las cefalosporinas de primera generación y de acuerdo a la capacidad de
inducción a las aminopenicilinas y a la combinación de las mismas con inhibidores de β
lactamasa. No obstante, Cornaglia et al. han descripto aislados de Providencia de origen
urinario, sensibles a amoxicilina-ácido clavulánico. Providencia stuartii (también lo puede
ser P. rettgeri) es resistente a gentamicina.
PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
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Bibliografía:
Abbot
S.
Klebsiella,
Enterobacter,
Citrobacter,
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