TP 7 - Departamento de Biología Molecular

Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico N° 7: Estudio de la actividad enzimática y específica de fosfatasa
ácida de Pseudomonas fluorescens C.
Objetivo:
 Determinar la actividad específica de fosfatasa ácida (AcPasa) en distintas fracciones
obtenidas por fraccionamiento salino de extracto periplásmico y evidenciar en cual de ellas
la enzima se encuentra más enriquecida.
Introducción:
Las enzimas son catalizadores biológicos que actúan acelerando las reacciones
químicas, permitiendo que ocurran en un tiempo adecuado. Básicamente, la enzima (E) se
une al sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato [ES] donde ocurren cambios en
la molécula de sustrato dando origen al producto (P), sin alterar la enzima.
E + S
[ES]
P + E
La actividad de una enzima se determina como la cantidad de producto formado, o de
sustrato consumido, en un tiempo dado. Si se cuenta con un método específico para detectar
la aparición del producto o la desaparición del sustrato, se podrá medir cuantitativamente la
actividad de la enzima. Si el producto es coloreado, absorbe luz en la región visible del
espectro. Así, si la concentración de producto aumenta, también aumentará la absorción de
luz, Absorbancia (A) o Densidad Óptica (DO), indicando un aumento de la actividad
enzimática.
Para cuantificar el producto por medidas de Absorbancia, a una determinada longitud
de onda, se utiliza la Ley de Lambert y Beer:
A =  . b . C (mol/l) a
: coeficiente de extinción molar o de absortividad molar.
b: longitud de la celda, de 1cm.
C: concentración de la sustancia, en este caso, el producto.
La actividad de una enzima se expresa en Unidades por ml (U.mL-1) que se definen
como los nanomoles de producto formado por minuto por mililitro de solución (nmol.min1.mL-1).
La relación entre la actividad de una enzima con el total de proteínas presente en una
muestra se define como la actividad específica (AE). Esta es una expresión muy utilizada
que nos indica la pureza relativa de la enzima en una solución, y se expresa como la
actividad enzimática, en Unidades, por mgr de proteina (U.mgr-1).
Como ya se ha visto en TP anteriores, si se agregan grandes cantidades de una sal muy
soluble a una solución proteica, disminuye la interacción proteína-H2O predominando la
interacción proteína-proteína y se produce la precipitación de las mismas. Como la
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concentración salina a la cual se produce la precipitación no es igual para cada proteína, se
puede utilizar esta propiedad para la separación y purificación de alguna proteína en
particular a partir de extractos complejos. Una de las sales más utilizadas para este
procedimiento es el (NH4)2SO4, debido a su gran solubilidad, la cual varía poco con la
temperatura.
La enzima Fosfatasa Ácida (AcPasa) con la cual se trabajará en el TP, es una enzima
periplásmica. Previamente los docentes, realizaron una extracción de las proteínas
periplásmicas y al extracto obtenido se le realizó un fraccionamiento salino agregando
(NH4)2SO4 en un 30 %, 60 % y 95% de saturación.
En el presente TP se deberá determinar la AE en el Extracto Periplásmico (EP) sin
tratar y en la fracciones 30%, 60% y 95%. Para ello se determinará la actividad enzimática
a cada una de las fracciones mencionadas. Por otro lado, la concentración de proteínas de
estas fracciones fue determinada en el TP anterior y corresponden a las muestras
denominadas como soluciones problemas P1, P2, P3 y P4.
Medición de la enzima fosfatasa ácida, AcPasa.
En el trabajo práctico se estudiará la enzima utilizando un sustrato artificial. La AcPasa
cataliza la hidrólisis del sustrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP), incoloro, en fosfato
inorgánico (Pi) + p-nitrofenol (p-NP), éste producto es coloreado en medio alcalino y
absorbe en la región visible del espectro de luz.
AcPase
+
2+
Mg
p-NPP
(incoloro)
PO43 -
p-NP
(amarillo)
La actividad se determinará midiendo la A del p-NP a 410nm y se expresará en (U.ml-1).
Pero el sustrato p-NPP se hidroliza espontáneamente, entonces, no sólo se medirá la A del
p-NP producto de la acción enzimática sino también la de la propia hidrólisis. Esto se
corrige realizando un blanco de reacción, que consistirá en colocar la mezcla de reacción
pero sin la muestra de enzima. Se descontará la A de este tubo a todos los demás.
Técnica.
1.- Rotular 5 tubos como: Blanco (B), EP, 30, 60, 95.
2.- Para cada determinación, la reacción enzimática se realizará colocando las siguientes
soluciones:
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Solución:
Buffer AcH/AcNa pH 5,0 (0,2 M)
MgCl2 (100mM)
p-NPP (50 mM)
Muestra de enzima
H2O
(c.s.p. 500 l)
Volumen
250 l
10 l
50 l
10 l
180 l
Concentracion final
0,1 M
2 mM
5 mM
500 l
Volumen final de reacción
3.- Homogeneizar en vortex cada tubo y colocar en baño de H2O a 37°C durante 15 min.
4.- Transcurrido el tiempo, sacar los tubos del baño y dejarlos en hielo. Agregar 500 l de
Na(OH) 2 N.
5.- Medir la DO a 410 nm en espectrofotómetro.
6.- A cada medición restar la DO del tubo B, esto se considera DO corregida, y es la DO
producto de la actividad enzimática, únicamente.
7.- Calcular la actividad de la enzima en U.ml-1 utilizando la siguiente fórmula y
registrarlos en el cuadro al final de la guía:
1000 L
DOcorregida
U . mL-1 =
.
 .
15 min
10 L
 p-NPP a 37°C = 0,0161142
8.- Calcular AE de cada una, relacionando este dato con la concentración de proteínas
obtenida en el TP anterior.
Actividad enzimática (U . mL-1)
-1
AE (U.mgr )
=
mgr de proteínas (mgr. mL-1)
9.- Concluir en que fracción se encuentra más enriquecida la AcPasa.
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