Análisis de secuencias de DNA

Análisis de secuencias de DNA
(Sesión de bioinformática de Genética)
HOJA DE TRABAJO
Análisis de una secuencia bacteriana de DNA
1. Abre el archivo bacteria.seq
2. Utilizando la función geometría presenta la secuencia como cadena única y copia aquí los
100 primeros nucleótidos (después vuelve a la presentación original):
AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATAT
ATCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATT
3. Utilizando la función orientación haz el cambio reverse & complement (inversa y
complementaria) y copia aquí los 50 primeros pares de nucleótidos de la cadena 5’-3’.
Vuelve a la presentación original (reverse & complement), copia los 50 últimos pares de
nucleótidos de la cadena complementaria y comprueba que se corresponden (fíjate que el
programa reconoce la dirección 5’-3’ de las dos cadenas, y por tanto, siempre que copias y
pegas un segmento empieza por el nucleótido en 5’ independientemente que tu lo veas a la
derecha o a la izquierda):
CGCCAGATACCTGGGATGCGGCATCGCGCGATTAAGCCGACAATCGCAAC
CGCCAGATACCTGGGATGCGGCATCGCGCGATTAAGCCGACAATCGCAAC
4. Tabla de aminoácidos. Abre la tabla de aminoácidos y copia el código de una y tres letras
correspondiente a los siguientes aminoácido:
Alanina
Glicina
Histidina
Leucina
Metionina
A
G
H
L
M
5. Composición. Con esta función calcula la composición nucleotídica del fragmento de 400
pb comprendido entre las bases 601 y 1000.
nucleótido
Adenina
Timina
Citosina
Guanina
A
Nº bases
Porcentaje
82 20.50%
1
C 105 26.25%
G 121 30.25%
T
92 23.00%
From 601 to 1000, total =
400
6. Análisis de pautas de lectura abiertas.
a. Con la herramienta Open Reading Frame Analysis haz que busque en toda la secuencia
pautas de lectura abiertas (ORFs) con un mínimo de 40 aminoácidos.
¿Cuántas ha encontrado el programa?
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Ordénalas por tamaño en formato descendente. Copia y pega aquí las características que
tienen las cuatro de mayor tamaño. Indica sus coordenadas (nucleótido inicial y final), longitud de
la proteína y la cadena en la que está la pauta (Frame + : directa o Frame –: complementaria):
Busca entre todas las ORFs, dos que estén solapadas, una de ellas completamente dentro de
la otra (indica sus coordenadas y la cadena) ¿Qué crees que puede significar esto?:
b. Busca ahora ORFs de más de 700 aminoàcidos, pero marcando la casilla de la función
Nested Reading Frame (pautas de lectura anidadas o solapadas).
¿Cuántas detecta el programa? Escribe los nucleótidos de inicio y final.
3
c. Suponiendo que se trata de un gen codificante ¿en cuál de los codones de inicio comienza?
Vamos a buscarlo intentando observar si a corta distancia (7-10 nt) de los potenciales
codones de inicio hay una secuencia de unión al ribosoma (secuencia Shine Dalgarno, cuyo
consenso es 5’-AGGAGG-3’, aunque dependiendo de lo importantes que son los genes no
siempre está muy conservada). Has de usar el comando Go to que te selecciona y muestra
resaltada toda la ORF desde el principio. Copia a continuación 20 nucleótidos en cada
región (los 17 nucleótidos anteriores al codón de inicio y los 3 de éste). Si la encuentras,
resalta la secuencia Shine-Dalgarno (normalmente no están conservados los 6 nucleótidos):
820 aa ATCACGAGGTAACAACCATG
2
771 aa CCAACCATCTGGTGGCGATG
720 aa CGCTTGCACGGTTGAAAATG
7. Mutación. Vamos a ver ahora los efectos que pueden tener sobre un gen del operón de la
treonina (thrB) los diversos tipos de mutaciones. Tomaremos el segundo gen del operón de
2801 a 3730:
a) sustituciones nucleotídicas sinónimas (cambiar 3307 T por C)
b) sustituciones nucleotídicas no sinónimas (cambiar 3303 T por C)
c) deleción de un nucleótido (eliminar nt 2904 (T))
d) inserción de 3 nucleótidos (insertar AAA detrás del nucleótido 2903)
Pon la traducción a +2. Selecciona la proteína normal codificada entre 2801 y 3727 y pégala a
continuación (cambia la letra a Courier New 8). Para hacer cambios en la secuencia te sitúas
primero en el lugar del cambio y luego has de desbloquear la secuencia (Unlock en Edit). Haz el
cambio que te parezca adecuado y copia la proteína codificada a continuación. Luego has de
hacer Undo para volver a la proteína original. Repítelo con la siguiente mutación y copia la
proteína codificada. Resalta los cambios de las 4 mutaciones.
Normal
MVKVYAPASSANMSVGFDVLGAAVTPVDGTLLGDVVSVEAADHFRLHNLGRFADKLPPEPRENIVYQCWERFCQALGKTIPVAMTLEKNMPIGSGLGSSA
CSVVAALVAMNEHCGKPLNDTRLLALMGELEGRISGSIHYDNVAPCFLGGMQLMIEENGIISQQVPGFDEWLWVLAYPGIKVSTAEARAILPAQYRRQDC
IAHGRHLAGFIHACYSRQPQLAAALMKDVIAEPYRARLLPGFSQARQAVSEIGALASGISGSGPTLFALCDKPETAQRVADWLSKHYLQNQEGFVHICRL
DTAGARVVG
c) MVKVYAPASSANMSVGFDVLGAAVTPVDGTLLGDGYPLKQRIISVCITWGDLPINCRRSRVKILFISAGNVFARHWGKPSRWR
d)
MVKVYAPASSANMSVGFDVLGAAVTPVDGTLLGDEMVSVEAADHFRLHNLGRFADKLPPEPRENIVYQCWERFCQALGKTIPVAMTLEKNMPIGSGLGSS
ACSVVAALVAMNEHCGKPLNDTRLLALMGELEGRISGSIHYDNVAPCFLGGMQLMIEENGIISQQVPGFDEWLWVLAYPGIKVSTAEARAILPAQYRRQD
CIAHGRHLAGFIHACYSRQPQLAAALMKDVIAEPYRARLLPGFSQARQAVSEIGALASGISGSGPTLFALCDKPETAQRVADWLSKHYLQNQEGFVHICR
LDTAGARVVG
¿Qué cambios has detectado en las secuencias de las proteínas?
¿Afecta la mutación (c) al siguiente gen del operón?
8. Otros análisis (trabajo adicional para fuera de la sesión presencial).
a. Compara las coordenadas y la cadena que has guardado de las 4 ORFs más largas con las
del documento del GeneBank que os hemos entregado fotocopiado y que corresponden al
operón treonina y al gen yaaA de Salmonella enterica. ¿Ha detectado correctamente los
genes la herramienta de Open Reading Frame Analysis? Escribe en la siguiente tabla las
coordenadas.
Nombre gen
(GeneBank)
GeneBank
(inicio)
GeneBank
(final)
ORF
(inicio)
ORF
(final)
3
b. Como puedes leer en el documento de GeneBank, al inicio del operón existe el sistema de
regulación génica por atenuación que incluye varios segmentos de DNA complementario y
una pequeña pauta abierta que codifica para el péptido líder:
¿Qué aminoácido está en una proporción inusualmente elevada en el péptido líder?
Localiza el péptido líder en la secuencia d y busca el terminador de la transcripción asociado al
sistema de regulación por atenuación (permite la formación de una horquilla de nucleótidos
complementarios terminada en una tira de uracilos) Copia y pega la secuencia y resalta los
nucleótidos complementarios y la tira de Timinas.
Lider 190-255
Palindromes:
210
caccattacc
|||| |||||
247
gtggcaatgg
219
225
caccattacc
|||| |||||
gtggcaatgg
234
ggtgcgggct
||||||||||
ccacgcccga
253
247
244
288
272
310
238
238
279
agaaaaaagcccgcac
| ||||||||||||||
ttttttttcgggcgtg
287
295
AGAAAAAAGCCCGCACCTGAACAGTGCGGGCTTTTTTTT
c. Localiza las secuencias del promotor bacteriano la caja -10 (centrada en -10, consenso
TATAAT) y la caja -35 (centrada a -35, consenso TTGACA). Utiliza la herramienta Find
para buscar la secuencia consenso de -35 limitando la búsqueda a un segmento entre 1 y 190
en la cadena + y permitiendo 1 diferencia (mismatch). Copia la región de 1 a 200 nt, y
resalta las dos cajas y el codón de inicio del péptido líder.
AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATAT
ATCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTT
AGGCGGGCAGATACTTTAACCAATATAGGAATACAAGACAGACAAATAAAAATGACA
GAGTACACAACATCCATGAACCGCAT
E. coli
Sequence (capitalized letter indicates transcription start base):
gccgtgagta aattaaaatt ttattgactt aggtcactaa atactttaac caatataggc
Atagcgcaca gacagataaa a
4
SESIÓN EUCARIOTAS
Análisis de una secuencia de DNA eucariota
1. Abre la secuencia eucariota.seq que corresponde a un gen de la levadura del pan
Saccharomyces cerevisiae.
YML056C/IMD4 on chromosome XIII
IMP dehydrogenase (Inosina Monofosfato deshidrogenasa)
eucariota.seq Cromosoma XIII
1 - 460 164176 - 163717
Exon
461 - 868 163716 - 163309
Intron
Exon 869 - 1983 163308 - 162194
2. Localiza las secuencias exónicas e intrónicas y copia aquí la secuencia correspondiente a las
dos regiones de cambio de exón-intrón e intrón-exón (10 nt del exón y 10 del intrón de cada
una). Resalta los nucleótidos del intrón:
exó-intró: CCAGTTACTGGTATGTTATA
intró-exó: TTGAACACAGAAGACGGTAA
3. Mutación. Si se produce una mutación en el nucleótido 461 con el cambio de una G por una
A y suponemos que el intrón no puede eliminarse del mRNA Copia y pega a continuación
la proteína codificada (formato Courier New 8). Después elimina el intrón en el DNA, obtén
la proteína normal codificada y pégala a continuación ¿Qué efecto ha producido la
mutación? Resalta la diferencia.
Cambio últimos nucleotidos y aparicion codón de parada tras una L
MSAAPLDYKKALEHLKTYSSKDGLSVQELMDSTTRGGLTYNDFLVLPGLVNFPSSAVSLQTKLTKKITLNTPFVSSPMDTVTEADMAIYMALLGGIGFIH
HNCTPKEQASMVKKVKMFENGFINSPIVISPTTTVGEVKVMKRKFGFSGFPVTGML
MSAAPLDYKKALEHLKTYSSKDGLSVQELMDSTTRGGLTYNDFLVLPGLVNFPSSAVSLQTKLTKKITLNTPFVSSPMDTVTEADMAIYMALLGGIGFIH
HNCTPKEQASMVKKVKMFENGFINSPIVISPTTTVGEVKVMKRKFGFSGFPVTEDGKCPGKLVGLVTSRDIQFLEDDSLVVSEVMTKNPVTGIKGITLKE
GNEILKQTKKGKLLIVDDNGNLVSMLSRADLMKNQNYPLASKSATTKQLLCGAAIGTIEADKERLRLLVEAGLDVVILDSSQGNSVFQLNMIKWIKETFP
DLEIIAGNVATREQAANLIAAGADGLRIGMGSGSICITQEVMACGRPQGTAVYNVCQFANQFGVPCMADGGVQNIGHITKALALGSSTVMMGGMLAGTTE
SPGEYFYKDGKRLKAYRGMGSIDAMQKTGNKGNASTSRYFSESDSVLVAQGVSGAVVDKGSIKKFIPYLYNGLQHSCQDIGCESLTSLKENVQNGEVRFE
FRTASAQLEGGVHNLHSYEKRLYN
¿Entre qué posiciones del codón está insertado el intrón? Copia y pega los nucleótidos y
aminoácidos de los límites exón-intrón.
Entre la 1ª y 2ª posición de los codones
E
CTGGTA
CAGAA
5
Secuencia 2: Gen transformer (tra) de Drosophila melanogaster
En Drosophila la determinación del sexo incluye una cascada reguladora. En uno de sus puntos
interviene la Proteína Sex-lethal (Sxl), regulando la expresión del gen transformer.
En el archivo transformer.txt dispones de 3 secuencias correspondientes a:
(1) el mRNA de machos, (2) el de hembras y (3) el segmento de DNA genómico del gen
transformer. Compara los dos mRNAs con el genómico y, sabiendo que en hembras la proteína
de unión al RNA Sex-lethal (Sxl) se une al mRNA de transformer para ejercer su efecto
regulador, describe lo que ha ocurrido. Para ayudarte a representarlo dispones de un pdf con un
alineamiento múltiple de las tres secuencias. Puedes copiar y pegar las partes que te interesen y
sobre la imagen marcar las señales en el mRNA que son las responsables del efecto regulador
Además, has de copiar y pegar las proteínas que se originan en machos y en hembras, las cuales
son diferentes (resalta lo común) y permiten la continuación de la cascada reguladora para que se
expresen finalmente los genes específicos de macho y los de hembra de forma diferente en cada
uno de los sexos.
Se observa en rojo el sitio dador del intrón GT…, en azul el sitio receptor del macho precedido por
una larga tira de Ts. Finalmente en verde el sitio aceptor que se usa en las hembras con una pequeña
tira de Ts.
El sistema funciona de forma que en ausencia de la proteína Sxl activa (en machos) se usa el mejor
sitio aceptor de splicing (el azul). En presencia de la proteína Sxl (en hembras) se une al mRNA del
gen transformer en la zona azul impidiendo el uso del sitio aceptor principal. De esta forma se usa
uno ”críptico” no tan bueno como el anterior. El resultado son las dos proteínas siguientes cuya
secuencia se puede obtener con GeneRunner
Proteína Hembras: 197 aminoácidos
MKMDADSSGTQHRDSRGSRSRSRREREYHGRSSERDSRKKEHKIPYFADEVREQDRLRRL
RQRAHQSTRRTRSRSRSQSSIRESRHRRHRQRSRSRNRNRSRSSERKRRQHSRSRSSERRRR
6
QRSPHRYNPPPKIINYYVQVPPQDFYGMSGMQQSFGYQRLPRPPPFPPAPYRYRQRPPFIGV
PRFGYRNAGRPPY
Proteína Transformer de machos: 36 aminoácidos (no funcional)
MKMDADSSGTQHRVSYCVKCEMDENERWTTRQRKRS
Sugiere una o varias mutaciones del gen transformer que en hembras o en machos pudiera alterar
la regulación por parte de Sxl.
1) Por ejemplo una mutación en el sitio aceptor de machos AG a AT produciría que éstos usaran el
de las hembras y se produciría la Proteína Transformer en machos, ocasionando probablemente que
se desarrollaran como hembras (no he buscado ejemplos reales y puede que hubiera algún tipo de
letalidad).
2) Por ejemplo una mutación que elimina el gen o casi todo el gen. Las hembras no pueden producir
la proteína Tra y por tanto se desarrollan como machos. Este es el caso de tra1 descrito por
Sturtevant
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