PRÁCTICA 8 - biblioteca upibi

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS
ALIMENTOS
PRÁCTICA 8
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
1. OBJETIVOS
a) Conocer los fundamentos de dos métodos de determinación del contenido
proteico de los alimentos: Microkjeldahl y Biuret.
b) Determinar el porcentaje de proteínas por ambos métodos.
c) Analizar las ventajas y desventajas de cada método considerando los
resultados y lo reportado en la literatura.
2. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas, componentes mayoritarios del protoplasma
al constituir (50% del peso seco celular). Poseen masas moleculares de 5000 a
varios millones de daltones y están constituidas básicamente por cadenas de L-aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Además de estos
compuestos, pueden existir los llamados generalmente grupos prostéticos,
componentes no proteicos, como metales, azúcares, lípidos, ácidos nucleicos,
etc. En este caso se formarán las heteroproteínas. Si sólo son cadenas
polipeptídicas, serán homoproteínas.
Las proteínas desempeñan un rol muy activo en todos los procesos metabólicos.
Algunas forman parte de las membranas de células animales; otras son
reguladoras de reacciones, hormonas, como insulina y somatotrofina;
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contráctiles, por ejemplo miosina y actina; transportadoras de oxígeno
(mioglobina y hemoglobina); protectoras de la sangre (fibrinógeno e
inmunoglobulinas) y otras más son de reserva (gliadinas y zeínas). Sin duda las
más importantes son las enzimas, biocatalizadores altamente específicos y
eficaces.
Algunas son tóxicas para animales superiores (venenos de víboras y toxinas de
microorganismos) o bien para microorganismos (antibióticos); también existen
las de efecto antinutricional (inhibidores de tripsina) y otras más son productos
de antígenos, causando alergias a los consumidores de los alimentos que las
contienen.
Los alimentos de origen animal contienen de 12 a 20%, excepto la leche (3.5%).
Las leguminosas poseen entre 23 y 33%, la soya llega a tener un 53%. En
cambio los cereales y los tubérculos presentan valores menores, 7-16% y
alrededor del 3% respectivamente. Las hortalizas y frutas contienen de 1.5 a
cantidades menores del 1%.
La mayoría de los métodos se basan en el análisis de los constituyentes de las
proteínas como el nitrógeno, ciertos aminoácidos o el enlace peptídico,
asumiendo que la cantidad de estos y el contenido proteico es constante. Los
métodos que se basan en la determinación de nitrógeno son el Kjeldahl y
Dumas. En éste último el nitrógeno se libera por pirólisis y se determina
volumétrica mente. En el primero, los componentes con nitrógeno se oxidan a
amoniaco, calentando la muestra con ácido sulfúrico más un catalizador (iones
de cobre, mercurio o selenio). También se incluyen sulfato de sodio o potasio
para incrementar el punto de ebullición de la mezcla. La etapa de digestión es
muy importante y puede tomar varias horas hasta que la muestra se aclare. La
mezcla se enfría y se alcaliniza con hidróxido de sodio y se destila. El amoniaco
se recibe en una solución de ácido bórico y posteriormente se valora con una
solución de ácido clorhídrico de normalidad conocida. El cálculo se basa en el
hecho de que un átomo de nitrógeno producirá un mol de amoniaco y éste a su
vez requerirá un mol de ácido para su neutralización. El porcentaje de proteína
se obtendrá multiplicando el factor de conversión del alimento por el porcentaje
de nitrógeno. Este método es el más empleado, pues es altamente reproducible,
aunque debe considerarse la interferencia de los compuestos nitrogenados no
proteicos de la muestra.
Los métodos espectrofotométricos más comunes son el de Biuret y Lowry. El
primero se basa en la reacción del reactivo de Biuret (solución alcalina de sulfato
cúprico) con la proteína, produciendo un complejo púrpura. El ion cúprico forma
un complejo coordinado con cuatro grupos nucleofílicos –NH, los cuales
provienen de los enlaces peptídicos de las proteínas. El complejo presenta una
máxima absorción a 330-545 nm. Esta técnica se ajusta a la ley de BeerLambert cuando la concentración proteica es de 20g/L aproximadamente;
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muestras que contengan menos de 1g/L son difíciles de leer su absorbancia. El
método es reproducible, pero no muy exacto. El método de Lowry es una
variante del de Biuret. El complejo cobre-proteína reduce a los ácidos
fosfotúngstico y fosfomolíbdico, principales constituyentes del reactivo de Folin y
Ciocalteu, a azules de tungsteno y molibdeno. La máxima absorción de estos
compuestos es 600-800 nm. Aproximadamente el 75% de la reducción es
causado por el complejo cobre-proteína y el resto se debe a la tirosina y en
menor grado al triptofano. El método es un poco más sensible que el de Biuret y
se aplica en un intervalo de 10g a 1mg de proteína (20mg/L a 2g/L). En ambos
métodos se requiere de una curva patrón.
Otros métodos son el Naranja G (reacciona con la arginina e histidina) y el de la
reflactancia de luz infrarroja, usando un espectro patrón.
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
a)
Explicar el concepto de proteínas y su importancia.
b)
Explicar las diferencias entre péptido, polipéptido y proteína.
c)
Explicar los métodos de determinación del contenido proteico, haciendo
hincapié en los empleados en la práctica.
d)
Explicar sus ventajas y desventajas de cada método.
e)
Explicar como se calcula el porcentaje de proteína a partir del nitrógeno
total.
f)
Explicar el significado del factor empleado en este cálculo, su
variabilidad y cuáles son los empleados para carnes, clara, huevo,
leche, trigo, maíz y soya.
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4. MATERIALES Y REACTIVOS
Aparatos digestor y destilador
microkjeldahl
Balanza analítica
Espátulas
Espectrofotómetro con celdas
Matraces aforados de 100 mL y de 1
L.
Matraz de bola y fondo plano de 250
mL
Matraz Erlenmeyer de 125 mL
Matraces microkjeldahl de 30 mL
Papel encerado
Perlas de ebullición
Pipetas aforadas de 1 y 2 mL y
graduadas de 20 mL
Tubos de ensaye y gradilla
Vasos de precipitados de 50 y 500
mL
Agua destilada
Ácido sulfúrico concentrado
Clara de huevo
Harinas de soya y maíz
Indicador*
Mezcla digestora de selenio para
microkjeldahl
Solución 0.02N de ácido
clorhídrico
Soln. de hidróxido de sodio al
10%
Soln. de NaOH (60g) más tiosulfato de
sodio pentahidratado (5g) en 100 mL
Solución saturada de ácido
bórico
Sulfato cúprico
pentahidratado
Tártrato doble de sodio y potasio
Yoduro de potasio
*(5 partes de una solución alcohólica al 0.2% de verde de bromocresol más una
parte de una solución alcalina al 0.2% de rojo de metilo)
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
5.1. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL
PROTEICO: MÉTODO DE MICROKJELDAHL
Y
CONTENIDO
a) Se pesan de 10-100mg de harina en un trozo de papel encerado en la
balanza analítica y se coloca el papel con la muestra en el matraz
microkjeldahl de 30 mL, el cual contiene algunas perlas de ebullición.
b) Se agregan cuidadosamente 1g de la mezcla digestora de selenio y 2 mL
de ácido sulfúrico concentrado. Cuando la muestra es mayor de 15mg, se
agrega 0.1 mL adicional por cada 10mg de muestra.
c) Se coloca el matraz en el digestor y se calienta. Se mantiene la ebullición
hasta que se aclare la muestra (tonalidad verdosa).
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d) Se deja enfriar el matraz y con cuidado se transfiere su contenido
(incluyendo las perlas) al matraz del destilador, lavándose de 5 a 6 veces
el matraz microkjeldahl con agua destilada para transferir así la totalidad
de la muestra digerida.
e) Se añaden poco a poco 8-10 mL de la solución de hidróxido de sodiotiosulfato de sodio pentahidratado.
f) En el matraz Erlenmeyer de 125 mL receptor del destilado, se colocan 5
mL de una solución saturada de ácido bórico y de 2-4 gotas del indicador
rojo de metilo y verde de bromocresol.
g) Se calienta a ebullición ligera hasta recolectar 50 mL de destilado. Éste se
valora con una solución 0.02N de ácido clorhídrico hasta la aparición de
un color violeta.
h) La determinación se hará para las harinas de maíz y soya y cada una de
ellas se realizará por triplicado.
i) Debe realizarse simultáneamente un experimento testigo: se repite el
procedimiento anterior con todas las sustancias mencionadas, pero sin la
muestra.
% Nitrógeno Total = V x N x meq de N2 x 100
M
donde:
V = mL gastados en la valoración de la muestra
N = Normalidad del ácido clorhídrico empleado en la valoración
meq = miliequivalentes de nitrógeno, 14.007 mg
M = Cantidad de muestra (g)
% de Proteína = % Nitrógeno Total x Factor
donde:
F = Factor de conversión según el tipo de alimento
5.2.
MÉTODO DE BIURET
Preparación del reactivo de Biuret
a) Disolver 1.5g de sulfato cúprico pentahidratado y 6g de tártrato de doble
de sodio y potasio en 500 mL de agua.
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b) Añadir 300 mL de una solución de hidróxido de sodio al 10% (p/v) y
aforar a 1 l.
c) Añadir 2g de yoduro de potasio como conservador.
Preparación de las muestras
Clara de huevo. Tomar 1 mL de clara de huevo y diluirlo con 19 mL de agua
destilada.
Harina de soya entera. Se pesa 1g de harina de soya y se diluye en 100 mL de
agua destilada.
Harina de maíz. Se pesa 1g de harina de maíz y se diluye en 100 mL de agua
destilada.
Procedimiento
a) Se vierten de cada solución preparada 1 mL en sendos tubos de ensaye
por triplicado y se añade a cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret.
b) Se dejan reposar las soluciones por media hora a temperatura ambiente.
c) Se calibra el espectrofotómetro con un blanco, el cual contiene 0.5 mL de
una solución amortiguadora o agua destilada más 2.5 mL del reactivo de
Biuret.
d) Se lee su absorbancia a 545 nm en el espectrofotómetro. La
concentración de proteína se obtiene interpolando los valores de
absorbancia en la curva tipo.
Curva tipo
a) Se prepara una solución base de 10 mg/mL de albúmina de suero bovino
en agua destilada.
b) Se toman alícuotas de esta solución a tubos y se diluyen con agua
destilada, de tal manera que contengan 1, 2.5, 5, 7.5 y 10 mg/mL. Se
prepara un testigo con agua destilada.
c) Se les da el mismo tratamiento y simultáneamente que a las muestras de
los alimentos para leer su absorbancia. Se construye la curva tipo
graficando concentración contra absorbancia.
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6. INFORME DE RESULTADOS
6.1. MÉTODO DE MICROKJELDAHL
Tabular los resultados de la siguiente manera:
a) Gramos de muestra.
b) Normalidad de la solución de HCl.
c) mL gastados de la solución de HCl en la valoración de la muestra – mL
gastados en el blanco.
d) Porcentajes de nitrógeno total.
e) Factor empleado y porcentajes de proteína, su desviación estándar y
coeficiente de variación.
f) Comparar los resultados con los reportados en la literatura y explicar las
posibles desviaciones.
6.2. MÉTODO DE BIURET
a) Tabular los resultados de absorbancia y concentración de la proteína.
b) Reportar las medias, desviaciones estándar y coeficientes de variación.
c) Comparar los resultados con los reportados en la literatura y explicar las
posibles desviaciones.
d) Indicar las aplicaciones de este análisis, comparándolo con el de
Microkjeldahl.
e) Realice observaciones y sugerencias sobre la práctica.
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