purificación de la lectina de frijol tépari phaseolus acutifolius y

PURIFICACIÓN DE LA LECTINA DE FRIJOL TÉPARI Phaseolus acutifolius Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD AGLUTINANTE.
López Martínez F.J. (1); Blanco Labra A. (2); García Gasca T. (1).
(1)Facultad de Ciencias Naturales, Licenciatura en Biología.
Universidad Autónoma de Querétaro.
(2) Centro de Investigación de Estudios Avanzados del IPN.
CINVESTAV Irapuato.
RESUMEN.
Se realizó la purificación de la proteína Lectina del frijol Tépari mediante técnicas de
intercambio iónico, debido a que extractos, de muestras anteriores, presentaban otro tipo de
proteínas que no correspondían con las características de las lectinas, las cuales podrían estar
interfiriendo con la capacidad aglutinante de las lectinas sobre eritrocitos de conejo, forma en
la que se mide su actividad específica y así determinar las unidades aglutinantes por
miligramo de proteína.
Se llevó a cabo todo el proceso de molienda y extracción de la harina, así como la
precipitación de la proteína por medio de Sulfato de amonio y se ingresó a una columna de
exclusión molecular de sephadex G75. Se llevaron a cabo diferentes variantes en las técnicas
de intercambio iónico modificando el tiempo y el gradiente de NaCl en un equipo colector de
fracciones.
Los resultados que se obtuvieron fueron satisfactorios ya que se determinó una considerable
actividad aglutinante en fracciones que presentaban una baja concentración de proteína, lo que
nos indica que la lectina se encuentra parcialmente pura.
INTRODUCCIÓN.
El frijol tépari (Phaseolus acutifolius) es una leguminosa comestible adaptada a condiciones
áridas y semiáridas y es muy resistente a condiciones agronómicas adversas como son las
altas concentraciones de sales, poca agua, además presenta gran tolerancia a plagas de
insectos y microorganismos y a diversas enfermedades que normalmente afectan al frijol
común (Thomas y Waines , 1984).
Las lectinas son proteínas de origen no inmunológico que interactúan con carbohidratos libres
o enlazados a membranas celulares (Sharon y Lis, 1972), dichas proteínas tienen la capacidad
de aglutinar células, especialmente eritrocitos. Una de las funciones de las lectinas en las
plantas es la defensa contra depredadores y patógenos debido a que presentan efectos
antifisiológicos como una disminución en la digestibilidad y absorción de nitrógeno y
carbohidratos (Rea y col., 1985). Por otro lado las lectinas son una herramienta importante
para la investigación estructural y funcional de carbohidratos complejos, para la evaluación
de cambios que ocurren en la superficie celular durante los procesos fisiológicos y
patológicos y para la identificación de células de cáncer y se ha demostrado que las lectinas
poseen propiedades citostáticas y citotóxicas en contra de células tumorales y ciertas lectinas
reaccionan con ciertas células transformadas malignas, pero no con aquellas normales
(García, 2002).
Las semillas de las plantas, en especial del frijol tépari, son ricas en lectinas (Scheerens y col,
1983) y estudios previos han demostrado que las lectinas de diferentes fuentes y a diferentes
concentraciones inhiben el crecimiento de células cancerígenas e inducen apoptosis. Razón
por la cual el objetivo del trabajo es obtener una fracción pura de la lectina y determinar su
actividad aglutinante para estudios posteriores de proliferación y sobrevivencia de células
cancerígenas.
1
MATERIALES Y MÉTODOS.
Se maceró el frijol tépari y la harina obtenida se disolvió en agua desionizada y se mantuvo en
agitación magnética por 12 hrs. después se centrifugó a 14, 000 rpm. durante 30 min. y al
sobrenadante se le agregó sulfato de amonio para precipitar la proteína. Se volvió a
centrifugar a la misma velocidad y tiempo y ahora se tomó el precipitado y se redisolvió con
la menor cantidad de agua desionizada posible para después someterlo a una dialización. Se
obtuvo una cantidad de 8 ml. que se llevaron a un concentrador de muestra por medio de gas
helio a presión, en donde se obtuvieron 4 ml. mismos que se llevaron a una columna de
exclusión molecular de Sephadex G75, las fracciones colectadas se leyeron en un
espectrofotómetro para detectar las proteínas y se determinó su actividad hemaglutinante
sobre eritrocitos de conejo en placas de Elisa de 96 pozos. Calculando la Actividad específica
se seleccionaron las fracciones que presentaron mayor actividad y se juntaron para ingresarlas
a una cromatografía de intercambio iónico. Para ésta técnica se empleó un equipo colector de
fracciones ECONO SYSTEM de Biorad ingresando 1 mg/ml de muestra y se establecieron
diferentes tiempos y concentraciones del gradiente. Se leyeron las fracciones y se determinó
su actividad específica para finalmente observar el grado de pureza en un gel de
poliacrilamida.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
De la exclusión molecular G75 se ingresó una muestra A a la columna de intercambio iónico
estableciendo un tiempo de 126 min. y un gradiente de NaCl de 0 a 0.5 M de Tris pH 8 en
fracciones de 2ml a velocidad de 1ml/min y posteriormente se ingresó una muestra B con un
tiempo de140 min, se leyó la cantidad de proteína a 280 nm y se determinó su actividad
aglutinante(Figura 1). Las dos muestras presentaron una buena separación de las fracciones
con actividad del resto de proteínas que no la tenía.
FIGURA 1. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA Y ACTIVIDAD ESPECÍFICA
MUESTRAS A Y B.
1400
3.5
1200
3
1000
2.5
800
2
600
1.5
400
1
200
0.5
0
0
1
6
11 16 21 2 31 3 41 4
51 56 61 6
2.5
4
Abs 280 nm
Muestra A
1600
Proteína (Abs 280 nm)
Actividad Específica ( U/mg)
4.5
3500
Muestra B
3000
2500
2
2000
1.5
1500
1
1000
0.5
Actividad U/mg
3
1800
500
0
0
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61
Fracciones
Fracciones
Nota: El color morado representa las proteínas detectadas a 280 nm y el color amarillo sólo
las que tienen actividad aglutinante. La línea punteada es el gradiente de NaCl. Se puede
observar que la muestra B tiene una mejor separación de la lectina del resto de las proteínas
que no tienen actividad aglutinante.
2
Se obtuvo otra muestra de G75 marcada como C y se ingresó a la cromatografía de
intercambio iónico pero modificando nuevamente las condiciones de tiempo y gradiente,
estableciéndose 170 min. comenzando con el gradiente a los 140 min. y colectando fracciones
de 2ml a velocidad de 1 ml/min. de la gráfica obtenida se pudo observar una mejorable
separación de las fracciones que presentaban actividad aglutinante del resto de las proteína
que ahora se leyó a 220 nm porque a ésta longitud se detectaban todas las proteínas de la
muestra. Para comprobar la pureza de la muestra C se corrió un gel de poliacrilamida con las
tres muestras A, B y C (Figura 2) ingresando las mismas cantidades para las muestras y se
apreció una parcial purificación de la lectina de la muestra C.
FIGURA 2. DETERMINACION DE PROTEÍNA Y ACTIVIDAD DE LAS MUESTRA C Y
OBSERVACIÓN DE LA PUREZA EN GEL DE POLIACRILAMIDA.
3.5
Muestra C
1800
Absorbancia a 220 nm
1400
2.5
1200
2
1000
800
1.5
600
1
400
0.5
200
0
Actividad Específica U/mg
1600
3
Lectina
0
1
6 11 16 21 2 31 3 41 4 51 56 61 6 71 76 81
Fracciones
Nota: La gráfica de la muestra C presenta la determinación de las proteínas a 220 nm en color
morado y en color amarillo las proteínas con actividad aglutinante. El gradiente de NaCl se
presenta en línea punteada. El gel de poliacrilamida permite ver el grado de pureza de la
lectina de la muestra C en donde se aprecia una banda definida en comparación con el resto de
las muestra A y B que tienen otras bandas que representan proteínas sin actividad aglutinante.
Para observar la pérdida de la actividad de las fracciones colectadas de exclusión molecular
G75 se midió su actividad específica antes de ingresar las muestras A, B y C a la
cromatografía de intercambio iónico y se determinó una actividad de 5020 U/mg de proteína.
Después de ser ingresadas las muestras a intercambio iónico se cuantificó la proteína total
utilizando un lector múltiple de placas, se obtuvo que la muestra A contenía 833.4022 g/ml
de proteína y la fracción con mayor actividad específica era de 1606.27 U/mg. En total la
muestra A presentaba una actividad específica de 4743 U/mg. Para la muestra B su proteína
total era de 788 g/ml y su fracción con mayor actividad específica era de 1606.27 U/mg,
dando una actividad específica total de 3900 U/mg de proteína. En contraste con las muestras
A y B, la fracción con mayor actividad de la muestra C era de 1606.27 U/mg de proteína y la
actividad específica total de las fracciones para esta muestra fue de 3422.668 U/ mg. Pero al
leer la cantidad total de proteína en el multilector de placas se observó una pequeña cantidad
de 176.1241 g/ml, lo cual sugiere que la lectina se encuentra parcialmente pura y mantiene
una buena actividad específica con sólo un 30% de pérdida.
3
CONCLUSIONES.
La purificación parcial de la lectina se obtuvo en cromatografía de intercambio iónico con las
condiciones de un gradiente de NaCl de 0 a 0.4 M de Tris pH 8 al minuto 140 en un tiempo
total de corrida de 170 min. a velocidad de 1 ml/min. en fracciones de 2 ml. La lectina
detectada en la banda del gel de electroforesis tiene un peso molecular de 34 Kilodaltones
obtenido en base a cálculos de los marcadores de bajo peso molecular que se colocaron en las
orillas.
La actividad total que presentó la lectina parcialmente pura tiene una pérdida del 30% de
actividad, comparada con la muestra sin ingresar a intercambio iónico, debido a que no se
colectaron las fracciones de muy baja actividad específica y con alta medición de absorbancia
para mantener la fracción de lectina lo más pura posible.
Mediante la obtención de la lectina parcialmente pura se podrán hacer estudios sobre sus
efectos citostáticos y citotóxicos sobre células tumorales y tener así una herramienta
importante en la investigación estructural y funcional de carbohidratos complejos observando
sus cambios en procesos fisiológicos y patológicos en la superficie celular.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
García-Gasca, M.T. de J. “Efectos Biológicos de una Fracción Proteínica de Frijol Tépari con
actividad Antiproteolítica y Citoaglutinante Sobre Fibroblastos Murinos Transformados.”
Tesis doctoral, Fac. Química, Posgrado en Alimentos del Centro de la República (PROPAC).
Santiago de Querétaro, Qro. 1-3 pp. 2002.
Rea, R.L., Thompson, L.U., David, J.A. y Jenkins, D.M. “Lectins in foods and their relation
to search digestibility”, Nutr. Res. 5: 919 – 929. 1985.
Scheerens, J.C., Tinsley, A.M., Abbas, I.R., Weber, C.W. y Berry, J.W. “The nutritional
significance of tepary bean consumption”, Desert Plants 5: 11. 1983.
Sharon, N. y Lis, H. “Lectins: cell-agglutinating and sugar-specific proteins”, Science 177,
949 – 959. 1972.
Thomas, C.V. y Waines, J.G. “ Fertile backcross and allotetraploid plant from crosses
between tepary beans and common beans”, J. Hered. 75: 93 – 98. 1984.
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