EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS. 1.- INTRODUCCIÓN En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalación - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfáticos. - Abrir el tórax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener células viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS - Etanol 70% - Eter dietílico anestésico - Tampón PBS pH 7.2 - Suero fisiológico 5.- MÉTODO A.- Inyección intraperitoneal. 1.- Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.5 ml de suero fisiológico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada. 2.- Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras. 3.- Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca. 4.- Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano. 5.- Lavar el abdomen con etanol y dejar secar. 6.- Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo. 7.- Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la línea media. 8.- Inyectar con presión moderada. B.- Inyección subcutánea. 1.- Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire. 2.- Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante. 3.- Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar. 4.- Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 5.- Inyectar con presión moderada. C.- Anestesiado por inhalación. 1.- Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter dietílico (Evitar su inhalación directa. Muy inflamable). Tapar y dejar evaporar dos minutos. 2.- Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado. Servirá para suplementar anestesia si se requiere más tarde. 3.- Introducir al animal en el recipiente y tapar. 4.- Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular, puede extraerse. 5.- Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes, puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en éter. D.- Extracción de sangre del plexo axilar. 1.- Anestesiar al ratón. 2.- Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata. 3.- Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar. 4.- Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos. 5.- Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo. 6.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf. E.- Extracción de sangre por punción intracardiaca. 1.- Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina. 2.- Colocar al animal tumbado de espaldas. 3.- Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del animal) con una inclinación de 15-20 grados. 4.- Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo. 5.- La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima cantidad posible de sangre. 6.- Depositar la sangre en un tubo, quitando previamente la aguja para evitar hemólisis. 7.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf. F.- Extracción de órganos linfoides (bazo, timo y ganglios) 1.- Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas, cruzando la nuca, tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca. 2.- Colocarlo de espaldas sobre un papel secante. 3.- Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. 4.- Cortar por la línea media con tijeras. 5.- Retirara la piel con los dedos. Bazo: 6.- Girar al animal para exponer su flanco izquierdo. 7.- Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras. 8.- Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo. 9.- Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS. Ganglios: 10.- Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. 11.- Extraer, depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo. Añadir 1ml de PBS. Timo: 12.- Tumbar al ratón de espaldas. 13.- Abrir el tórax mediante una incisión, con tijeras, desde el xifoides hasta el cuello. 14.- Abrir las costillas con las pinzas. 15.- Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS. G.- Disgregación de tejidos linfoides (bazo, ganglios, timo). 1.- Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha añadido PBS estéril. 2.- Limpiar de tejido graso y conectivo. 3.- Pinchar repetidas veces con una aguja. 4.- Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla. 5.- Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo. 6.- Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula. 7.- Cuando todo el líquido esté en el tubo, dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio. 8.- Centrifugar a 400xg 5 minutos, decantar y añadir 1ml de medio de cultivo.