Bromatología 2015 ANALISIS DE MACROCOMPONENTES Temario Toma, preparación y conservación de muestras. Determinación de hidratos de carbono, proteínas, lípidos, agua y componentes minoritarios. Métodos físicos, químicos y biológicos aplicados a alimentos. Fundamentos. Criterios para la selección. Controles. Interferencias. Cálculos. Interpretación de resultados. Preguntas 1. a) ¿Qué tipo de hidratos de carbono determina mediante los métodos de FehlingCausse-Bonnans (FCB) y Somogyi-Nelson? b) Justifique porqué ambos métodos no son estequiométricos y cómo los utiliza para determinar cuantitativamente los hidratos de carbono de una muestra. 2. Describa el fundamento del método de Antrona. Indique qué azúcares cuantifica. 3. ¿Qué es fibra cruda y qué es fibra dietética? 4. ¿Cómo se determina el factor de conversión de N a proteína, en el método de Kjeldahl? Elija la opción correcta y justifique: “La estimación del factor de conversión % N a % proteína en un vegetal podría realizarse por...” i) Dosaje de aminoácidos básicos. ii) Determinaciones de N por el método de Kjeldahl de diluciones de una albúmina patrón. iii) Cuantificación de cada aminoácido en el hidrolizado de proteína vegetal por capa fina o HPLC. iv) Determinación espectrofotométrica del contenido de aminoácidos totales de esta proteína. 5. a) ¿Cómo procedería para determinar proteínas por el método de Biuret? b) ¿En qué casos y por qué elegiría determinar proteínas por un método extractivo y en cuáles por uno no extractivo? 6. a) ¿Qué componentes se cuantifican en la determinación de lípidos? ¿Cómo se expresan los resultados? b) ¿Qué características debe presentar la muestra en la determinación de lípidos por Soxhlet? ¿Por qué? c) ¿Por qué se debe hacer un tratamiento especial para determinar lípidos en lácteos? 7. a) ¿Qué tipo de agua se cuantifica en la determinación de humedad por el método indirecto? b) ¿Cómo se determina humedad en muestras con alto contenido de azúcares? c) ¿Cuál es el procedimiento a seguir en alimentos pastosos? d) ¿Qué características debe reunir el solvente utilizado en la determinación de humedad por el método directo? e) ¿En qué casos es conveniente utilizar el método directo para la determinación de humedad? 8. a) ¿Qué son las cenizas? ¿A qué temperatura se realiza su determinación? ¿Por qué? b) ¿Qué componentes se determinan en el ensayo de cenizas solubles en ácido? c) ¿Qué componentes se determinan en el ensayo de alcalinidad de cenizas? d) ¿A qué temperatura se realiza la determinación de cenizas en cereales? ¿Para qué se utiliza este ensayo? Problemas Análisis de glúcidos 1. Se determinó el contenido de hidratos de carbono en las siguientes muestras: a) Glucosa líquida (jarabe de glucosa): se solubilizaron 0,5863 g de muestra en 100 ml de agua destilada, se homogeneizó y se filtró sobre papel. Se realizó la determinación de azúcares mediante Fehling-Causse-Bonnans (FCB), gastándose 5,2 ml del filtrado para Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 1 Bromatología 2015 titular 10 ml de reactivo, mientras que el volumen medio gastado del patrón de glucosa 0,5% (p/v) fue de 5,0 ml. ¿Cuál es la concentración de glucosa que posee el jarabe? b) Leche entera: se pesaron 11,70 g de muestra, se disolvieron en agua, se agregaron subacetato de plomo 30%p/v y Na2SO4 30%p/v, se llevó a volumen (100 ml) y se filtró sobre papel. Se determinaron azúcares mediante FCB, gastándose 5,1 ml de esta solución para titular 10 ml de reactivo, mientras que el volumen medio gastado del patrón de lactosa 0,5% (p/v) fue de 5,6 ml. ¿Cuál es la concentración de lactosa que posee la leche? c) Almíbar: se tomaron 0,7894 g de almíbar, se disolvieron en agua, se agregó HCl (c) y se mantuvo en ebullición durante 30 min en baño María. Se enfrió, se neutralizó, se llevó a volumen (100 ml) y se filtró sobre papel. Para la titulación de 10 ml de reactivo de FCB se gastaron 5,2 ml de solución de azúcares y 5,5 ml de solución de glucosa patrón 0,5% (p/v). ¿Cuál es la concentración de sacarosa que posee el almíbar? d) Puré de papas deshidratado: se pesaron 2,7908 g de muestra y se realizó una hidrólisis ácida de 2 h a reflujo, se neutralizó y se llevó a un volumen de 500 ml con agua destilada. Para la titulación de 10 ml de reactivo de FCB se gastaron 5,6 ml de la solución de azúcares y 5,5 ml de solución de glucosa patrón 0,5% (p/v). ¿Cuál es la concentración de almidón que posee el puré de papas deshidratado? 2. Para determinar la composición de hidratos de carbono presentes una muestra de leche azucarada, se siguieron los siguientes protocolos: - Se pesaron 10,02 g de muestra, se disolvieron en agua, se agregaron subacetato de plomo 30%p/v y Na2SO4 30%p/v, se llevó a volumen (100 ml) y se filtró (solución A). Se realizó la determinación de azúcares mediante Fehling-Causse-Bonnans (FCB), gastándose 7,0 ml de solución A para titular 10 ml de reactivo, mientras que el volumen medio gastado del patrón de glucosa 0,5% (p/v) fue de 5,0 ml. - Se tomaron 50 ml de la solución A, se realizó una hidrólisis ácida de 30 minutos. Posteriormente la muestra se neutralizó, se llevó al volumen original (50 ml) y se diluyó 1/3. Se determinaron azúcares mediante FCB, gastándose 5,5 ml de esta solución para titular 10 ml de reactivo. ¿Qué azúcares espera encontrar en la muestra? Calcule la cantidad de cada uno. 3. Un laboratorio recibe una muestra de postre tipo casero (formulado en base a: leche, almidón de maíz y azúcar) para determinar su composición en hidratos de carbono. Se estima que el contenido de hidratos de carbono totales es 23%, de los cuales un 18% proviene de lactosa, un 41% proviene de sacarosa y un 41% proviene de almidón. Esquematice los pasos para determinar el contenido de cada glúcido por el método de FCB, indicando la cantidad de muestra a pesar y las diluciones correspondientes en cada caso. 4. Aplicaciones de polarimetría en hidratos de carbono a) ¿Cuál es la concentración de glucosa de una solución que dio un = 11,0° medido a 20°C? Datos: []20D= 52,50 ° ml/dm g; l = 2 dm. b) Una mezcla de glucosa y galactosa dio por el método de FCB una concentración de azúcares de 12,0g/100ml, y una lectura polarimétrica (P) a 20°C de 16,52. ¿Cuál es la concentración de cada azúcar? c) Se realizó una medida polarimétrica de una solución de glucosa y sacarosa antes y después de la hidrólisis con HCl, obteniendo los valores +13,80 y -0,21 respectivamente. ¿Cuál era la concentración de cada azúcar en la solución original? d) Se hicieron tres lecturas polarimétricas de una solución de glucosa, fructosa y sacarosa. La primera lectura se hizo directamente a 20°C (P1), la segunda se hizo a 20°C pero luego de una hidrólisis con HCl (P2), y la tercera se hizo a 87°C, también luego de una hidrólisis ácida (P3). Se obtuvieron los valores: P1= 4,53; P2= -5,98 y P3= 1,05. ¿Cuál era la concentración de cada azúcar en la muestra original? Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 2 Bromatología 2015 Datos: A 20°C: fructosa= -1,85 azúcar invertido= -0,40 glucosa= +1,05 sacarosa= +1,33 galactosa= +1,61 A 87°C: fructosa= -1,05 azúcar invertido= 0 glucosa= +1,05 5. Un laboratorio bromatológico recibe una mezcla para preparar postres que, según lo declarado por el fabricante, tendría: 20% de proteínas, 6% de lípidos, 12% de humedad, 2% de cenizas y 60% de hidratos de carbono. De los hidratos de carbono totales, el 30% sería sacarosa, el 8% glucosa y el 62% almidón. El laboratorio desea comprobar si los porcentajes de glucosa, sacarosa y glúcidos totales declarados por el fabricante son los reales. Para ello cuenta con matraces de 100 ml, reactivo de Fehling-Causse-Bonnans y todos los elementos necesarios para determinar azúcares por este método. Para titular 10 ml de reactivo de FCB se gastaron 4,5 ml de solución de glucosa 0,5% (p/v). a) Detalle los pasos a seguir para determinar hidratos de carbono totales, glucosa y sacarosa por este método. Fundamente cada paso. b) Calcule en cada caso qué cantidad de muestra debería pesar teniendo en cuenta los porcentajes declarados. c) Indique cómo realizaría los cálculos. d) ¿Cómo procedería si desea determinar el contenido de glucosa y sacarosa por polarimetría? Indique cómo prepararía la solución, los tratamientos que realizaría y qué valores de P esperaría encontrar. e) Fundamente el método de Somogyi-Nelson para determinar azúcares. ¿Es un método estequiométrico? Justifique. ¿Qué cantidad de muestra debe pesar para determinar azúcares reductores por el método de Somogyi-Nelson? Datos: Patrón de glucosa 1% p/v en ácido benzoico. Límites de detección: 50 a 500 g/ml. Ensayo: 2 ml de reactivo de cobre + 2 ml de solución problema. Poner en baño de agua en ebullición durante 10 min y agregar 1 ml de reactivo arsenomolibdato. Lectura de absorbancia a 520 nm. f) Sabiendo que los límites de detección del método de Antrona son de 25 a 500 g/ml, ¿podría utilizar la dilución realizada anteriormente para determinar azúcares por este método? Justifique. Análisis de proteínas 6. A un laboratorio de análisis de alimentos llegó un material vegetal en estado fresco (95,9% de agua) con el fin de ser analizado. Se tomó una muestra representativa y se dividió en tres partes; una se analizó inmediatamente, otra se secó a 60°C a presión inferior a la atmosférica y la tercera se liofilizó. La muestra secada en estufa a 60°C llegó a un contenido de agua de 59,4% y la liofilizada a 1%. Se determinó el contenido de proteínas en las tres muestras por los métodos de Kjeldahl y Bradford. - Al utilizar el método de Kjeldahl, se emplearon 10 g, 1 g y 0,4 g de muestra fresca, secada a 60°C y liofilizada, respectivamente. Durante la titulación se gastaron 28,6 ml, 29,0 ml y 29,1 ml de NaOH 0,1000 N respectivamente, y 50 ml en el blanco. Considere que en este tejido cada 100 g de proteína hay 17,5 g de nitrógeno. - Para medir el contenido de proteínas por el método de Bradford se obtuvieron extractos a partir de 10 g, 1 g y 0,4 g de muestra fresca, secada a 60°C y liofilizada; con 100 ml, 10 ml y 1 ml de buffer de extracción respectivamente. Las soluciones de extracción se diluyeron 1/2, 1/20 y 1/200 respectivamente para que entraran en el rango de sensibilidad del método. Las lecturas de DO595 fueron de 0,495 para el material fresco, 0,245 para el secado a 60°C y 0,499 para el liofilizado. Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 3 Bromatología 2015 Curva de calibración de Bradford realizada con albúmina patrón: g/ml 200 300 600 900 1000 DO595 0,139 0,250 0,500 0,820 0,833 ¿Qué conclusiones puede extraer del análisis de los contenidos de proteína determinados por ambos métodos? ¿Tiene influencia la técnica de secado en los datos obtenidos? Fundamente su respuesta con cálculos. 7. Una industria desea elaborar un alimento a base de leche concentrada. La leche se concentró mediante tratamiento térmico a 110°C. Se determinó la composición de la leche de partida, obteniéndose los siguientes resultados: 5% de hidratos de carbono; 2,8% de lípidos y 0,5% de cenizas. Para obtener el contenido de proteínas se procedió a analizar la leche de partida y la concentrada por dos métodos diferentes: Kjeldahl e interacción proteína-colorante. -Para determinar proteínas por Kjeldahl se pesaron 0,5 g y 2 g de las leches concentradas y de partida respectivamente; se procedió según la técnica y se recogió el destilado sobre ácido bórico. En la titulación se gastaron 14,3 ml y 13,1 ml de H2SO4 0,0500 N para las leches concentrada y de partida respectivamente y 0,3 ml de H2SO4 0,0500 N para el blanco. -El análisis de proteínas por el método de interacción proteína-colorante se realizó utilizando Amido Black, obteniéndose una concentración de proteínas de 2,8% para la leche y 10% para la leche concentrada. a) i) Calcule el contenido de proteínas en ambas muestras con los datos obtenidos por el método de Kjeldahl. ii) Calcule la composición de la leche condensada resultante. b) Indique el fundamento de la determinación de proteínas por el método de interacción proteína-colorante. c) Esquematice los pasos a seguir para determinar proteínas en leche por este método. Indique cómo realiza la curva de calibración y cómo procesa las muestras. Posee albúmina 40 mg/ml y los límites de detección del método son: 0,2 a 2 mg/ml. Considere que en el tubo de reacción se adicionan 500 µl de muestra y 1 ml de reactivo. d) ¿Cómo explicaría los resultados obtenidos con el método de interacción proteínacolorante? 8. Un laboratorio de una industria alimentaria está desarrollando un polvo para preparar torta en base a las siguientes formulaciones: Mezcla A: 67% de azúcar, 33% de clara de huevo deshidratada (5% agua). Mezcla B: 65% de azúcar, 35% de harina. Para preparar la torta se mezclan 120 g de la mezcla A con 330 ml de agua, se bate hasta formar una espuma y luego se mezcla con 350 g de la mezcla B y se hornea a 200C durante 35-40 minutos. Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 4 Bromatología 2015 La composición de las materias primas se detalla a continuación: Azúcar Harina clara de huevo clara de huevo deshidratada Composición porcentual de las materias primas Proteínas Glúcidos Lípidos Cenizas Agua -95 --5 12 72 1,5 0,05 14,45 10 0,5 0,03 0,5 88,97 ¿? ¿? ¿? ¿? 5 a) Calcule la composición del producto final sabiendo que pierde 15% de agua en la cocción. b) En la determinación de proteínas por el método de Kjeldahl se pesaron 2,5 g de torta. Determine volumen y normalidad del ácido sulfúrico a utilizar para recoger el destilado sabiendo que cuenta con bureta de 25 ml, NaOH 0,1000 N, H2SO4 concentrado, catalizador, indicador rojo de metilo-verde de bromocresol y material de vidrio necesario. c) Por otro lado se determinó el contenido de proteínas por el método de Lowry. Los límites de detección del método son 0,05 y 0,4 mg/ml en la muestra. Se utilizó una solución patrón de albúmina de concentración 1 mg/ml. En cada tubo se coloca 200 l de muestra, 1 ml de reactivo de Lowry y 100 l de reactivo de Folin-Ciocalteau. ¿Qué cantidad de muestra debe pesar para determinar proteínas por este método? ¿Cómo realiza la curva patrón? Especifique volúmenes y diluciones. Considere que la totalidad de las proteínas se disuelven en SDS 1% p/v. d) Describa los pasos a seguir para determinar el contenido de humedad de la torta. e) Describa los pasos a seguir para determinar lípidos en la torta. ¿Qué solventes utilizaría para la extracción? f) Describa cómo determinaría el contenido de cenizas en este producto (torta). 9. Diseñe un protocolo con el método elegido y cantidades a utilizar en la determinación de proteínas, lípidos, hidratos de carbono, agua y cenizas de los siguientes alimentos listados. En la tabla se presenta su composición porcentual. dulce de leche harina de trigo repollo leche en polvo jamón cocido Ingredientes Dulce de leche Leche Glucosa Azúcar Bicarbonato de sodio Esencia de vainilla Glúcidos totales 61,9 69,9 4,1 38 0,2 Proteínas 3,2 - Lípidos 9,0 0,6 0,2 29,1 14,4 Proteínas 8,1 14,0 2,3 25,8 20,3 Composición porcentual Glúcidos Lípidos Agua 4,5 3 89 100 95 5 - Cenizas 2,0 1,7 1,0 3,6 1,5 Agua 19 13,8 92,4 3,5 63,6 Formulación Cenizas 0,3 - 2 litros 300 g 700 g ½ cdita gotas Problemas Adicionales 10. En un laboratorio de control de calidad de una industria se está analizando la composición de “flan casero”. En la Tabla se muestra la composición parcial de los ingredientes utilizados así como la formulación: Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 5 Bromatología 2015 Ingredientes Proteínas Leche 3,2 Huevo (40 g) 14 Azúcar Esencia de vainilla - Composición porcentual Glúcidos Lípidos Agua 4,5 3 89 12 74 95 5 - Formulación Cenizas 0,3 - 1 litro 10 huevos 250 g gotas a) Sobre 14,1176 g de flan cocido se determinó el contenido de lípidos mediante el método de Ratzlaff. De una alícuota de 10 ml de fase etérea (Vtotal = 60 ml) se obtuvo una masa de 0,12 g. i) Calcule el porcentaje de lípidos del flan cocido y la cantidad de agua que se perdió en la cocción. ii) ¿Podría utilizar otro método (el método de Soxhlet) para determinar los lípidos del flan? Justifique b) Para cuantificar proteínas se realizaron determinaciones por varios métodos: - Se pesaron 0,48 g de flan cocido, se realizó la digestión con H2SO4 y luego se destiló recogiendo en H3BO3 4% p/v utilizando indicador de Mortimer. Se tituló con H2SO4 0,0250N gastándose 12,5 ml. Simultáneamente se realizó un blanco y se gastaron 0,3 ml. - por otro lado, se realizó la determinación de proteínas por el método de Amido Black obteniéndose un valor de 4,92% de proteínas en el flan cocido. - cuando se determinaron proteínas por el método de Bradford, el contenido proteico del flan cocido fue de 3,18%. i) Describa el fundamento de cada uno de los métodos aplicados. ii) Compare los resultados obtenidos mediante los diferentes métodos y justifique las diferencias obtenidas teniendo en cuenta los ingredientes y el proceso de elaboración del flan cocido. c) Para determinar la composición de hidratos de carbono presentes en el flan cocido se siguieron los siguientes protocolos: - Se pesaron 49,29 g de muestra, se disolvieron en agua, se agregó un agente clarificante y luego Na2SO4, se llevó a volumen (100 ml) y se filtró (solución A). Sobre el filtrado se realizó una lectura polarimétrica, obteniéndose una lectura a 20ºC de +11,61. - Se tomaron 50 ml de la solución A y se llevaron a 100 ml finales con agua destilada (solución B). Se realizó la determinación de azúcares mediante FCB, gastándose 5,8 ml de solución B para titular 10 ml de reactivo, mientras que el volumen medio gastado con el patrón de glucosa 0,5% (p/v) fue de 5,70 ml. i) Calcule la cantidad de cada azúcar presente en el flan cocido y la que esperaría según su formulación. Justifique adecuadamente las diferencias encontradas. ii) Si se reemplazara un cierto porcentaje del azúcar utilizado para la formulación del flan por jarabe de fructosa (95% de fructosa y 5% de humedad), ¿cómo esperaría que fuera el valor P de la lectura polarimétrica (mayor, menor o igual)? Justifique. iii) ¿Cómo procedería para poder determinar experimentalmente el porcentaje de jarabe agregado a la formulación? Si es necesario puede proponer nuevos protocolos o modificaciones a los anteriores. Datos: fructosa= -1,85 sacarosa= +1,33 azúcar invertido= -0,40 glucosa= +1,05 Facultad de Ciencias Exactas – UNLP fructosa a 87°C= -1,05 galactosa= +1,61 lactosa= +1,046 Area Bioquímica y Control de Alimentos 6 Bromatología 2015 11. Una panificadora elabora una torta y la remite al laboratorio solicitando el análisis de macrocomponentes del producto terminado. El peso de la torta es 1162 g y antes del horneado pesaba 1242 g. La composición porcentual de las materias primas se da en la siguiente Tabla. Composición (%) Proteínas Glúcidos Lípidos Harina Huevo (48 g/huevo) Leche Manteca Azúcar 11 14 4,3 - 75,9 4,9 95 1,1 12 3 83 - Agua Cenizas 11 74 87,3 17 5 1 0,5 - Formulación de la torta cruda 400 g 4 huevos ? 200 g ? a) Para determinar azúcares solubles se pesaron 3 g de torta cocida procesada, se adicionó agua destilada, acetato de plomo y luego Na2SO4, y finalmente se completaron 100 ml. Se filtró por papel (solución A). Se realizaron las siguientes determinaciones: i) Sobre la solución A se realizó el método de Somogyi-Nelson y se obtuvo una A520 de 0,468. La curva de calibración realizada con patrón de glucosa se indica en la Tabla. Glucosa (µg/ml) A520 nm 0 0,005 25 0,024 50 0,074 100 0,191 150 0,340 200 0,491 250 0,632 300 0,760 400 0,940 ii) Otra alícuota de la solución A (50 ml) fue sometida a hidrólisis ácida con HCl durante media hora a baño María, llevada a pH y volumen original, y luego se titularon 10 ml de reactivo FCB, gastándose 4 ml. El volumen promedio de glucosa patrón 0,5% (p/v) gastado con 10 ml del reactivo fue de 5,2 ml. I. II. Calcule los porcentajes de lactosa y de sacarosa que contiene la torta cocida. Justifique el agregado de acetato de plomo y Na2SO4 en el protocolo seguido. b) Para determinar azúcares totales en la torta se pesaron 5,11 g de muestra y se sometieron a hidrólisis con HCl a reflujo durante 60 minutos. Luego se llevó a pH, a volumen final de 500 ml con agua destilada y se filtró. Con este filtrado se titularon 10 ml reactivo de FCB, gastándose 9 ml. Considere el gasto con el patrón mencionado anteriormente Por otro lado se realizó la determinación de azúcares totales por el método de Antrona sobre el filtrado diluído 20 veces. La A620 obtenida fue 0,69 y corresponde a una concentración de glucosa de 259 µg/ml. I. II. Calcule el contenido de azúcares totales de la torta cocida. ¿Los resultados obtenidos por ambos métodos son similares? Si no es así, ¿a qué lo atribuye y cuál es el correcto? ¿Cuál es el fundamento de los métodos utilizados? Indique la finalidad de cada paso realizado. c) Complete la formulación indicando la cantidad de leche y de azúcar agregadas. d) Calcule la cantidad de muestra a pesar para determinar proteínas por método de Kjeldahl en la torta cocida, proponiendo los reactivos necesarios. Mencione detalladamente la/s función/es que desempeña cada reactivo en dicho método. e) Indique el método adecuado para determinar lípidos en la torta. Fundamente su respuesta. Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 7 Bromatología 2015 Bibliografía * Developments in Food Analysis Techniques. Vol 1 y 2. (Ed King, R.D.) Applied Science Publishers 1978 * Análisis Moderno de los Alimentos. Hart, F. L.; Fisher, H.L. Editorial Acribia 1971 * Methods in Food Analysis A.O.A.C. * Methods in Food Analysis A.A.C.C. * The Experimental Study of Food. Campbell, A.; Penfield, M.P.; Griswold, R.M. Constable 1980 * Análisis de los Alimentos, Fundamentos - Métodos - Aplicaciones. Matissek, R.; Schnepel, F-M.; Steiner, G. 2da edición, Ed. Acribia. 1992. Facultad de Ciencias Exactas – UNLP Area Bioquímica y Control de Alimentos 8