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Conceptos Básicos de Electroforesis Capilar
La Electroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas
que se basa en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un
determinado medio (solución tampón), como resultado de la acción de un campo
eléctrico. Al igual que otras técnicas de separación como la Cromatografía y
Espectrometría de Masas, es ampliamente utilizada en la actualidad en la industria
biotecnológica, biológica y bioquímica. Se utiliza en dos modalidades distintas:
Electroforesis Convencional en gel y Electroforesis Capilar (EC). En la primera, las
separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana (placa) de un gel
semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros, dando
origen a una imagen donde se visualizan las sustancias en forma de zonas teñidas
Error! Reference source not found.. La Electroforesis Capilar es una versión de la
técnica de Electroforesis en la que la separación se lleva a cabo dentro de un capilar
muy delgado y presenta mejoras sustanciales respecto a la electroforesis convencional
en gel, principalmente en cuanto a los pequeños volúmenes de sustancia necesaria para
el estudio y la rapidez con que se obtienen los resultados del análisis. La EC ha sido un
método muy útil para la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos
(DNA y RNA) con gran resolución y se usa frecuentemente en complemento con otras
técnicas de separación tales como Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) y
espectrometría de masas.
Una de las ventajas de la EC sobre otras técnicas de separación es que requiere de una
instrumentación relativamente simple: una fuente de alto voltaje, un capilar cuyos
extremos se encuentran sumergidos, junto con dos electrodos, en dos viales que
contienen una solución amortiguadora, un detector y un sistema de adquisición de datos,
tal como se ilustra en la Figura 1.
Sistema de adquisición y
procesamiento de datos
Detector
Sentido de Migración
Capilar
+
Fuente de
Tensión
Electroferograma
Figura 1. Esquema de un sistema de Electroforesis Capilar.
La fuente de voltaje normalmente es capaz de proporcionar de 10-30 kV. El capilar
posee una longitud entre 50 cm y 1m y posee un diámetro interno muy reducido (menor
a 100 m), que facilita la disipación del calor generado por la resistencia eléctrica del
electrolito dentro del capilar. Los extremos del capilar están colocados en dos
recipientes que contienen una solución del electrolito, el mismo con el que se ha llenado
el capilar. Los volúmenes de muestra a analizar son extraordinariamente pequeños (de
0,1 a 10 nl).
Los equipos de Electroforesis Multicapilar Error! Reference source not found.
poseen la capacidad de llevar a cabo el proceso de electroforesis en varios capilares
simultáneamente, permitiendo el análisis de mayor cantidad de muestras en el tiempo y
por ende la generación de grandes volúmenes de datos.
Existen varios tipos de Electroforesis Capilar, sin embargo este trabajo se concentrará
en la Electroforesis Capilar en Zonas debido a que el equipo que origina los datos
analizados en este trabajo es de este tipo.
La Electroforesis Capilar en Zonas está basada en la separación de los analitos según
la relación carga/tamaño. En esta técnica la composición del tampón es constante
manteniendo su fuerza iónica y pH en todo el capilar y durante todo el tiempo que dura
la separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la
mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan
estar
completamente
resueltas
o
parcialmente
traslapadas. Entre
las zonas
completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. La inyección de la
muestra al capilar se puede llevar a cabo por gradiente de voltaje (electrocinética) o
gradiente de presión (hidrodinámica o hidrostática) entre los dos extremos del capilar.
La detección se realiza, por lo general, directamente sobre el capilar (celda de
detección). El tipo de detector escogido depende de los analitos a determinar, y se
escoge aquel que proporcione una sensibilidad elevada para todos los compuestos. La
detección directa e indirecta ultravioleta-visible (UV-Vis) es uno de los más usados en
EC, aunque también es utilizado el método de Fluorescencia, el cual es más selectivo y
sensible. Este método generalmente se combina con el uso de un Láser (fluorescencia
inducida por LASER) para la detección de sustancias trazas Error! Reference source
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found.. Se utiliza un láser de moderada intensidad, junto con la capacidad de enfocar un
pequeño punto de luz en el interior del capilar. En este procedimiento se realiza una
preparación previa de la muestra para marcar las sustancias a medir con una sustancia
fluorescente. La principal dificultad es la alineación de los componentes ópticos de
manera tal que la excitación emisión sean óptimas. En el sistema colineal, la misma
línea óptica es utilizada para enfocar el haz del Láser y para colectar la fluorescencia
emitida Error! Reference source not found.. Los datos analizados en esta
investigación fueron obtenidos con un equipo que utiliza este método de detección.
Existen dos fenómenos que intervienen en la migración de las moléculas en
Electroforesis Capilar: el flujo electroosmótico y el flujo electroforético.
El flujo Electroosmótico se traduce en el desplazamiento, por el capilar y bajo la
influencia de un campo eléctrico, de la solución tampón en conjunto con las moléculas
de soluto cargadas. Este fenómeno se debe a que la pared interna del capilar se carga
negativamente y con las cargas positivas atraídas se conforma una doble capa de cargas.
La capa interna (+) se moviliza hacia el cátodo y como se encuentra solvatada con
moléculas de agua, arrastra toda la solución en ese sentido. Una característica única del
flujo electroosmótico es que presenta un perfil de distribución plano, el cual sólo se
desvía unos pocos nm de la pared, de forma que proporciona la misma velocidad a
todos los solutos, sea cual sea su posición en la columna.
El Flujo Electroforético es el movimiento de las moléculas de soluto cargadas hacia
los extremos correspondientes del capilar, los cationes (+) hacia el cátodo (-) y los
aniones (-) hacia el ánodo (+). Estas fuerzas eléctricas producen aceleraciones de los
analitos que son contrarestadas por la fuerza de fricción debido a la viscosidad de la
solución, ocasionando que casi instantáneamente las moléculas adquieran una velocidad
constante. La velocidad de los analitos esta influenciada por la viscosidad y ésta
depende completamente de la temperatura, por lo que el control de esta última variable
es muy importante en la obtención de una alta reproducibilidad Error! Reference
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La separación de los analitos se basa en las diferencias de las movilidades
electroforéticas de los solutos iónicos, que harán que los analitos migren a través del
capilar y lleguen al detector a tiempos diferentes.
La movilidad electroosmótica es normalmente superior a la movilidad electroforética de
los solutos iónicos inyectados, por lo que todas las moléculas (positivas, negativas y
neutras) se dirigen hacia el cátodo haciendo posible separar cationes y aniones en una
sola inyección de la muestra. Aunque los compuestos neutros migran hacia el cátodo no
pueden ser separados mediante Electroforesis capilar en zonas debido a que no muestran
movilidad electroforética
Los datos obtenidos en una corrida de Electroforesis Capilar se representan en un
Electroferograma que es una gráfica de intensidad (de emisión de UV, o fluorescencia)
en función del tiempo (en min). La duración de una corrida suele ser entre 9 y 45
minutos y tiene el aspecto que se observa en la Figura 1. Cada pico corresponde a una
sustancia en particular. La ubicación de una sustancia en el tiempo depende de la
relación carga/masa, las sustancias ionizadas positivamente (izquierda) son detectadas
por el sensor inicialmente y las sustancias negativas (derecha) posteriormente. La
concentración de una determinada sustancia se calcula utilizando la altura del pico
respectivo o el área bajo la curva. En un experimento es común realizar varias
mediciones obteniéndose varios electroferogramas para observar y medir las variaciones
de concentración de determinadas sustancias en diferentes condiciones, por lo que
generalmente existen patrones de picos, como el que se muestra en la Figura 2, que
pueden repetirse con cierto grado de similaridad en los electroferogramas producto de
un mismo experimento.
Figura 2. Patrón en varios Electroferogramas.
Actualmente, en el Laboratorio de Fisiología de la Conducta de la ULA, el
reconocimiento de patrones como los observados en la Figura 2, se realiza de manera
visual por parte del especialista. Observe, en la Figura 2, que la similaridad se ve
gravemente afectada por la poca reproducibilidad inherente a la EC y la variación
importante de una o varias sustancias (picos) en el patrón, por lo que el reconocimiento
de patrones en este tipo de señales es un problema en actual desarrollo y tema
fundamental de este trabajo. Note que los picos no miden exactamente lo mismo en
todos los electroferogramas, es decir, no son de la misma altura o no encierran la misma
área, no se encuentran ubicados en los mismos instantes de tiempo y no están separados
unos de otros por la misma diferencia temporal en los electroferogramas. Estas
características hacen que el proceso de reconocimiento de patrones sea más complicado
que en otros tipos de señales con menor variabilidad.