PRESENCIA DE LA SUBUNIDAD α2 DE LOS RECEPTORES A

PRESENCIA DE LA SUBUNIDAD 2 DE LOS RECEPTORES A GLICINA EN EL
CEREBELO DE LA RATA DURANTE LA ONTOGENIA
Urbina Bárcenas V.E.*; González Morales X.*; Berumen Segura L*.; García Alcocer G.*
*Facultad de Química / Universidad Autónoma de Querétaro
RESUMEN
El receptor a Gly (GlyR) es un canal iónico constituido por un pentámero de proteínas integrales
de membrana (1-4 y  que se encuentran asociadas a otra proteína periférica conocida como
gefirina. Los receptores a glicina se insertan a la membrana y tienen funciones excitatorias en
células inmaduras e inhibitorias en las maduras por lo que es importante precisar su distribución
durante el desarrollo del cerebelo de rata. En este trabajo se exploraron los cambios de la
subunidad 2 durante la ontogenia del cerebelo de rata por medio de inmunoblot. Los resultados
indicaron que la subunidad 2 presenta una distribución diferencial durante el desarrollo
postnatal del cerebelo de rata con una menor concentración en las neonatales y una máxima en
los cerebelos de ratas posnatal 15, dicha concentración disminuye en la estructura de los animales
adultos.
INTRODUCCIÓN
La glicina (Gly) es el principal neurotransmisor inhibitorio de la médula espinal y el tronco
encefálico, junto con el ácido -amino butírico (GABA) participan en la comunicación neuronal
del sistema nervioso central activando canales iónicos de Cl- regulados por ligando. La apertura
de los canales de Cl- modifican el potencial de membrana induciendo a las neuronas a
hiperpolarizarse lo que induce a un mayor requerimiento de la permeabilidad de iones sodio para
despolarizar la membrana, por tanto la Gly ocasiona una respuesta postsináptica inhibitoria. El
receptor de Gly (GlyR) es pentámero de proteínas integrales de membrana (1-4 y  que se
encuentran asociadas a otra proteína periférica conocida como gefirina.
La localización, densidad y composición de las subunidades de algunos neurotransmisores
cambian durante el desarrollo, por ejemplo la subunidad 2 es visible mediante hibridación in
situ en el cerebro medio en el día 14 de gestación (E14) mientras que después de E19 no es
encontrada (Malosio, et al, 1991), así mismo los transcritos que codifican para los receptores a
glicina se modifican en la ontogenia (Carpenter y Miledi, 1988). En este trabajo se estudiaron los
cambios de la subunidad 2 en el cerebelo de rata durante la ontogenia utilizando la metodología
de Western Blot.
METODOLOGÍA
Se usaron ratas macho con 0 (P0), 7(P7), 9(P9), 15(P15) días de nacidas y ratas adultas (A). Las
ratas se sacrificaron por dislocación cervical, se les extrajo el encéfalo y se separó el cerebelo que
se colocó en buffer de extracción (50mM Tris base, pH 7.4), se le agregaron inhibidores de
proteasas, posteriormente se homogeneizaron las muestras y se dejaron en agitación durante dos
horas, pasadas las dos horas se centrifugaron las muestras a 1000 rpm y 4°C durante 20 minutos.
La determinación de proteínas se realizó por el método de Bradford en el sobrenadante, este dato
fue utilizado para colocar la misma concentración de proteínas en el gel de las muestras obtenidas
en las distintas edades.
Luego, las muestras eran corridas por electroforesis en gel de acrilamida al 12% con un espesor
de 1 mm y voltaje constante de 150V, terminada la electroforesis se procedía a colocar el gel y la
membrana de nitrocelulosa marca BioRad en el buffer de transferencia (Tris, Glicina, Metanol)
con el fin de inmovilizar las proteínas; posteriormente se realizó la transferencia de proteínas, del
gel hacia la membrana, a corriente constante de 200mA durante 1 hora, terminada la transferencia
la membrana se lavó con PBT y se bloqueó con leche al 3% y posteriormente se incubó con
anticuerpo primario GlyR- a2(H-50), por mínimo dos horas, terminado el tiempo se lavó la
membrana y se incubó con el anticuerpo secundario GAR-HRP, por otras dos horas,
posteriormente la membrana se lavó nuevamente y se sumergió en un agente luminiscente
(Western Blotting Detection Agente), después eran expuestas a una película fotográfica (Kodak
Biomax Light film).
Se realizó una prueba para conocer el efecto de la concentración de las muestras en una
electroforesis, para ello se colocaron, en los pozos del gel, diluciones 1:2 y 1:4 del sobrenadante
concentrado.
RESULTADOS
Grafico 1. Curva de calibración obtenida para la determinación de proteínas
en las muestras de cerebelo por el método de Bradford
Y=A+Bx
Parámetro
A=
B=
Valor
0,44927
0,02955
R=
0,99678
Error
0,00211
1,86E-04
Tabla 1. Parámetros de la regresión lineal aplicada a la curva de calibración
para determinación de proteínas por el método Bradford.
Gráfico 2. Concentración de proteínas en el cerebelo de rata a diferentes
edades, obtenidas por el método Bradford (expresada en g/l)
Diluciones del homogeneizado de cerebelo de rata
1:2
1:4
39.68 kDa
Figura 1. Efecto de la concentración de proteínas en una electroforesis, como
se puede observar mientras menos diluida esté la muestra más marcadas son las
líneas.
P0
P7
P9
P12
P15
A
39.68 kDa
Figura 2.
desarrollo
proteínas
incrementó
Inmunoblot para la subunidad a2 del receptor a glicina durante el
del cerebelo de rata. La figura indica que la menor cantidad de
para este receptor se localizó en las ratas neonatales y se
conforme avanza la etapa postnatal.
CONCLUSIONES
1) La técnica de “Western Blot” es útil para la detección de la subunidad 2 de los
receptores a glicina en cerebelos de rata en diversas etapas del desarrollo postnatal.
2) La menor expresión de la subnidad 2 fue encontrada en cerebelos de ratas neonatales.
3) En cerebelos de ratas posnatal 15 se encontró la mayor expresión de la subunidad 2.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alberts B., (1999). Introducción a la Biología Celular, Ediciones Omega, Barcelona..
Carpenter M.K. (1988) “Expression of GABA and glycine receptors by messenger RNAs from
the developing rat cerebral cortex. Proc R. Soc. London Proc R. Soc. London Ser B 234, 159-170
Garcia A. G. (2001) “Characteristics of glycine receptors expressed by embryonic rat brain
mRNAs”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, Issue 5, 2781-2785.
Lenhinger. (1994) “Bioquímica”, 2ª ed, Omega, Barcelona,
Lodish H., (2002) “Biología Celular y Molecular”, 4a ed., Panamericana, Madrid,
Malosio ML, Marquesa-Pouey B, Kuhse J, Betz H. (1991) Embo J. 10 (9) 2401-9.