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TRANSPORTE DE CORTISOL A TRAVÉS DE UN MODELO IN VITRO DE LA BARRERA
HEMATOENCEFÁLICA.
C. Navarro1, I. Gonzalez-Alvarez2, V. Merino1, M. Manku3, VG. Casabó1,
M. Bermejo2
1
Departmento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Valencia, España
2
Depto. de Ingeniería. Área Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Universidad Miguel Hernández, Elche.
3
Laxdale Limited, Reino Unido.
Introducción: El transporte a través de la
barrera hematoencefálica es un factor relevante
en la acción farmacológica de muchas
sustancias endógenas y fármacos, cuyo sitio de
acción está localizado en el cerebro. Algunos
transportadores de secreción, como la
glicoproteína-P,
pueden
afectar
a
la
permeabilidad a través de dicha barrera de estas
sustancias,
incluyendo
las
hormonas
esteroideas. Parece ser que una hiperactividad
de la glicoproteína-P está relacionada con la
resistencia de la supresión del eje hipotalámicopituitario-adrenal por glucocorticoides. Esta
resistencia a los glucocorticoides es una de las
anomalías biológicas mejor descritas en ciertos
tipos de depresión. Algunos ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) han mostrado eficacia
clínica en este grupo de pacientes así como una
reducción de la actividad del eje adrenal en
modelos animales. Algunos modelos en cultivos
celulares, como las células MDCK y MDCKMDR1, reproducen ciertas propiedades de la
barrera hematoencefálica, como marcadores
celulares
morfológicos,
enzimáticos
o
antigénicos, que también se encuentran en
células endoteliales cerebrales y han sido
ampliamente descritos como un modelo
adecuado para esta barrera. La propuesta de este
estudio fue evaluar la influencia de un ácido
graso
poli-insaturado,
el
ácido
eicosapentaenoico (EPA) en el transporte del
cortisol a través de la barrera hematoencefálica
mediante estudios in vitro en el modelo celular
descrito así como
desarrollar un modelo
matemático general para estimar los parámetros
cinéticos relacionados con la permeabilidad del
cortisol.
Materiales y Métodos: Ambas líneas celulares
fueron sembradas y crecidas en forma de
monocapas celulares en membranas de
policarbonato, hasta su confluencia durante 7-9
días. La integridad de la monocapa se evaluó
midiendo la resistencia eléctrica transepitelial
antes y después del experimento. Una vez se
administró el fármaco, se tomaron cuatro
muestras durante 90 minutos, y posteriormente
se analizaron mediante CLAR. Los estudios de
transporte se realizaron en ambas direcciones:
desde la cámara apical hacia la basolateral y
desde la cámara basolateral hacia la apical. Las
concentraciones iniciales de cortisol fueron 2,
20, 200 y 2000 uM, mientras que las de EPA
fueron 10, 20, 50 y 200 uM siendo la
concentración de cortisol 20 uM en presencia de
todas las concentraciones de EPA.
Resultados y Discusión: Los experimentos in
vitro mostraron diferencias significativas entre
las permeabilidades A-B y B-A de cortisol
(p<0.05) así como un proceso de permeabilidad
dependiente de la concentración (Figura 1).
Figura 1. Valores de permeabilidad de cortisol
a las diferentes concentraciones estudiadas en
ambas líneas celulares, (a) MDCK y (b)
MDCK-MDR1.
El mejor modelo cinético corresponde a un
modelo de tres compartimentos (apical, celular
y basal) con un transportador de secreción
situado en la cara apical de la membrana y cuyo
punto de unión se encuentra en la parte exterior
de la membrana. Dado que las células MDCKMDR1 son un clon transfectado de las células
MDCK donde la glicoproteína-P está
sobreexpresada, se consideró que cada una de
las líneas celulares tendría un valor diferente en
la velocidad máxima del transportador mientras
que el resto de parámetros se mantuvieron
comunes. Los parámetros correspondientes a
este modelo se muestras en la tabla 1.
Parámetros
Valores (CV %)
MDCK
MDCK-MDR1
Vol. celular
4.00·10-1 (17.78)
(mL)
PAC (cm/s)
1.06·10-4 (9.36)
PCB (cm/s)
1.38·10-3 (46.09)
6.21·10-4
3.40·10-3
Vm
2
(nmol/s·cm ) (39.77)
(19.97)
Km (µM)
1.61·10+1 (37.52)
Tabla 1: Parámetros cinéticos in vitro obtenidos
en las líneas celulares MDCK y MDCK-MDR1.
Por otra parte, los experimentos en presencia de
EPA mostraron diferencias significativas en los
valores de permeabilidad a las concentraciones
más altas de EPA (p<0.05) pero sólo en la línea
celular MDCK, no viéndose afectados los
valores de permeabilidad en las células MDCKMDR1 (Tablas 2 y 3).
Pab
0
10
20
50
10
NS
-
-
-
20
NS
NS
-
-
50
S
NS
S
-
200
S
S
S
NS
Pba
0
10
20
50
10
NS
-
-
-
20
NS
NS
-
-
50
S
NS
NS
-
S
S
S
S
200
Tabla 2: Resultado de la comparación múltiple
de las permeabilidades apical-basal y basalapical para las distintas concentraciones de EPA
ensayadas en la línea celular MDCK.
Pab
0
10
20
50
10
NS
-
-
-
20
NS
NS
-
-
50
NS
NS
NS
-
200
NS
NS
NS
NS
Pba
0
10
20
50
10
NS
-
-
-
20
NS
NS
-
-
50
NS
NS
NS
-
NS
NS
NS
NS
200
Tabla 3: Resultado de la comparación múltiple
de las permeabilidades apical-basal y basalapical para las distintas concentraciones de EPA
ensayadas en la línea celular MDCK-MDR1.
El cortisol es transportado activamente por la
glicoproteína-P en ambas líneas celulares, pero
el transportador sólo muestra saturación a las
concentraciones ensayadas en MDCK. El ácido
graso EPA actúa como inhibidor de la secreción
a través de la glicoproteína-P en la línea celular
MDCK, mientras que en la línea celular
transfectada, la concentración de EPA no es
suficientemente alta para mostrar algún efecto.
Esto significa que la secreción a través de la
glicoproteína-P podría ser el factor dominante
para el transporte de cortisol a través de la
barrera hemaoencefálica, puesto que las
concentraciones fisiológicas de cortisol se
encuentran en el ámbito más bajo de las
concentraciones ensayadas en este estudio.
Referencias:
(1) Veronesi B. Characterization of the MDCK
cell line for screening neurotoxicants.
Neurotoxicology.1996;17(2):433-43.
(2) C.M. Pariante et al. Do antidepressants
regulate how cortisol affects the brain?
Psychoneuroendocrinology.
29:423-447
(2004).
Agradecimientos:
- MDCK and MDCK-MDR1 cells were
provided by Dr. Michael M. Gottesman, Chief,
Laboratory of Cell Biology, National Cancer
Institute.
-This work is supported by Biosim EU grant:
LSHB-CT-2004-005137