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Usos biotecnológicos de la metagenómica Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2011 La era de las -ómicas Maron et al. Microbial Ecology 53, 486-493 (2007) Objetivos de estudios metagenómicos (i) Identificar los diversos microorganismos que habitan en un ambiente dado (ii) Reconstruir los caminos metabólicos, para ayudar a predecir la función de microorganismos no cultivados (iii) Hallar nuevas enzimas y compuestos bioactivos La era de las -ómicas Simon & Daniel 2011 Appl. Environ. Microbiol 77, 1153-1161 Metagenómica: estructura y función de comunidades microbianas Metagenómica: estructura y función de comunidades microbianas Drenaje ácido de minas: ambiente extremo de baja diversidad pH ~ 0.5 Temp: 40°C exceso FeS2 La variación dentro de cada especie complica el ensamblado de los fragmentos de DNA Reconstrucción de genoma casi completo de Leptospirillum grupo II y Ferroplasma tipo II Otros 3 genomas parciales Metagenómica: estructura y función de comunidades microbianas + Inmensa cantidad de información sobre el potencial metabólico de microorganismos no cultivados - La capacidad de ensamblar los fragmentos de ADN disminuye drásticamente con la complejidad del ambiente muestreado Metagenómica: estructura y función de comunidades microbianas • Para investigar la función de miembros menos abundantes dela comunidad (“biosfera rara”) hace falta extender la profundidad de la secuenciación • La “biosfera rara” puede tener un papel significativo en algunas funciones que no serían capturados con estas estrategias Crecimiento utilizando un aceptor de electrones insoluble Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769 Expresión de flagelos y pili Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769 Quimiotaxis buffer quimiotaxis Fe(III) citrato MnCl2 Mn(IV) óxido FeSO4 Fe(III) óxido Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769 Lovley, Nature Microbiology Reviews 1, 35 (2003) Metagenómica como respuesta a la demanda de nuevos genes y sus productos La diversidad natural es la fuente principal de moléculas nuevas La explicación está en la vasta riqueza de suelos, océanos y otros nichos microbianos La metagenómica es una tecnología clave para acceder al potencial presente en los genomas de los microorganismos Permite la investigación de los genes individuales, el análisis de operones completos codificantes para vías biosintéticas o degradativas Metagenómica como respuesta a la demanda de tecnologías más limpias 1. Detergentes 2. Alimentos 3. Agricultura 4. Procesamiento textil 5. Industria del papel 6. Industria química Qué genes, qué productos? Screening metagenómico funcional de actividades hidrolíticas dominan actualmente la literatura Ranking multiparamétrico del biocatalizador Lorenz & Eck 2005 Nature Rev Microbiol 3, 510-516 Selección del ambiente • Ambientes naturalmente enriquecidos en el blanco (xilanasas en intestino de insectos No garantiza alta frecuencia de detección • Ambientes extremos Biocatalizadores estables en condiciones extremas • Ambientes altamente diversos (suelos) Mayor diversidad y mayor flexibilidad Libraries metagenómicas Identificación de genes de inetrés en libraries metagenómicas La probabilidad de identificar un cierto gen depende de: 1.El sistema vector-huésped 2.Tamaño del gen 3.La abundancia del gen en el metagenoma de origen 4.La eficiencia de expresión heteróloga Aislamiento de ADN 1. El DNA debe ser extraído de un amplio rango de microorganismos para que sea representativo de la comunidad original 2. Se requiere DNA de alto peso molecular 3. El DNA debe estar libre de sustancias contamnantesque interfieren con el procesamiento (restricción, ligación) • Métodos directos e indirectos • Pre-enriquecimiento Clonado La estrategia depende del objetivo Genes individuales vs operones completos y clusters que codifican para vías biosintéticas o degradativas? • plásmidos (<15 kb) • cósmidos o fósmidos (25–40kb) • BAC (100–200kb) Screening Screening El screening funcional es aplicable principalmente en biotecnología El screening por secuencia es más utilizado para la identificación de genes y elucidación de su papel dentro de comunidades microbianas complejas Libraries metagenómicas: screening funcional Necesidad de expresión en un sistema heterólogo Libraries metagenómicas: screening funcional La actividad enzimática se ensaya generalmente en agar suplementado con sustratos + high throughput - señales débiles Ejemplo: ensayo en medio conteniendo trioleilglicerol y rodamina La hidrólisis del sustrato causa formación de un halo naranja cuando se expone a UV Libraries metagenómicas: screening funcional Suenaga et al., 2007 Environmental Microbiology 9, 2289–2297 Libraries metagenómicas: screening funcional Una categoría diferente de screening funcional está basado en complementación heteróloga de cepas huéspedes o mutantes que requieren el gen blanco para crecer en condiciones selectivas. Ventajas: simple, rápida, no hay falsos positivos, altamente selectiva. Ejemplo: gen codificante para la DNA polimerasa por complementación de una mutante polA de E.coli. Simon et al., 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75, 29642968 Libraries metagenómicas: expresión en E. coli IND TRANSC DEP Señales de expresión funcionales en E coli en 32 genomas Gabor et al. 2004 Environ Microbiol 6: 879-886 Libraries metagenómicas: expresión en E. coli 40% de las actividades enzimáticas pueden ser recuperadas por clonado E. coli. Gabor et al. 2004 Environ Microbiol 6: 879-886 Cómo aumentar la diversidad biosintética de pequeñas moléculas antibact en R metallidurans Desarrollo de vector con amplio rango de huésped: • Agrobacterium tumefaciens • Burkholderia graminis • Caulobacter vibrioides • Escherichia coli • Pseudomonas putida • Ralstonia metallidurans antibact en E. coli antibact en R metallidurans Pigmento en P putida antibact en E. coli Pigmento en A tumefaciens Wrinkle en A tumefaciens Pigmento en R metallidurans Mínima superposición de clones Craig et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol. 76, 1633-1641 Libraries metagenómicas: expresión en E. coli Craig et al. 2011 Curr. Op. Biotechnol, 22:465–472 Screening de libraries metagenómicas: SIGEX Fusión de gfp sin promotor al DNA metagenómico Se basa en que los genes catabólicos están en operones cuya expresión en muchos casos es controlada por elementos regulatorios próximos a los genes catabólicos Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening de libraries metagenómicas: SIGEX 1. Construcción de library metagenómica 2. Eliminación de clones conteniendo plásmidos expresando gfp constitutivamente 3. Selección de clones expresando gfp en presencia del inductor 4. Aislamiento en agar de colonias separadas Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening de libraries metagenómicas: SIGEX • El clon tiene que contener suficiente porción del operón para ser útil en los subsiguientes estudios funcionales, pero no debe tener la porción terminal del operón que lleve una señal de terminación de la transcripción REDUNDANCIA EN LA LIBRARY • Requerimiento de la maquinaria regulatoria que reconoce el promotor y el sustrato deben estar presentes y ser funcionales en el huésped USO DE OTROS HUESPEDES • Hay genes que se activan por efectores que no son sustratos Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88–93 Screening de libraries metagenómicas: METREX Sistema que responde a diversas moléculas y se encuentra en organismos y ambientes diversos Moléculas que inducen quorum sensing Proceso de comunicación inter-celular mediado por pequeñas molécula que le permite a las bacterias sensar su propia densidad celular Regula muchas funciones ecológicamente relevantes, tales como luminescencia, virulencia y producción de antibióticos Screening de libraries metagenómicas: METREX El biosensor que detecta los clones activos está dentro de la misma célula que el DNA metagenómico Lynn et al. 2005 Appl. Environ. Microbiol 71, 6335-6344 El clon metagenómico BSS3 induce quorum sensing en la cepa biosensor JB525 TLC El plásmido BSS3 introducido en una cepa sin biosensor (A) induce la señal en células cercanas (B,C y D) 1. El plásmido es responsable del fenotipo del clon original 2. El compuesto responsable de la inducción es difusible en agar Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:3669–3676 Una monooxigenasa cataliza una vía de oxidación de indol que lleva a la produccción de un compuesto que induce QS Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:3669–3676 Screening de libraries metagenómicas: PIGEX Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035 Producción enzimática de benzoato medida como fluorescencia de GFP Los clones positivos para amidasa catalizan la conversión de benzamida a benzoato El benzoato activa el regulador transcripcional BenR, que activa el promotor benA se induce la expresión del gen reportero Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035 Screening de libraries metagenómicas: PIGEX 1. Capacidad de distinguir entre sustrato y producto 2. Ausencia de inductores endógenos 3. Los productos generados por la amidasa deben ser inertes in vivo para asegurar constante inducción del sensor 96,000 clones 11 amidasas, 3 nuevas Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 7029–7035 Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos caracterización del potencial biotecnológico de las enzimas encontradas Busqueda metagenómica de enzimas lipolíticas Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Esterasas: rango de sustratos Biofilm en cañería de agua potable suelo contaminado + pre-enriquecimiento Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Esterasas: estabilidad al pH y temperatura Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Celulasa: estabilidad frente a solventes 160 EstA3 140 % Actividad 120 100 80 60 40 20 0 ctrl 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% metanol DMSO DMF isopropanol acetonitrilo Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645 Celulasa: estabilidad frente a temperatura y pH Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36 Celulasa: estabilidad frente a solventes Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36 Celulasa: halotolerancia y termotolerancia 40°C 3M NaCl 3M RbCl 50°C 4M KCl 55°C 60°C Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36 Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos expresión de la proteína pura en cantidades suficientes a un costo razonable bulk: barata y eficiente Industria farmacéutica: tiempo de llegada al mercado Libraries metagenómicas: screening por secuencia Libraries metagenómicas: screening por secuencia La aplicación de estrategias basadas en secuencias implica el diseño de sondas de DNA o primers derivados de regiones conservadas de genes ya conocidos o familias de proteínas Un suelo supresivo contra enfermedades causadas por hongos patógenos como fuente de quitinasas Library metagenómica Extracción directa de suelo Metagenómica sintética Uso en industria química, agroquímica, precursores de síntesis de hidrocarburos MHT cloruro cloruro de metilo S-adenosil-L-metionina (SAM) (SAM) S-adenosil-L-metionina S-adenosil-L-homocisteína Screening de MHT en base de datos Construcción de library metagenómica sintética Screening en E coli Sólo un gen anotado como HMT Solo 55% anotados como MT Batis maritima 89 genes homólogos a MHT 61 bacterias 14 plantas 13 hongos 1 arquea Especificidad de sustrato Producción de MHT en levaduras Transferencia a S cerevisiae direccionado a vacuola Respuesta del huésped a la toxicidad del producto Producción de MHT en levaduras inhibición Crecimiento de S cerevisiae c/carboximetil celulosa Crecimiento de A fermentans en cocultivo Producción de MHT a partir de biomasa vegetal Co-cultivos inoculados a baja densidad, crecidos 36 h con el material (20 g/L) como única fuente de C. Se agregó ioduro de sodio y se midió la producción de CH3I por GC-MS Libraries metagenómicas: screening por secuencia Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos baja frecuencia de clones que son positivos en las bibliotecas metagenómica SIP-Metagenómica genes codificantes para la glicerol deshidratasa dependiente de coenzima B12 Frecuencia de detección: 2.1X - 3.8X mayor Schwartz et al. 2005 World J Microbiol Biotechnol 22, 363-368 SIP-Metagenómica Búsqueda de metano monooxigenasa: 2300 clones en BAC Mapa genético de ORFs identificados en el clon GSC357 (15.2 kb) Dumont et al. 2006 Environmental Microbiology (2006) 8, 1240–1250 SIP-Metagenómica Es una forma de caracterizar miembros ecológicamente relevantes de una comunidad, y sus funciones metabólicas, aunque no sean numéricamente dominantes Búsqueda de metano monooxigenasa: 250,000 clones en fósmidos Ricke et al. 2005 Appl. Environ Microbiol 71, 7472–7482 Búsqueda de bifenilo dioxigenasa: 1562 clones en cósmidos bphA: bifenilo dioxigenasa Sul et al. 2009 Appl. Environ Microbiol 75, 5501–5506 DNA-SIP/metagenómica Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos acceso a expertise en bioinformática (manejo de datos, ensamblado, etc) Pocas enzimas descubiertas por metagenómica son usadas en procesos biotecnológicos En bases de datos hay un enorme número de proteínas no caracterizadas, a las que se deben sumar genes aún no descubiertos, que están presentes en ambientes naturales La predicción funcional basada en estructuras podrá ser un mecanismo para obtener nuevas enzimas MetaGene: Noguchi et al. 2006 Nucleic Acids Research 34, 5623–5630 Bibliografía adicional Metagenomics. Methods and Protocols W.R. Streit & R. Daniel, Eds Humana Press, 2010
