2009-Correa1.pdf

Laboratorio CRAVERI S.A.I.C.
Lic. María Laura Correa
División Bioingeniería
Arengreen 830 (C1405CYH) Ciudad de Buenos Aires
Tel.:005411-5167-0555. www.craveri.com.ar
Ingeniería de Tejidos
Problemática actual
DAÑO DE UN TEJIDO (pérdida por trauma o falla
por enfermedad)
LIMITACIONES
Estrategias médicas:
Quirúrgicas
-Transplante de órgano (de un
paciente a otro o
xenotransplante)
-Transferencia de un tejido
sano del mismo paciente a la
zona dañada
-Reemplazo mecánico (por
Ej.: prótesis de articulación,
diálisis)
Donantes limitantes, necesidad de
inmunosupresión
Un tejido no puede reemplazar la
totalidad de las funciones de otro
tejido y hay riesgos de
complicaciones
Riesgos de infección, no siempre
se logra durabilidad del efecto y
biocompatibilidad; su utilización
en niños conlleva más
complicaciones
Administración de productos metabólicos (por ej:
insulina) Desbalance del metabolismo, por falta de mecanismos
feed-back
Estadística mundial
United Network for Organ
Sharing/
Organ Procurement and
Transplantation Network
Estadística mundial
United Network for Organ
Sharing/
Organ Procurement and
Transplantation Network
• Una persona cada 14 minutos se agrega a la lista de
espera
• Un paciente muere cada 85 minutos esperando un
transplante
Ingeniería de Tejidos
Un poco de historia
1984- se utiliza por primera vez el termino
“Tissue engineering” en una publicación
científica
1985- Dr. Fung: “Ingeniería de tejidos
vivos”
1987- La academia nacional de ciencias
elabora una definición de la “Ingeniería de
tejidos”
Un poco de historia
Área interdisciplinaria emergente de la
ciencia que aplica los principios de la
biología e ingeniería para desarrollar
substitutos viables que mejoren o
reemplacen tejidos u órganos dañados
Un poco de historia
Área interdisciplinaria emergente de la
BIOLOGÍA
ciencia que
aplicaMEDICINA
los principios de la
Biol. Molecular
genética
, Cirugía,
biología ey celular,
ingenier
í
aexperimental
para desarrollar
bioquímica,
Medicina
Inmunología
substitutos viables que mejoren o
BIOINGENIERÍA
reemplacen tejidos
órganos dañados
Tecnología deu
cultivo,
biotecnología,
ingeniería,
sc. materiales
Un poco de historia
1989- Aparecen algunas publicaciones
Un poco de historia
1993- Langer y Vacanti: impulsan las
investigaciones en este campo
Robert Langer
Joseph vacanti
Un poco de historia
1995- Generan una oreja Humana
Un poco de historia
1996- Tratamiento de un niño con Síndrome de
Poland
Un poco de historia
1998- Reconstituyen una falange de un
operario
Universidad de Massachuset
1999- Apligraf en Epidermolisis bullosa
Un poco de historia
2004 – Warnke diseña un sustituto para mandíbula,
utilizando al propio paciente como biorreactor.
Warnke et al.
Growth and Transplantation of a
Custom Vacularised Bone Graft
in a Man. Lancet 2004; 364:766770.
Un poco de historia
Warnke et al.
Growth and Transplantation of a
Custom Vacularised Bone Graft
in a Man. Lancet 2004; 364:766770.
Un poco de historia
-Actualmente miles de pacientes han sido
tratados con productos obtenidos de la IT
-Han surgido diversas empresas privadas
-Mayo 2005 comenzó a regularse en USA los
productos de IT
El objetivo en común entre las diferentes ramas comprendidas
dentro de esta disciplina es la reparación de la función de un tejido a
través de la incorporación de elementos que se integren a dicho
tejido.
Algunos dispositivos diseñados por ingeniería de tejidos pueden
ser utilizados también para lograr la liberación controlada de
alguna droga, incluso de algún factor que permita promover la
angiogénesis y/o favorecer la regeneración de un tejido.
Campos de aplicación
Herramientas
CÉLULAS
BIOMATERIALES
FACTORES DE CRECIMIENTO
Que células se utilizan?
ADULTAS
•
•
Diferenciadas
Indiferenciadas o células madre (stem
cell)
EMBRIONARIAS
Que células se utilizan?
Células adultas
DIFERENCIADAS
• Células funcionales de los tejidos
• Baja capacidad de proliferación in vivo
• Para replicarlas in vitro primero hay que des-diferenciarlas
INDIFERENCIADAS
• Presentes en muchos tejidos
• Implicadas en la regeneración de tejidos dañados
• Pueden autoperpetuarse (alta capacidad regenerativa)
Células madres (Stem Cell): son multipotentes
Células madres tisulares (Stem cell tisulares): son
unipotentes
CÉLULA MADRE
y generar células
más diferenciadas
DEFINICIÓN:
Es aquella célula
que puede:
Reproducirse
Que células se utilizan?
Células adultas
indiferenciadas
Mesenquimáticas:
Adipocíticas
Cordón umbilical
Stem cell tisulares
Stem cell epidérmicas
Stem cell limbares
Stem cell
Que células se utilizan
Células embrionarias
Células procedentes de la Masa Celular Interna de
la blástula.
Se dividen dando nuevas copias de sí mismas
Capacidad de diferenciarse a prácticamente
cualquier tipo de tejido: son pluripotentes
No pueden dar lugar, por sí solas, a un recién
nacido. Se necesitan los tejidos extraembrionarios
para el proceso de gestación
Que células se utilizan?
Origen
del mismo paciente (autóloga)
de otra persona
(heteróloga/homóloga)
de un animal (xenotransplante)
Biomateriales
Permitir la adhesión y migración
Liberación y retención de células y
factores bioquímicos
Permitir la difusión de nutrientes
celulares vitales y productos de
expresión
Ejercer influencias mecánicas y
biológicas para modificar el
comportamiento celular
Requerimientos específicos
Biocompatible
Bioabsorbible / remodelable
Degradación concordante con la
reparación
Correcto tamaño del poro
Permeable/semipermeable
Proveer correcta tensión ambiental
Superficie favorable para la adhesión
celular
Promover la formación de MEC
Capacidad para transmitir señales
biomoleculares
FACTORES DE CRECIMIENTO
- Son un conjunto de sustancias, la mayoría de
naturaleza proteica
- Junto con las hormonas y los neurotransmisores
desempeñan una importante función en la
comunicación intercelular
- Responsables del control externo del ciclo
celular
- Mantienen la supervivencia celular,
estimulan la migración celular, diferenciación
celular e incluso la apoptosis
- Desempeñan su función a muy baja
concentración
Estrategias de
la IT
Estrategia general
Terapia celular
Generación de dispositivos celulares
Ingeniería de tejidos basada en stem cell
(Medicina regenerativa)
Aislamiento inmunológico
Clonación terapéutica
Obtención de
la biopsia
Implante
Terapia celular
Aislamiento
celular
Suspensión
celular
Expansión
in Vitro
Epicel
Lámina de
queratinocitos
Craveri
Suspensión de
condrocitos
Craveri
Lámina
Urotelio
Craveri
Suspensión de
mioblastos
Generación de
Dispositivos
Celulares
PTEI
Universidad de Massachuset
Articulación de falanges
Tissue Mechanics
Laboratory-Canada
Válvula
Cardiaca
Craveri
Arteria
Dispositivo
Vesical
Ingeniería de tejidos basada en stem cell
(Medicina regenerativa)
Aislamiento inmunológico
Evita el contacto
de las proteínas
del sistema
inmunológico con
las células
encapsuladas
Permite el ingreso
de nutrientes y el
egreso de residuos
Clonación terapéutica
Métodos de la IT
Obtención de
la biopsia
Implante
Aislamiento y
selección celular
Formación de
un neotejido
Expansión
in Vitro
Generación
de la matriz
3D
Construcción del
sustituto biológico
Obtención de
la biopsia
Implante
Aislamiento y
selección celular
Formación de
un neotejido
Expansión
in Vitro
Generación
de la matriz
3D
Construcción del
sustituto biológico
Obtención, Aislamiento y
Cultivo Celular
Procesamiento
Muestra de Tejido
Tejidos
humanos:
Autólogos (el tejido proviene del paciente que recibirá el
tratamiento)
Heterólogos (el tejido proviene de otra persona, pueden
ser deben donantes sanos o cadavéricos)
Tejido de otra especie (Xenotransplante)
deben provenir de criaderos especializados, con un estricto
programa de control sanitario
Se tiene que estudiar la esterilidad, presencia de
micoplasma, virus animales cultivados in vitro, búsqueda
de retrovirus específicos por PCR, etc
Estudios de Enfermedades
Infecciosas
Tipo HIV Hepatitis Hepatitis HTLV Citomegalovirus Treponema
celular 1,2
pallidum
C
B
Tejido
Autólogo
R
R
R
-
-
-
Stem
Autólogo
R
R
R
R
-
-
Tejido
Heterólogo
X
X
X
X
X
X
Stem
Heterólogo
X
X
X
X
X
X
Procesamiento
Muestra de Tejido
Músculo esquelético
Córnea
Piel
Cartílago
• Debe realizarse de manera aséptica
• Es enviada al laboratorio en medio de transporte
• Es sometida un estricto proceso de descontaminación
Procesamiento
Aislamiento Celular
Disgregación mecánica y enzimática
Pocesamiento
Selección Celular
Centrifugación
Selección por gradiente
(por tamaño y densidad)
Selección con
anticuerpos
(característica
celular)
Adhesividad selectiva
(característica bioquímica)
Cultivo celular
Tipos de Cultivos
Crecimiento en monocapa: las células se
adherirán a un sustrato y en esa forma iniciarán la
proliferación.
La mayoría de las celulas son anclaje dependientes
(no inician la proliferación hasta que se han
adherido al sustrato)
Crecimiento en suspensión: células capaces de
proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato,
(independientes de anclaje)
Células hematopoyéticas, algunas líneas celulares
transformadas y de células procedentes de
tumores..
Procesamiento
Propagación celular
Músculo Liso de
Cuerpo Cavernoso
Queratinocitos
Epitelio Anterior de córnea
Mioblastos
Propagación celular
- Los cultivos primarios toleran
alrededor de 20 repiques
- Si se continúa repicando:
-El cultivo entre en senescencia
Ó
-se llega a generar una línea celular
→ CULTIVO INMORTALIZADO
(genotipo anormal)
Propagación celular
Terapia Celular
Obtención de
la biopsia
Aislamiento y
selección celular
Expansión
in Vitro
Formulación
Suspensiones
n° células viables adecuado, se resuspenden en el volumen
adecuado de medio de inyección.
El volumen puede variar desde los ul hasta los ml
Algunos productos pueden ser criopreservados y otros
deben ser entregados pocas horas despues de elaborados
Obtención de
la biopsia
Implante
Aislamiento y
selección celular
Formación de
un neotejido
Expansión
in Vitro
Generación
de la matriz
3D
Construcción del
sustituto biológico
Generación de la matriz
Que función cumple la matriz extracelular?
- Le da soporte estructural a los
tejidos
- Migración celular (imprescindible
para la cicatrización, desarrollo
embrionario)
- Estimula la diferenciación celular
- Trasmite señales (apoptosis,
replicación)
- Transporte de factores de
crecimiento
Generación de la matriz
Cual es el mecanismo de acción?
- a través de receptores de membrana
- se produce una cascada de
señalización que desencadena la
activación o silenciamiento de genes
GF
MEC
Membrana celular
PET
P21
FAK
SRC
Actina
Migración
Adhesión
Mantenimiento
Proliferación
Generación de la matriz
Cuales son sus componentes?
-Colágeno (molécula mas abundante, 27
tipos diferentes. Se agrupan en 3
categorías: formadores de fibras, de anclaje
y formadores de membrana)
-Proteoglicanos (muy diversos, tanto
estructuralmente como funcionalmente.
Proteína mas carbohidratos)
-Enzimas, proteínas de anclaje,
glicosaminoglicanos (hialuronato), laminina
Generación de la matriz
Clases de biomateriales
•
Cerámicos
•
Poliméricos
•Sintéticos:
PLLA, PGA, PLGA, PCL, polialcanoatos,
politirosincarbonato, polipropilenfumarato
• Naturales:
colágeno, polisacáridos, matrices decelularizadas,
laminina, fibrina, gelatina
• Combinaciones de ambos
Obtención de
la biopsia
Implante
Aislamiento y
selección celular
Formación de
un neotejido
Expansión
in Vitro
Generación
de la matriz
3D
Construcción del
sustituto biológico
Bioreactores
Señal extracelular
de crecimiento
Activa genes
•Naturaleza de la matiz
de expresión
extracelular
represión
•Interacciones intercelulares
•Factores ambientales
(estrés, mecánicos, pH,
gases)
Promover o restringir:
•Factores
o
•Proliferación
•Migración
•Diferenciación
•Remodelación
de la
matriz
•Organización tisular
Bioreactores
Mecanotransducción
Proceso por el cual la célula
transduce el estrés mecánico en
señales bioquímicas para regular
su función o actividad biológica
Estimulación
mecánica
Impacta en la matriz
extracelular
Afecta unión
integrina-matriz
Bioreactores
Sistema en el cual las
condiciones ambientales
están totalmente controladas
para permitir o inducir ciertos
comportamientos celulares
Bioreactores
Células:
Bioreactor:
e.g. Vaso rotante
Matriz:
e.g. Malla de fibrina
o esponja de colágeno
Tejido Ingenierizado
Aplicaciones:
Bioreactores
Proveen el ambiente in vitro en el cual la
células y las construcciones 3D pueden
desarrollarse y convertirse en un neotejido
Los bioreactores deben ser diseñados para
generar un ambiente in vitro que incorpore las
señales bioquímicas y biomecánicas que son
requeridas para la generación de un tejido
específico in vivo
Bioreactores
Dónde se cultiva?
•Cultivo estático
Bioreactores
Dónde se cultiva?
• Vasos rotantes
Bioreactores
Dónde se cultiva?
Bioreactores
Dónde se cultiva?
•
Columnas de perfusión
Sometido a fuerzas
hidrodinámicas:
- el neotejido está fijo
- recirculación del medio
continua
Formulación
Láminas/Dispositivos
Dispositivo Dermo-epidérmico
Lámina de Queratinocitos
No pueden ser criopreservadas
El tamaño, espesor y cantidad es variable ya que depende de
la lesión a curar de cada paciente
Liberación del Producto
• Identificación de la
•Pureza:
sustancia biológica:
• % de células viables
• % de células de estirpe
• Trazas: suero, antibiótico
• marcación inmunológica
• morfología
• marcador bioquímico
• Dosis:
• N° células viables
• n° de células de
determinada estirpe
• ADN total
• Proteínas totales
•Seguridad:
•Test de esterilidad,
micoplasma, endotoxinas
•Virus adventicios
•Potencia:
• n° células viables
• ensayos biológicos
Características especiales
para su producción
Ingrediente activo: células vivas
No puede sufrir una esterilización final para
remover o inactivar microorganismos
Las materias primas utilizadas en su fabricación
pueden potencialmente permanecer asociadas a
las células
En la mayoría de los casos, el producto final no
puede ser almacenado por largos tiempos
Un lote corresponde a una dosis
Los métodos analíticos tradicionales no siempre
son aplicables
Materias primas
Las
materias primas que se
utilizan durante el proceso
pueden ser parte del producto
final o solo parte del proceso de
fabricación. De ambas maneras
pueden afectar, la seguridad,
eficacia y pureza del producto
Materias Primas
Células
Biomateriales
Medios de cultivo
Suero Bovino
Enzimas
Factores de crecimiento
Citoquinas
Materias Primas
Calificación
1.
Identificación y selección de los materiales
2.
3.
Evaluación del riesgo: seguridad, potencia y pureza
durante la elaboración del producto
Caracterización: se debe comprobar
4.
Establecer la fuente
Cantidades
Concentraciones
Especificaciones del proveedor
la identidad
pureza
funcionalidad
ausencia de contaminantes microbiológicos
Establecer Criterios de Calidad
Controles durante el
proceso de fabricación
Los controles durante el proceso son los
ensayos o test que se realizan para
asegurar que el producto semielaborado
tiene la calidad suficiente para asegurar la
calidad del producto final (ej. viabilidad y
n° celular)
Validación
El material con el cual se comienza el proceso se
obtiene a partir de una muestra de tejido que
generalmente es muy diferente entre pacientes
El
procesamiento celular tiene una variabilidad
inherente
Ej:
la validación tiene que mostrar que el proceso
puede producir un producto libre de
microorganismos o que no hay contaminación
cruzada entre pacientes