clase POX 2013 - Calamante.pdf

“Vectores basados en poxvirus”
Gabriela Calamante
Instituto de Biotecnología
CICVyA – INTA Castelar
[email protected]
Vectores virales
• Son virus genéticamente atenuados o incapaces de completar su ciclo
replicativo en el animal a inmunizar, por lo que no producen enfermedad
clínica
• Son virus modificados que llevan genes foráneos o secuencias integradas
en posiciones que no son esenciales para la replicación viral ni para la
infectividad.
• El virus es el vehículo y el gen foráneo es el gen de interés contra el cual
se quiere desarrollar la vacuna.
• Ventajas de los vectores virales no replicativos
- Inocuidad
- Expresión de glicoproteínas
- Estabilidad
Diseño de
un vector
viral
1- es necesario estudiar el genoma del vector para
identificar al menos una región donde insertar el material
genético foráneo
2- los genes de interés deben estar establemente
integrados en el genoma del vector
3- la inserción del gen foráneo debe realizarse de tal
manera que se garantice su correcta expresión (cantidad,
plegamiento, destino final, modificaciones post-traduccionales)
El 1er reporte
de un vector
viral fue a
principios de
los ´80
Se demostró que el virus vaccinia podía ser
ingenierizado para portar y expresar genes foráneos
Desde entonces la tecnología se aplicó en diferentes
familias de virus y para una gran diversidad de genes
foráneos (incluyendo los que codifican para antígenos
de patógenos)
Poxvirus Bioinformatics Resource Center
Family
Poxviridae
Subfamily
Chordopoxvirinae
Genus Avipoxvirus
Capripoxvirus
Leporipoxvirus
Molluscipoxvirus
Orthopoxvirus
2 subfamilies
8 genera
2 species
3 species
2 species
1 species
7 species
Parapoxvirus
Suipoxvirus
Yatapoxvirus
Subfamily
Entomopoxvirinae
Genus Betaentomopoxvirus
Genus
Unclassified Poxviridae
2 species
1 species
2 species
1 genus
1 species
3 species
Melanoplus sanguinipes
entomopoxvirus 'O'
Mule deer poxvirus
Nile crocodile poxvirus
1 isolate
http://www.poxvirus.org
2 isolates
1 isolate
CNPV; FWPV (US; FP9)
GTPV, LSDV, SPPV
MYXV, RFV
MCV
VV (16), CMLX, CPXV,
ECTV, MPXV, VARV (49),
TATV, MVA
BPSV, Orf V
SWPV
TANV, YMTV
Poxvirus
Características
• Son virus envueltos complejos que replican en el citoplasma de células de
vertebrados e invertebrados.
• Su genoma está formado por una molécula de ADN de doble cadena lineal
de 130-375 kpb, bajo contenido G+C (30-40%).
• La partícula viral contiene enzimas que sintetizan los ARNm tempranos.
Poxvirus
recombinantes
• Usos de los poxvirus recombinantes
- Estudios sobre la biología molecular de los poxvirus
- Estudios de patogenicidad (ECTV en ratones)
- Producción y caracterización funcional de proteínas in vitro
- Producción de vacunas de nueva generación
• Ventajas de su utilización como vacunas de nueva
generación
- el virus es extremadamente estable a condiciones ambientales adversas, por lo cual se eliminaría
la necesidad de una estricta cadena de frío para su almacenamiento y distribución
- la vacuna puede ser administrada por diferentes vías
- la capacidad de inducir respuestas tanto humorales como celulares contra el antígeno foráneo,
generando inmunidad duradera
- la flexibilidad de empaquetamiento del genoma permite delecionar grandes cantidades de
genoma viral e insertar al menos 25 kpb de ADN foráneo, permitiendo así crear vacunas
multivalentes
- los poxvirus recombinantes son genéticamente estables ya que la expresión del gen heterólogo
sigue siendo detectada luego de un alto número de pasajes a baja multiplicidad de infección en FEP
- la inmunización se consigue en ausencia de replicación viral, se elimina así la posibilidad de una
diseminación del vector en los animales vacunados y por consiguiente no es posible la dispersión
por contacto hacia animales no vacunados o hacia el ambiente en general.
- no se manipula el agente infeccioso en la producción de las vacunas
Diseño de los vectores de transferencia para
obtener poxvirus recombinantes
Vector de transferencia
pE- X - t
Sitio blanco
de inserción
poxvirus
recombinación
homóloga in vivo
poxvirus recombinante
pE- X - t
pE: promotor temprano de poxvirus
X: gen de interés.
t: terminador de transcripción y traducción
La recombinación homóloga ocurre en dos pasos
Sustitución alélica por
doble recombinación
homóloga
5’
Vector de
transferencia
VV
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 5’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 3’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
3’
Gen no esencial
salvaje
VV recombinante estable
VV
5’
3’
VV recombinante inestable 5´
5´ 5’
3’
5’
VV recombinante inestable 3´
3´
5´
3’
5’
3’
3´
recombinante
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV salvaje
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV recombinante estable
VV salvaje
Obtención de
poxvirus
recombinantes
Ingeniería
genética
1- Diseñar el vector de transferencia
Cultivo
2- Infección de un cultivo celular con el virus salvaje
Virología
1’- Subclonar el gen de interés en el vector de transferencia
2´- Transfección del vector de transferencia a las células
infectadas
recombinación
homóloga in vivo
(frecuencia 0,4 %)
Cultivo
Virología
Biología
molecular
Inmunología
3- Seleccionar los poxvirus recombinantes
4- Obtener un stock puro
5- Caracterizar genética y biológicamente los
recombinantes seleccionados
6- Evaluar su capacidad de inducir respuestas inmunes
específicas en animales (vacunas)
Elección del
sitio blanco
de inserción
1- Genes no esenciales para la replicación en cultivos
celulares
a) de función conocida
Virus vaccinia (1º generación)
genes de las enzimas timidina kinasa y
hemoaglutinina
MVA (2º generación)
pueden usarse los mismos genes como blancos de
inserción.
b) de función desconocida
Virus canarypox
orf C5 (ALVAC comercializados por Merial)
Análisis bioinformático de secuencias disponibles y búsquedas bibliográficas.
c) de función conocida
evasión de respuesta inmune (3º generación)
receptores solubles de citoquinas (IL-1, IFNg, IL-18, etc)
Elección del
sitio blanco
de inserción
(cont.)
2- Deleción de genes esenciales para la replicación en cultivos
celulares
El virus sólo puede crecer si el gen o su producto son provistos en trans
El virus sólo replica in vitro en una línea celular que exprese el producto
del gen delecionado
A principios de los ´90: Blasco y Moss caracterizaron la proteína de envoltura p37 de
vaccinia (codificada por el gen F13L)
La deleción de F13L no afecta la formación de partículas infectivas intracelulares
VAC-∆F13L no ocurre la adquisición de la membrana del Golgi ni la fusión a membrana
plasmática
no egresa
defectivos en diseminación y no forma placas de lisis a los 2 dpi, sin
embargo forma placas de lisis diminutas a los 5-7 dpi
VAC-∆
∆F13L
(receptor, NO FORMA
PLACAS DE LISIS)
VAC-recombinante
F13L+
FORMA PLACAS DE LISIS
Vector de transferencia
Elección del
sitio blanco
de inserción
(cont.)
3- Virus de replicación limitada
El virus se puede crecer in vitro en cultivos celulares de una especie
El virus se usa como vector en otra especie en la cual es incapaz de
completar el ciclo replicativo pero es capaz de expresar el gen foráneo
Avipoxvirus (CNPV y FWPV)
MVA y NYVAC
BHK-21
FEP
Expresión gen marcador
GUS
células BHK-21
infectadas con CN-GUS
Elección de
los
promotores
La expresión del gen de interés debe estar
dirigida por regiones regulatorias de poxvirus
a)
Promotores
b)
Terminadores de transcripción y traducción
1) Vector viral replicativo
VV en ratones o FWPV en pollos
Se pueden usar indistintamente promotores tempranos o tardíos de
poxvirus
pE/L sintético, p7.5, p11, pATI, pATI-(7.5)3-4
2) Vector viral no replicativo
avipox o MVA en mamíferos
Sólo se pueden usar promotores tempranos de poxvirus
pH6, pE/L sintético, p7.5
pEL
t
SMC
pEL
Gen de interés
t
Selección de
los
poxvirus
recombinantes
Teniendo en cuenta que:
la eficiencia de transfección es del 0.4%
la frecuencia de ocurrencia de doble recombinación no se
puede cuantificar
el virus salvaje replica normalmente
Es fundamental disponer de un sistema que permita
seleccionar los virus recombinantes con una alta eficiencia
Métodos de
selección de
los
poxvirus
recombinantes
1) Selección por resistencia a un compuesto químico
a) resistencia a antibiótico (neo)
no aplicable para el área de vacunas (a menos
que se utilice sistema loxP-cre)
b) resistencia a ácido micofenólico
selección de poxvirus recombinantes que
poseen el gen bacteriano gpt (enzima xanthine-guanine phosphoribosyltransferase)
MPA bloquea la ruta biosintética de purinas
interfiere con la replicación viral
Expresión de XGPRT en presencia de MHX
resistencia a MPA
sustratos alternativos (X /H) y
Sólo los virus recombinantes replican y forman placas de lisis
Se seleccionan los eventos de simple y doble recombinación
2) Screening por actividad de una enzima marcadora
Actividad de las enzimas β-galactosidasa o β-glucuronidasa codificada por
los genes bacterianos lac Z o uid A, respectivamente.
3) Selección por fenotipo
tamaño de placa de lisis
Identificación de genes que codifican para proteínas que:
a) no son esenciales para la replicación en cultivo celular
b) son esenciales en las etapas finales de la morfogénesis viral (liberación del virus)
VAC
p37K , 14K, B5R, H3L, entre otras
Screening
por
actividad
GUS
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
pE/L-XX - t
Gen no Poxvirus
esencial
recombinación homóloga in vivo
pH6-GUSPoxvirus
t recombinante
pE/L -XX - t
200X
Número de
pasaje
% placas de lisis
azules
1er
0,1%
2do
30-70%
3ro
70-90%
4to
90-100%
5to
100%
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
Caracterización molecular de los poxvirus
recombinantes
Aislamiento en FEP de las placas de lisis azules
(stock 100% homogéneo)
1) Análisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados
o no para determinar:
A) Presencia del gen de interés
B) Pureza del stock recombinante
2)
Análisis mediante Southern blot (inserción del gen de interés en el genoma viral)
a partir de ADN total purificado de FEP
3) Evaluación de la expresión del gen de interés en FEP (ARN total o extractos proteicos)
A) RT-PCR
43 kDa
VP2
34 kDa
C) Inmunofluorescencia (anticuerpo específico)
CE
F
NI
VA
M
VA
-V
P2
M
W
M
M
DV
B) Western blot (anticuerpo específico)
IB
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
(cont.)
Caracteri- Caracterización biológica:
zación de los
Cinética de crecimiento
inserción no altere capacidad replicativa
poxvirus
Pasajes ciegos (más de 10)
para demostrar estabilidad genética
recombiInfecciones de diferentes tipos de cultivos celulares
conserva el mismo rango de
nantes
hospedadores
(cont.)
Inoculación en animales susceptibles
no modificó su virulencia
Inoculación en animales no susceptibles
no produce lesiones
Single - step
Poxvirus como vacunas para humanos
http://clinicaltrials.gov (dic/2010)
enfermedad
Malaria
Tuberculosis
HIV/AIDS
Cancer
Total
total vacunas
88
48
94
932
1345
vectores virales
15 (17%)
23 (47,9%)
94 (33,9%)
76 (8,2%)
208 (15,5%)
Adeno
7
3
43
35
88
tipo de vector
MVA/NYVAC
FWPV
11
5
19
1
26
4
14
37
70
47
CNPV
0
0
34
9
43
Compañía biotecnológica que desarrolla y produce nuevas vacunas para el
tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas y cáncer
Preclinical
Ph 1
Ph 1/2
Ph 2
Ph 3
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
X
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
CANCER VACCINES
PROSTVAC®
CV-301 colon
CV-301 breast
CV-301 lung
CV-301 ovarian
MVA-BN® PRO
MVA-BN® HER2
INFECTIOUS DISEASES
IMVAMUNE® liquid-frozen
IMVAMUNE® freeze-dried
MVA-BN® Anthrax
MVA-BN® Filo
MVA-BN® FMDV
MVA-BN® RSV
Preclinical Ph 1 Ph 1/2
BIODEFENSE VACCINES
Smallpox IMVAMUNE liquid-frozen*
Smallpox IMVAMUNE freeze-dried
MVA-BN-Anthrax
Filovirus MVA-BN-Filo
MVA-BN-FMDV
COMMERCIAL VACCINE
MVA-BN-RSV
x
Ph 2
Ph 3
x approved**
x
x
x
x
x
* sold to gevernment stockpiles
** in the European Union in August 2013 under the trade name IMVANEX
MVA como
vector…
mitos y
MVA no es lo suficientemente inmunogénico
realidades
La respuesta inmune que induce genera protección
Es más potente cuando se lo usa en el boost (refuerzo)
BCG + MVA-85A; virus influenza A + MVA-NP/M1; AdH + MVA (ME-TRAP, AMA-1, MSP-1 de P. falciparum)
ELISPOT IFNg
>1000 sfu/106 PBMC en humanos (10 veces más que con otras estrategias)
respuesta de Acs (AdH/MVA)
40ug/mL vs 70 ug/mL adyuvantes
MVA es genéticamente inestable
Genoma viral
secuencias genómicas de 5 aislamientos de MVA de diferentes laboratorios son idénticas (con excepción de la
longitud de las secuencias terminales variables)
original (Mayr), Acambis 3000, MVA-I721, MVA-BN®, Bac-MVA
no se aislan contaminantes menores en stocks purificados por placas de lisis (proceso al que se someten los
recombinantes)
Transgen
la estabilidad se confirma por 10 pasajes ciegos por cultivo, previo a la producción de los stocks vacunales
se observó que es dependiente del transgen si ejercen una presión negativa al crecimiento viral (ej. Env de HIV)
opciones: sitio blanco entre 2 genes esenciales, disminuir expresión usando otros promotores (evaluar
consecuencias sobre la inmunogenicidad), realizar mutaciones silenciosas en las secuencias
MVA como MVA no puede producirse a gran escala
vector…
Sí se puede
mitos y
La empresa Bavarian Nordic produjo 4 millones de dosis (10 TCID ) de la vacuna de viruela IMVAMUNE® para
realidades el gobierno de EEUU, que ya encargó 40 millones de dosis.
no se aislan contaminantes menores en stocks purificados por placas de lisis (proceso al que se someten los
(cont.)
8
50
recombinantes)
Cultivos celulares
No se utilizan cultivos de fibroblastos de embrión de pollo SPF
ProBioGenAG (Alemania) e IDT-Biologika GmbH
de embrión de pato)
Vivalis (Francia)
línea celular AGE1.CR (inmortalizada de células de retinal
1x 108 -2 x 109 ufp/ ml de MVA en lisados crudos (también sirven para CNPV y FWPV)
línea celular EB66® (derivada de stem cells de embriones de pato)
Purificación
Evitar el paso de centrifugación en el proceso de purificación
BN®
membranas de adsorción de pseudo-afinidad (MA) y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
61% de partcículas infectivas / contaminantes: ADN 0,01-2,5% (del inicial) y proteínas < 0,1%
La inmunidad anti-vector implica que los MVAr sean inútiles
La inmunidad previa: vacunación de viruela (antes de erradicación) o por el esquema de
vacunación del MVAr
Existen numerosos ensayos de fase clínica que mostraron que la inmunidad anti-vaccinia
no alteró la performance de las vacunaciones con MVAr
Los MVAr son capaces de inducir respuestas inmunes humorales y celulares aun en
presencia de inmunidad anti-vaccinia
* vacuna terapéutica contra cáncer (Fase I/II)
* vacuna HIV
12 vacunaciones, 30 días entre inmunizaciones
3 dosis espaciadas cada 8 semanas
EN LOS 2 CASOS LA MAXIMA RESPUESTA INMUNE CONTRA EL TRANSGEN SE OBSERVO LUEGO DE 3
INMUNIZACIONES, en el primer caso los boosters mantuvieron la respuesta al mismo nivel que la alcanzada
luego de 3 dosis
* MVAr en ratones / conejos (i.n o i.m) --> 2 dosis espaciadas por 14 días, sólo luego del booster se observa una
respuesta potente contra el transgen
Elisa gD
**p=0,0060
1.2
**p=0,0050
0.8
0.4
**p=0,0043
2º
in
m
.
2º
in
m
.
M
V
A
-g
D
s
M
V
A
1º
in
m
.
M
V
A
-g
D
s
1º
in
m
.
0.0
M
V
A
Densidad óptica 405nm
MVA como
vector…
mitos y
realidades
(cont.)
MVA como
vector…
mitos y
realidades
(cont.)
MVA replica en células humanas
Numerosos estudios confirman que el MVA original aislado por Mayr es avirulento y no
replica in vivo
diferentes especies de mamíferos (incluso en animales inmunosuprimidos) y por múltiples vías de
inmunización (incluyendo intravenosa e intracerebral) (Revisado en McCurdy et al., Clin Infect Dis 2004;38:1749–53)
Replicación de MVA en cultivos celulares:
* BHK-21 (hámster)
única línea celular de mamífero donde replica MVA a niveles similares que en FEP
* CV-1 y BS-C-1 (mono)
replica con 1-2 logs menos que en FEP y fenotipo de placas de lisis pequeñas
* células humanas (cultivos primarios o líneas celulares)
rendimiento es de 1 ufp por ufp de inóculo, algunos
reportes indican que es mayor, pero siempre menos de 10 ufp / ufp de inóculo
Cell line
BHK-21
Caco-2
H411E
FHs74int
Hutu-80
Vero
ATCC code
CCL-10
HTB-37
CRL-1548
CCL-241
HTB-40
CCL-81
Species
Hamster, syrian
Human
Rat
Human
Human
African green monkey
RK-13
CHO-K1
A549
PK15
NMULI
293
CCL-37
CCL-61
CCL-185
CCL-33
CRL-1638
CRL-1573
Rabbit
Hamster, chinese
Human
Pig
Mouse
Human
CPE
++++
(-)
+
(-)
(-)
++
Multiplication
6068 (P)
<1 (NP)
<1 (NP)
<1 (NP)
<1 (NP)
10 (SP)
+
(-)
+
+
++
(-)
<1 (NP)
<1 (NP)
1,8 (SP)
<1 (NP)
6 (SP)
<1 (NP)
Uso de
poxvirus
recombinantes
- Estudios sobre la biología molecular de los poxvirus
- Producción y caracterización funcional de proteínas in vitro
- Producción de vacunas de nueva generación
- Optimización de vectores poxvirales
Estudios
virales
básicos
MORFOGÉNESIS VIRAL
Todos los estudios que determinaron los pasos que ocurren
durante la morfogénesis del virus vaccinia se realizaron
utilizando recombinantes que poseían deleciones de
determinados genes
1- se determinó si el gen era esencial para la replicación en cultivo
2- se determinó en que paso de la formación de las partículas virales está
involucrada la proteína
3- por ensayos de trans-complementación se reconstituía el fenotipo salvaje
VAC-WR
VAC-∆B5R
VAC-∆B5R/B5R
Producción
de proteínas
en cultivo
Utilizando la enzima T7 ARN polimerasa
1)
2)
3)
Enzima activa posee una subunidad
Alta procesividad de transcripción
Especificidad de promotor en citoplasma de células de mamíferos
Es un sistema de 2 componentes
no se requiere hacer el poxvirus
recombinante de cada proteína en estudio
FWPV-pEL/T7RNApol
Plásmido
pT7
Evaluación de la
proteína de interés en
forma transitoria
10-30% del ARNm total
Si un gen se expresa
Localización proteínas-tag
Actividad enzimática (prot secretada)
Rescate de
virus
infeccioso
Estudios de genética reversa
Copias completas de genomas virales en plásmidos bajo regulación del
promotor del fago T7
No se hace transcripción in vitro
El ADN se transfecta en células infectadas con FWPV-T7 o MVA-T7
Efecto citopático de FWPV-T7 << MVA-T7 <<< VAC-T7
Se utilizan todo tipo de cultivos (poxvirus expresa T7 RNA pol en ausencia
de replicación)
•Rescate de virus infeccioso (genoma a ARN: norovirus, FMDV, IBDV, HAV,
CSFV, etc.)
•Evaluación de mutaciones/ intercambios genéticos (replicación, atenuación,
patogenia, etc.)
Vacuna
contra la
rabia en
zorros
PRUEBA A CAMPO CON VACUNA BASADA EN VIRUS VACCINIA
Objetivo: erradicar la rabia de los zorros salvajes (reservorio no controlado de virus)
VVTGgRAB: virus vaccinia recombinante que porta el gen de la glicoproteína de
rabia insertado en gen TK (atenuado)
Vacuna:
Vacuna Sobrenadante de cultivo de células BHK infectadas con VVTGgRAB
(vector
replicativo)
Cebo:
Cebo
50% carne fresca de pescado, 11% de aceite de pescado, 11% de un polímero sintético hodrofóbico
(produce el agregado)
un sachet de polietileno con 1 dosis de vacuna líquida
contiene un biomarcador de la toma del alimento
Se almacena a 4ºC sin congelar
Posee resistencia mecánica
puede lanzarse desde el aire
Campañas de noviembre de 1989, abril y octubre de 1990 en Bélgica.
área de 2200 km2 en el sur de Bélgica
15 cebos/km2
81% de los zorros eran positivos para el biomarcador
No se detectaron casos de rabia en ganado o zorros
Debido al éxito, se continuó usando entre 1991 y 1994
1989
1994
Raboral
V-RG
En EEUU cada año se distribuyen más de 12 millones de dosis
de RABORAL V-RG® para prevenir la dispersión de rabia en
animales silvestres (principalmente mapaches y coyotes).
Existe transmisión pasiva de anticuerpos neutralizantes
Las crías pueden ser vacunadas a partir de los 30 días de edad
Los anticuerpos maternos no interferían con la inducción de protección
Vacunas
basadas en
poxvirus no
replicativos
Sólo replican en un número limitado de tipos celulares
No producen infección en el hospedador
Existe expresión temprana de genes
inducen respuestas
inmunes específicas
DERIVADOS DE:
Virus vaccinia:
MVA (virus vaccinia Ankara modificado): atenuado por más de 500 pasajes en FEP
NYVAC: atenuado geneticamente por deleción de 18 genes no esenciales (regulación rta
inmune y rango hospedadores)
Avipoxvirus:
CNPV (virus canarypox)
FWPV (virus fowlpox)
MVA
NYVAC
Son vectores seguros e inmunogénicos para animales y humanos
Utilizando recombinantes que expresan luciferasa se evaluó su biodistribución en
ratones
A diferencia de WRluc, los recombinantes atenuados expresan el gen reportero
transitoriamente (MVA= 24 h, NYVAC= 72 h).
Los niveles de luciferasa en los tejidos infectados con MVAluc alcanzan un pico
antes que los infectados por NYVACluc.
Estos resultados podrian tener relevancia inmunológica cuando se usen como
vacunas.
MVA y CNPV
ALVAC (virus canarypox)
vacuna contra HIV
2003-2009 ensayo de Fase III en Tailandia (RV144)
105 millones U$S
>16.000 individuos
Régimen prime-boost
1º inoculación: CNPV gag-protease (clado B) y gp120 (clado E)
2º inoculación: vacuna a subunidad gp120 (AIDS/VAX B/E)
Virus canarypox no es inhibido por inmunidad pre-existencia contra virus vaccinia
(vacuna contra viruela en adultos nacidos antes de 1977)
Disminuyó la tasa de infección de HIV alrededor del 31%
No tuvo efecto sobre la carga viral en infectados después de vacunación
PRIMERA VEZ QUE UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA EL SIDA MUESTRA
ALGUNA EFICACIA EN PREVENIR LA TRANSMISION DEL VIRUS
…eficacia es modesta pero primer resultado alentador en más de 2 décadas
MVA
HIV
Se obtuvieron virus recombinantes que expresan antígenos de diversos patógenos
(de animales o humanos) y se observó la inducción de respuestas inmunes
protectoras.
En los últimos años se los utiliza en esquemas de inmunización del tipo prime-boost,
donde el poxvirus se aplica en la 2da dosis (malaria, leishmania, tuberculosis).
2011 en España finalizó la fase 1 de una vacuna contra HIV
• MVA-B que expresa gp120 (monomérica) y poliproteína Gag-Pol-Nef (GPN)
• 3 dosis i.m.
• 92.3% de respuesta celular T específica (ALTAMENTE INMUNOGENICO)
• respuesta amplia: CD4+
contra Env (aumentó luego de 3° dosis)
CD8+
similar contra Env, Gag y GPN
• Las respuestas se mantuvieron durante 48 semanas (84.6% de los voluntarios)
CNPV
Existen vacunas licenciadas para animales de compañía y caballos en la Unión
Europea y EEUU que utilizan la tecnología del vector de canarypox ALVAC®.
Patógeno blanco
Animal blanco
Nombre comercial
Distribuidor
virus influenza equina
caballo
PROTEQ-FLU (UE) y
Recombitek (EEUU)
Merial
West Nile Virus
caballo
RECOMBITEKEquine
WNV
Merial
Rabies virus
gatos
Purevax Feline Rabies
Merial
Feline leukemia virus
gatos
EURIFEL FeLV
Merial
Canine distemper virus
perros
RECOMBITEK rDistemper
Merial
Fur animals
PUREVAXFerret
Distemper
Merial
Canine distemper virus
No se usan adyuvantes
disminuye riesgo reacciones inflamatorias
En algunos casos induce protección luego de 1 dosis
importante cuando se
requiere respuesta rápida
Si se requiere booster
inmunidad anti-canarypox no altera la performance de
los boosters
Sobrepasa los anticuerpos maternos
por ej. los anti-CDV en cachorros
Protección duradera
hasta 1 año luego de la vacunación (FeLV, WNV)
Puede incorporarse en formulaciones vacunales
combinadas
Se almacena/transporta a 4ºC
FWPV
Para la industria avícola existen vacunas licenciadas que
utilizan la tecnología del vector de fowlpox TROVAC®.
Patógeno blanco
Nombre comercial
Distribuidor
Newcastle disease virus
Vectormune FP-ND
Biomune
Avian influenza virus
Trovac AI H5
Merial
El virus recombinante es una vacuna bivalente: viruela + “antígeno foráneo”
Se puede aplicar a pollitos BB de 1 día
Se puede aplicar a pollos sanos antes de ingresarlos en zona de brote:
provee rápida protección
Vacuna FWPV(r) - influenza aviar H5N2 (HA): usada para el control de influenza
aviar en México (1.000 millones de dosis) en pollitos de 1 día de edad: protección
contra enfermedad y muerte (90-100%), reducción del número de pollos que
excretaron virus de desafío por tractos entéricos y respiratorios (50-75%)
PROSTVAC ®
Vacuna terapéutica para el cáncer de próstata avanzado
ensayo clínico (fase 3)
Esquema prime (vaccinia) –boost (fowlpox)
Vectores poxvirales antígeno específico de próstata (PSA) y moléculas co-estimuladoras de células
T (TRICOM B7.1, ICAM-1 y LFA-3)
Acción terapéutica
que expresan PSA
respuesta inmune medida por células T citotóxicas contra las células del tumor
Combinarlo con terapias antitumorales (radio -o quimio-terapia, hormonas, anticuerpos anti-CTLA-4)
Poxvirus
como
vacunas
La inmunidad pre-existente contra el virus vector interfiere con las
dosis refuerzo:
MVA: se aplica estrategia prime-boost (combinando DNA/poxvirus)
CNPV: no, la inmunidad previa no interfiere (intrínseco del vector)
FWPV: en aves puede haber interferencia con anticuerpos maternos anti-viruela
Cantidad de dosis y duración de la respuesta:
hay muchos y variados ejemplos (depende del antígeno y tipo de respuesta )
diferenciar entre blancos de vacunación (animales de compañía vs de producción)
Tipo de respuesta requerida para protección
poxvirus inducen principalmente respuestas CD8+
dependiendo de la compartimentalización del antígeno
CD4+ y Acs
variabilidad cepas patógenas (expresar 1 antígeno o varios?)
Mejorar inmunogenicidad
co-expresión de citoquinas (GM-CSF, IL-1, IL-18)
deleción de genes involucrados en evasión de respuesta inmune
Por deleción de genes involucrados en evasión de respuesta inmune
deleción del gen que codifica para el receptor soluble de IL-18
MVAd008-nef B/F
MVAd008-ova
***
***
Specific lysis (%)
100
***
80
60
40
20
VA
PB
S
p
VA
M
VA
+F
e
d0
0
8O
VA
0
M
VA
-O
MVA-d008
M
MVA
optimizados
Muchas gracias
Grupo de Poxvirus
Dra. Gabriela Calamante
Dra. Flavia Zanetti
Dra. M. Paula Del Médico Zajac
Lic. Romina Cardona
Lic. Carlos Federico
Lic. Débora Garanzini
Srta. Marisol Esusy