Conceptos II-2010Nancy

BIOTECNOLOGIA MICROBIANA
Tres categorías de productos microbianos de
importancia industrial
• Metabolitos primarios
• Metabolitos secundarios
• Enzimas
ÁCIDOS Y SOLVENTES
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos primarios
Ácidos y solventes
Etanol
Ácido cítrico
Ácido Acético
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos primarios-ácidos y solventes
Etanol
Conocido como producto derivado de microorganismos
Levaduras desde azúcares Pasteur 1822-1895
Investigaciones en los últimos 20 años bacterias capaces de producción
desde distintos sustratos con alto rendimiento.
Zymomonas mobilis igual tolerancia y productividad mayor que levaduras.
Rango de sustratos limitado como el de las levaduras
Desde 1970 1400 trabajos publicados
Enzimas claves: Piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa
Etanol or etil alcohol (CH3CH2OH, mol. wt. 46.07) incoloro, inflamable.
Usos
Bebidas
Medicinal o Químico
Combustible
Bioetanol
Al 95% puede ser usado como combustible
Etanol anhidro si se mezcla con gasolina
Conceptos 2010-Nancy I. López
Zymomonas mobilis
Bacilo gram negativo aerobio facultativo (algunos obligadamente
anaerobios otros toleran O2)
α-Proteobacteria
Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol.
Algunos fermentan sacarosa (2 moles de etanol y 2 de C02 por mol
de glucosa).
Etanol 10-12%
Genoma completo 2005-2,06 Mb
Vive sobre plantas incluido el cactus Maguey que fermentado da
bebida mexicana pulque
Conceptos 2010-Nancy I. López
Producción de etanol
Heteroláctica
Embden Meyerhoff
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
Zymomonas mobilis
Entner-Doudoroff
Homoetanologénica
Conceptos 2010-Nancy I. López
TOXICIDAD DEL ETANOL A LAS CÉLULAS BACTERIANAS
Efecto citotóxico es la razón por la cual se puede usar como desinfectante y
preservante.
Desventaja en procesos fermentativos
Citotoxicidad desde efectos reversibles a muerte celular
Efectos: alteraciones en metabolismo de fosfolípidos y de ácidos grasos
Membrana principal blanco
Costo en el proceso de fermentación: disminución de tasa de producción
a medida que el producto se acumula
Organismo a utilizar tolerar altos
niveles de etanol para producción a escala
industrial
Conceptos 2010-Nancy I. López
Alternativas a combustibles fósiles
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos
2010-Nancy I.de
López
Primera
generación
bioetanol
BIOETANOL
Estrategias:
cambio de materias primas
Segunda generación de bioetanol
Conceptos 2010-Nancy I. López
Productos de fermentación Zymomonas vs. Levaduras
Pathway
ENZIMA CLAVE
ETANOL
Lactic Acid
CO2
ATP
Embden-Meyerhof
Saccharomyces
fructose 1,6-diP aldolase
2
0
2
2
Entner-Doudoroff
Zymomonas
KDPG aldolase
2
0
2
1
Conceptos 2010-Nancy I. López
Microorganismos utilizados en biotecnología
Biotecnología de Organismos
• Se puede trabajar con organismos intactos y sus células
• Se utilizan organismos que NO tienen modificaciones
introducidas por ingeniería genética. Se analizan y utilizan las
variaciones genéticas naturales.
• Se optimizan las condiciones de producción y crecimiento
Biotecnología Molecular
• Se cambia la información genética del organismo
• Se puede alterar la estructura o partes de la células
• Involucra técnicas de ingeniería genética
• Da como resultado organismos recombinantes
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
Otros microorganismos
Entner-Doudoroff
Escherichia
y otras entéricas
KDPG aldolasa
PDC
ADH
pet operon
Conceptos 2010-Nancy I. López
Recombinantes E. coli con
operon para producción de
etanol de Zymomonas
MANIPULACIONES GENÉTICAS PARA INCREMENTAR LA
PRODUCCIÓN DE ETANOL
Promotor
pdc
Plásmidos
adh
Genes
recombinantes
Cromosoma
No pueden usar pentosas eficientemente
Menos susceptible a manipulaciones genéticas
Diferentes requerimientos
de O2 durante crecimiento y producción de etanol
Conceptos 2010-Nancy I. López
E. coli etanologénica
Hexosas y pentosas
Conceptos 2010-Nancy I. López
BIODIESEL
Biocombustible que se obtiene a partir de aceites vegetales
o grasas animales, mediante procesos industriales de esterificación y
transesterificación, dando metil ésteres de ácidos grasos y etil ésteres de
ácidos grasos (FAME o FAEE).
Aceite vegetal
Glicerol
Conceptos 2010-Nancy I. López
FAME o FAEE
Biodiesel
Microdiesel: Escherichia coli
Combinación de formación de etanol y posterior
esterificación de etanol con ácidos grasos para dar etil oleate o etil palmitate y etil palmitoleato.
Expresión in E. coli of the Zymomonas mobilis
piruvato decarboxilasa y alcohol
deshidrogenasa y aciltransferase de
Acinetobacter baylyi strain ADP1.
Compuestos equivalentes al
biodiesel
Kalscheuer et al. Microbiology (2006), 152, 2529–2536
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Microdiesel
/o
etanol
Biodiesel
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos primarios- Ácidos y solventes
PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS
Acido Cítrico
• Buen conservante y antioxidante natural que se añade
industrialmente como aditivo en el envasado. Saborizante,
gusto ácido frutal. Plastificante: disminuye la espuma en
fabricación de resinas.
• Aspergillus niger es el mejor productor en presencia de Fe+3.
Producción industrial 1917. Pfizer.
• Ciclo de Krebs. Ingeniería metabólica.
• Quelante de Al3+. Plantas que expresan niveles elevados de
citrato sintasa bacteriana.
• Se obtiene citrato de una concentración de 98.3g/l, mezclado
con ác. Isocítrico.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
ACIDO CÍTRICO Y SU FORMA
IONICA QUELADA CON Fe(III)
CINÉTICA DE LA
FERMENTACIÓN DEL
ACIDO CÍTRICO
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos primarios- Ácidos y solventes
Acidos- ácido acético
Saccharomyces cereviseae o Zymomonas mobilis
(1)
Etanol
Bacterias del ácido acético (AAB): Acetobacter, Gluconobacter
(2)
Conceptos 2010-Nancy I. López
Cepa a utilizar
•Tolerar alta concentración
de ácido acético
•Mantener alta productividad
•No sobreoxidarlo
•Bajos requerimientos
nutricionales
BACTERIAS DEL ÁCIDO ACÉTICO
Metabolismo primario especial a bajo pH
16S rRNA agrupadas en las α-Proteobacterias
Gram (-). Bacilos. Algunos producen pigmentos
Acetobacter
Gluconobacter
Gluconoacetobacter
Aerobios obligados. Mesófilas: oxidan en forma incompleta etanol dando
ácido acético como producto principal.
No han sido adecuadamente caracterizadas. Dificultad de crecerlas en
medios semisólidos.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Oxidación de etanol a ácido acético
Conceptos 2010-Nancy I. López
Tolerancia al ácido
En ausencia de etanol
TCA
Gluconobacter TCA no funcional
Conceptos 2010-Nancy I. López
CO2
Activación irreversible
Reprimido en presencia de
etanol
Métodos de producción industrial del vinagre
Método Orleans
Barril con vinagre fresco (1/4 del vol). Proporciona el
inóculo de Acetobacter y Gluconobacter. Se añade la
bebida fermentada que se usará para preparar vinagre.
Barril abierto 02. Duración: varias semanas. Eficiencia:
depende de la disponibilidad de 02.
Método de goteo (Alemán)
Contacto de las bacterias con el alcohol haciendolo circular
por cámara de madera rellena con viruta Proceso continuo.
Aparato: “generador de vinagre”. Aire entra por parte inferior
del generador. Vida útil larga. Producto final sin bacterias
por fijación de éstas a las virutas.
Método de burbujeo
Proceso de fermentación sumergida burbujeo de
aire. Se regula la velocidad de adición del alcohol.
Conversión muy eficiente del alcohol al ácido (llega a
98%). Desventaja: hay que filtrar el vinagre para
eliminar las bacterias.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Tolerancia al ácido
Ciclo de glioxilato y ciclo de Krebs
Citrato sintasa
Aconitasa
Conceptos 2010-Nancy I. López
Bombas de eflujo
USOS
Acido ascórbico (vitamina C) Bioconversiones
Celulosa
Conceptos 2010-Nancy I. López
ÁCIDO LÁCTICO
Bacterias lácticas
Gram positivas, no esporuladas, cocos o bacilos, catalasa negativa
Metabolismo estrictamente fermentativo de los azúcares produciendo ácido láctico.
Carecen de actividad respiratoria porque carecen de las enzimas de las cadenas
respiratorias. Anaerobios aerotolerantes.
Tienen altos requerimientos nutricionales
Habitantes normales de: productos vegetales, mucosa de animales (incluido el
hombre), leches y productos lácteos.
Toleran la acidez (pH ~ 4-5).
Representantes de varios grupos taxonómicos:
Lactobacillus
Lactococcus
Streptococcus
Leuconostoc
Bifidobacterium
GRAS Bacterias generalmente reconocidas como seguras
Conceptos 2010-Nancy I. López
ACIDO LÁCTICO
Homofermentación: vía
Embden - Meyerhof
Heterofermentación: vía del
ácido-6- fosfoglucónico,
producen además etanol,
acetato y CO2
Conceptos 2010-Nancy I. López
Productos de fermentación homoláctica y heteroláctica
Pathway
Key enzyme
Ethanol
Lactic Acid
CO2
ATP
Embden-Meyerhof
Lactobacillus
fructose 1,6-diP aldolase
0
2
0
2
Heterolactic
Streptococcus
phosphoketolase
1
1
1
1
Homofermentadores 2 veces más biomasa que los heterofermentadores
Conceptos 2010-Nancy I. López
ENZIMA CLAVE
L-lactato deshidrogenasa o
D-lactato deshidrogenasa
Estereoespecificidad
depende del tipo de
organismo
Conceptos 2010-Nancy I. López
PRODUCTOS OBTENIDOS DE LAS
BACTERIAS LÁCTICAS
Usos del ácido láctico
85% con alimentos o aplicaciones relacionadas con
alimentos
15% aplicaciones industriales no relacionadas
con alimentos
ALIMENTOS
Industria láctea
Buen acidificante, saborizante y conservante: pickles, aceitunas, etc.
Inhibidor de desarrollo de bacterias contaminantes de
alimentos envasados: carnes, mayonesa, etc.
Conceptos 2010-Nancy I. López
PROBIÓTICO
Organización Mundial de la Salud (OMS)- Guidelines for the Evaluation of
Probiotics in food, 2001-: un probiótico es todo aquel microorganismo
vivo que, administrado en la cantidad adecuada, proporciona beneficios
saludables al receptor.
FAO (Food and Agriculture Administration): “microorganismos vivos que
ejercen una acción benéfica sobre la salud del huésped al ser
administrados en cantidades adecuadas”.
Otra definición posible es: “alimentos susceptibles de producir un efecto
benéfico sobre una o varias funciones específicas del organismo, más
allá de los efectos nutricionales habituales, de mejorar el estado de salud
y de bienestar y/o de reducir el riesgo de una enfermedad”.
Bacterias probióticas: carácter GRAS (“Generally Regarded As Safe”)
Lactobacillus (ppalmente. L.acidophilus y L. casei) y Bifidobacterium
Conceptos 2010-Nancy I. López
Producción de ácido láctico
Fermentación láctica: Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus lactis
Conceptos 2010-Nancy I. López
Producción de ácido láctico
Abaratamiento de costos de producción: desechos agroindustriales
como sustrato
Conceptos 2010-Nancy I. López
Desarrollos cientí
científicos del CONICET
Lactobacillus casei
Lactobacillus acidophillus
SanCor BIO
CONICET (CERELA)
SANCOR
BioFlora (probióticos)
CONICET (CERELA – PROIMI)
BIOSIDUS S.A.
Convenio firmado con la provincia de Tucumán para el
“Programa Probiótico Social”. Provee un yogurt
probiótico a 56.000 niños de 56 escuelas del Gran San
Miguel de Tucumán.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Otros usos del ácido láctico
Cosmética: capacidad de retener agua (buen humectante)
Etil-lactato tratamientos anti-acné
Inhibe producción de tirosinasa tratamiento de piel
(rejuvenecimiento)
Farmacéutica
Textil y cuero: como acidificante.
Química
Presencia de 2 grupos reactivos funcionales
hace que sea un monómero adecuado para conversiones
Químicas: ácidos como propiónico, acético y acrílico.
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Usos
Conceptos 2010-Nancy I. López
Ácido poliláctico (PLA)
Polímero constituido por moléculas de ácido láctico, con propiedades semejantes
a la del Politereftalato de Etileno (PET, tereftalato de polietileno) que se utiliza
para hacer envases, pero además biodegradable.
diláctico
Conceptos 2010-Nancy I. López
BIOTECNOLOGIA MICROBIANA
Tres categorías de productos microbianos de
importancia industrial
• Metabolitos primarios
• Metabolitos secundarios
• Enzimas
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos secundarios
• Moléculas complejas (pero no en tamaño)
• Participan de caminos metabólicos no esenciales,
confiriendo capacidades de supervivencia en situaciones
anormales. Muy variados, síntesis y estructuras
fuertemente dependientes de especie, variedad, tipo.
• Generados en condiciones muy particulares
• Fuertemente regulados, concentraciones más bajas que
metabolitos primarios, la sobreproducción requiere alterar
la regulación primaria y secundaria, screening por
criterios de actividad.
• Son más valiosos y complicados de producir.
• Sustancias bioactivas pueden ser utilizadas en la
naturaleza para distintas cosas
• Metabolitos 2rios. Forma de diferenciación fisiológica.
Distintas características que la diferenciación
morfológica.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos secundarios
Compuestos microbianos de uso medicinal
• En 1928 Alexander Fleming descubrió el primer antibiótico.
• Observó que el hongo Penicillium producía un antibiótico que
mataba a S. aureus.
Debido a que son metabolitos
secundarios, no esenciales para
el crecimiento de los
microorganismos que los
producen, las condiciones para
la producción de antibióticos
deben ser controladas
Conceptos 2010-Nancy I. López
•1940s
(2º guerra
mundial): La
penicilina fue
probada
clínicamente y
producida
industrialmente.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Algunos metabolitos secundarios (Idiolitos)
producidos por bacterias
Antibióticos Antibacterianos
Antifúngicos
Antivirales
También
Antitumorales
Antiparasitarios
• Otros compuestos:
antipenicilinasa
sideróforos
pesticidas
Conceptos 2010-Nancy I. López
Antibióticos clásicos
Sustancias químicas producidas por microorganismos que matan o
inhiben el desarrollo de otros microorganismos. Interfieren en algún
paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado.
Antibióticos producidos
por fermentación
a gran escala
Conceptos 2010-Nancy I. López
Búsqueda de antibióticos
Rastreo de nuevas cepas
productoras de
antibióticos
Ensayo en placa
Producción y
análisis de su
estructura
Análisis in vivo
Conceptos 2010-Nancy I. López
Producción y uso
de antibióticos
Conceptos 2010-Nancy I. López
Estrategias
. Biotecnología moderna (Nueva Biotecnología)
Obtención de cepas con alto rendimiento
Manipulaciones genéticas
Mutagenesis
Sobreexpresión
Modificaciones a nivel regulatorio
Dificultades: vía metabólica compleja necesidad
de identificar gen clave: ciencia básica
. Búsqueda de nuevos compuestos
BIOTECNOLOGÍA AZUL (MARINA)
Conceptos 2010-Nancy I. López
Antibióticos
Clásicos
Carmen Sánchez Rivas
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
Aminoglicósidos
Subunidad 30S
Gram -
Familias de antibióticos
Kanamicina
Estreptomicina
Gentamicina Micromonospora purpurea
Neomicina
Tetraciclinas
ß-lactámicos
Pared celular
Amplio espectro
Cefamicinas
Conceptos 2010-Nancy I. López
Subunidad 30S
Amplio espectro
Macrólidos
Familias de antibióticos
Subunidad 50S
Legionelosis
Eritromicina
Saccharopolyspora erythraea
Genoma completo 2007
Anfotericina B
Streptomyces nodosus
Altera permeabilidad de membrana
Antifúngico
Conceptos 2010-Nancy I. López
Glucopéptidos
Vancomicina
Amycolatopsis orientalis
Rifamicinas
Lincomicina
Mecanismo similar a eritromicina
Familias de antibióticos
Conceptos 2010-Nancy I. López
Cloranfenicol
Amplio espectro
El antibiótico más potente que se conoce
Tienamicina
Streptomyces cattleya
Amplio espectro
Gram – y Gram +, aerobias y anaerobias
Resistencia a ß-lactamasas
Carbapenem ß-lactámicos no convencionales
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
Conceptos 2010-Nancy I. López
Resistencia a antibióticos
Mutaciones en el genoma del huésped o en algún elemento
asociado:
. Eliminación del transporte del AB
. Destrucción o modificación del AB
Capacidad de transferir esa
. Expulsión fuera de la célula
modificación
. Modificación del blanco
Conceptos 2010-Nancy I. López
Búsqueda de nuevos antibióticos
¿Por qué?
. Resistencia del patógeno
. Evolución de nuevas enfermedades
. La toxicidad de algunos de los compuestos aprobados
Conceptos 2010-Nancy I. López
Otros compuestos bioactivos
Agentes antitumorales
Actinomicina D
Mitomicina
Bleomicina
Antraciclinas
Neomicina inhibe fosfolipasa C
Inhibidores de enzimas y quelantes
Ácido clavulánico inhibidor de ß-lactamasas
Streptomyces clavuligerus
Acarbosa inhibidor intestinal de α-glucosidasa en diabetes e
hiperlipoproteinemia
Actinoplanes sp. SE50
Desferal (sideroforo) Streptomyces pilosus
Enfermedades del hierro (hemocromatosis) y alta carga de Al en
pacientes de diálisis.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Otros Usos
Conservación de alimentos
Nisina: Péptido policíclico
Bacteriocina
Lactococcus lactis
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Antiparasitarios
Avermectinas: metabolitos secundarios producidos por
Streptomyces avermitilis. Son derivados de lactonas macrocíclicas.
Antihelmínticas y contra artrópodos parásitos del ganado. Interfieren
con la neurotransmisión
Monensina: coccidiasis provocada por protozoo
(Eimeria). Streptomyces cinnamonensis.
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METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR
BACTERIAS ENTOMOPATÓGENAS
Bacillus thuringiensis
Cristales
Produce durante la esporulación un cristal de proteínas (cuerpo paraesporal)
denominado delta endotoxina. Tóxica para algunos insectos principalmente
coleópteros, lepidopteros y dípteros.
Clasificación por forma del cristal o por espectro de acción (Cristales tipo
Cry I son tóxicos para lepidópteros, los Cry II son tóxicos para lepidópteros y
dípteros, los tipo Cry III son tóxicos para coleópteros y los Cry IV son tóxicos para dípteros).
Mecanismo de acción
Incorporación de genes en plantas:
algodón, maíz, soja y arroz.
B. popillae
B. sphaericus
B. morati
Conceptos 2010-Nancy I. López
Bacillus thuringiensis produce también zwittermicina que
actúa sinérgicamente con Bt-toxina
Aminopoliol. Representa nueva clase de antibióticos. Biosíntesis particular
en la que interviene PKS/NRPS
Conceptos 2010-Nancy I. López
Peptidos no ribosomales y poliquetidos
Conceptos 2010-Nancy I. López
Bacterias entomopatógenas como nuevas
fuentes de metabolitos secundarios con
potenciales aplicaciones biotecnológicas
Pseudomonas entomophila
Mata insectos de diferentes órdenes
sideróforos/pioverdinas
Enterobacteriaceae
Xenorhabdus
Photorhabdus
Asociación con nematode entomopatógenos
Mutualismo
Son patógenos de diferentes insectos
Bode; H.B. 2009.Currrent Opinion in Chemical Biology., 13:224-230.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Photorhabdus
Genoma 6.5% del total (23 grupos de genes biosintéticos de metabolitos
Secundarios)
Xenorhabdus
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos secundarios
BIOTECNOLOGÍA AZUL: MARINA
Productos marinos microbianos
Ambientes marinos consisten de comunidades microbianas complejas
y muchos invertebrados están asociados con bacterias epibiontes
y endobiontes
Muchos invertebrados (ej. Esponjas) producen compuestos bioactivos
Bacterias marinas importante fuente para descubrimiento de nuevas drogas.
Metabolitos 2rios. con propiedades citotóxicas de particular interés para el
desarrollo de agentes anticancerígenos.
Conceptos 2010-Nancy I. López
BIOTECNOLOGÍA AZUL: MARINA
Macroorganismos baja abundancia, baja concentración
del compuesto de interés.
Bacterias alto potencial debido a la posibilidad de
producción biotecnológica.
Actinomycetes Salinispora produce salinisporamida A
inhibidor del proteasoma 20S
Cyanobacteria
Compuestos son péptidos modificados o híbridos
péptidos-poliquétidos.
Conceptos 2010-Nancy I. López
Metabolitos secundarios
BIOTECNOLOGÍA AZUL: MARINA
Descubrimiento
de nuevos
compuestos
bioactivos de
bacterias marinas
Largazole: macrólido
Cianobacterias
Agentes antitumorales
Conceptos 2010-Nancy I. López
Descubrimiento de nuevas capacidades bacterianas- Utilidad en
biotecnología?
Comunicación en bacterias
Tienen complejos sistemas de comunicación. Ellas pueden “hablar” entre ellas
cooperar y colaborar.
COMUNICACIÓN QCA.
MOLÉCULAS SEÑAL
Poblaciones bacterianas
Pequeñas: pocas moléculas señal.
Grandes: se incrementa la cantidad de moléculas.
Una vez alcanzado un umbral se encienden mecanismos celulares a través de la
población que resultan en una acción de conjunto.
QUORUM SENSING.
•
•
•
•
Comportamiento de una población compuesta por células análogo al comportamiento
de organismos multicelulares.
Sistemas extendidos participan en distintos procesos fisiológicos en mares y agua
dulce. Crucial para el éxito de las bacterias.
Controla 5-25% de los genes en los genomas bacterianos.
Ayuda a mantener biofilms. Importante para controlar y entender el “biofouling”
Procesos tan diversos como fijación de N2 o generación de luz en órganos luminosos
de peces de profundidad.
Conceptos 2010-Nancy I. López
COMUNICACIÓN ENTRE BACTERIAS Y ORGANISMOS
SUPERIORES?
•
Formas reproductivas nadadoras de Ulva utilizan QS de bacterias para
seleccionar una superficie adecuada para fijarse y crecer. En este caso el éxito
de un organismo superior depende de su capacidad de detectar y responder a
las “conversaciones bacterianas”
Biotecnología “Biofouling”: problemas en barcos y otras estructuras
marinas ocasionan grandes pérdidas económicas y contaminación
del ambiente
Marine Biotechnology at Plymouth Marine Laboratory (UK)
Control biológico?
Zoosporas
Ian Joint, Plymouth Marine
Laboratory,,Prospect Place, Planet
Earth, spring 2005, pp30-32.
Conceptos 2010-Nancy I. López