2. Membrana mecanismos de transporte 2014.pdf

MEMBRANA PLASMATICA
7.5 nm
MEMBRANA PLASMATICA
eritrocito: tinción con
tetróxido de osmio
3-4 nm
S
S
G < 0
S > 0
LIPIDOS DE MEMBRANA:
-Fosfoglicéridos
-Esfingolípidos
- Glucolípidos
-Colesterol
Fosfolípidos
Moléculas anfipáticas.
2 colas hidrocarbonadas
+ 1 cabeza polar.
Tridimensionales
Molécula fundamentalmente no polar y plana
LIPIDOS DE MEMBRANA
Fosfoglicéridos: fosfatidiletanolamina
Polar
No Polar
LIPIDOS DE MEMBRANA
fosfoglicéridos
fosfatidiletanolamina
fosfatidilcolina
fosfatidilserina (-)
fosfatidilinositol (-)
LIPIDOS DE MEMBRANA
Esfingolípidos: esfingomielina
(o etanolamina)
Polar
No Polar
LIPIDOS DE MEMBRANA
Un tipo particular de esfingolípidos son los glicolípidos, también derivados de
la esfingosina, pero que poseen un mono o oligosacárido reemplazando a la
función fosfato-X.
Esfingosina
Esfingomielinas
(colina o etanolamina)
glucosilcerebrósido
(glucolípido)
Galactocerebrósido
Gangliósido
(NANA : ácido siálico)
LIPIDOS DE MEMBRANA
colesterol
y esfingomielina
y fosfatidiletanolamina
ASIMETRIA DE LÍPIDOS
EN LA MEMBRANA
Eritrocitos humanos
La distribución de fosfolípidos en
la cara interna y externa es
asimétrica
Flipasas
Escramblasas
Transportadores
ABC
Translocan
aminofosfolípidos (PS;
PE) desde exofacial
hacia citofacial
Translocan fosfolípidos al
azar
Translocan fosfolípidos
desde citofacial a
exofacial
TPL fosfolipido total
SM esfingomielina
PC fosfatidilcolina
PE fosfatidiletanolamina
PS fosfatidilserina
ASIMETRIA DE LÍPIDOS EN LA MEMBRANA
Flipasa
dependiente
de ATP
(PE y PS)
Flopasa
ESPESOR DE LA MEMBRANA
El número de carbonos del ácido graso afecta el espesor
de la membrana.
El colesterol restringe la fluidez de la membrana
rigidizando las cadenas y aumentando espesor.
PROTEINAS DE MEMBRANA
• Periférica
• Integrales (incluye transmembrana)
• Ancladas a membrana
PROTEINAS DE MEMBRANA
Proteínas integrales
índices de hidrofobicidad de la cadena amino-acídica
de las proteínas integrales de membranales
20-30 aa
en α-H
PROTEINAS DE MEMBRANA
Proteínas integrales -Transmembrana
–Topología- RECEPTORES -
PROTEINAS DE MEMBRANA
Proteínas integrales –topología
- CANALES LOS CANALES SON PROTEÍNAS
INTEGRALES COMPUESTAS POR N
SUBUNIDADES DE n PASOS
TRANSMENBRANA CADA UNA
Proteínas integrales –topología - CANALES LOS CANALES SON PROTEÍNASINTEGRALES COMPUESTAS
POR N SUBUNIDADES DE SEIS PASOS TRANSMENBRANA
Canal de K+
Canal de Na+
PROTEINAS DE MEMBRANA
Proteínas integrales -Transmembrana
–Topología- transportadores -
Transportador de glucosa Glut 1
FLUIDEZ DE MEMBRANA: EL ‘MOSAICO FLUIDO’
“Las membranas celulares se postulan como
soluciones bidimensionales de proteínas globulares
orientadas y lípidos”
(1972) Science 175:720
FLUORESCENCIA
MODELO DE SINGER:
-La difusión bidimensional de compuestos (proteínas, lípidos) de
la membrana puede evaluarse marcando a estos compuestos con
sondas fluorescentes.
-Se determina la migración de estas sondas en el espacio en
función del tiempo utilizando técnicas de microscopía de
fluorescencia por imágenes.
- Dicha migración bidimensional es función de la fluidez de la
membrana.
Fluidez de la membrana
Experimento de Frye &
Edidin, 1970
(apoya al modelo de Singer)
Fluidez de la membrana
Los lípidos forman una interfase fluida, donde cada
fosfolipido experimenta difusión lateral, movimienos de
flexión, rotación y flip-flop (mediante flipasas,
escramblasas).
Fluidez de la membrana
-Importancia de la fluidez de membrana
. actividad de enzimas, transportadores, etc
. permeabilidad de la bicapa.
-Variables que modifican fluidez
. Temperatura (cambio de fase)
. Largo de cadenas de ácidos grasos
. Ácidos grasos insaturados
. colesterol
. Proporción de glicolípidos
FLUIDEZ DE LA MEMBRANA: dependencia con la composición
El grado de saturación de los carbonos afecta
el empaquetamiento de los lípidos y por lo
tanto la fluidez de la membrana
Otra variable importante es el contenido de
colesterol, que tiende a disminuir la fluidez.
FLUIDEZ DE LA MEMBRANA: dependencia con la temperatura
(Viscosidad, rigidez)
Adaptacion de la membrana en ectotermos
(○) 23º C
(●)8º C
Lagerspetz y Laine. Molec Physiol 6: 211, 1984.
FLUIDEZ DE LA MEMBRANA: dependencia con la temperatura
Adaptacion de la membrana en ratones newborns
(●) 2 meses
(○) 1- 3 dias
Lagerspetz y Laine. Ontogenez, 1984.
Dependencia de la permeabilidad de membrana con la temperatura
Fluidez de la membrana - Dependencia
con la temperatura - transición de fase
desnaturalización
Flujo de 45Ca
Actividad ATPasa
Inesi et al. J Mol Physiol 81: 483 (1973). Vesículas de RS de conejo. SERCA.
Fluidez de la membrana - Dependencia con la temperatura - transición de fase
Phillipson y col,
debajo de T crítica
Fase gel
Alto grado de ordenamiento,
mayor espesor de la bicapa,
interacciones de Van der Waals
e hidrofóbicas y menor
permeabilidad.
arriba de T crítica
Fase líquidocristalina
Poco orden interno, menor espesor
de la bicapa, interacciones
hidrofóbicas solamente y mayor
permeabilidad.
Fluidez de la membrana
El experimento de Frye &
Edidin que apoyaba al
modelo de Singer habia
concluido que la fluidez de
la membrana era
prácticamente total.
¿era así realmente?
Fluidez de la membrana
FRAP, recuperación de la fluorescencia luego de la decoloración
Se utiliza para calcular D.
La recuperación es parcial!
Fluidez restringida!
Hay restricciones (barreras) para la
difusión lateral libre de compuestos en la
membrana celular.
¿Cuál es el origen de dichas restricciones?
LA DIFUSIBILIDAD DE LOS COMPONENTES DE MEMBRANA SE
VE RESTRINGIDA POR:
- UNIONES ESTRECHAS (TIGHT JUNCTIONS) QUE
FORMAN DOMINIOS CELULARES (EJ. CELULAS
EPITELIALES). POLARIDAD CELULAR.
- CITOESQUELETO
- LIPID RAFTS
¿Qué puede contener un dominio lipídico
(lipid raft) para que sea estable y menos
fluido que el resto de la membrana?
LIPID RAFT
glicolípidos
esfingolípidos
colesterol
Estructura ordenada de baja fluidez - Resistencia a detergentes
Flujos a través de la membrana
Composición de la solución intra y extracelular
(medio intr.)
Ca2+
1 . 10 -4
(plasma
o medio extr.)
1-2
FLUJOS A TRAVES DE LA MEMBRANA
Difusión Simple
Difusión Simple + Transporte
PrincipalmenteTransporte
Solamente Transporte
Proteínas, compuestos
grandes y polares
Exocitosis/Endocitosis
FLUJO DE H2O
El transporte de agua a través de las membranas biológicas es
siempre pasivo
• bicapa - moderada permeabilidad
• acuaporinas - canales selectivos
Acuaporina 1
OSMOSIS
gradiente de concentración,
la membrana es impermeable al
soluto pero permeable al agua
se produce un movimiento neto
de agua hasta alcanzar el
equilibrio
La ósmosis es el flujo del solvente hacia el compartimento con mayor
concentración del soluto.
S. XIX
OSM = [M1 + M2 + …]/ l soluc
M : concentración molar de partículas
π es una prop. coligtaiva
- Pfeffer: presión osmótica proporcional a [soluto]
- Hugo de Vries
Sn Ext. Isosmótica
Sn Ext. Hiposmótica
(Turgencia)
Sn Ext. Hiperosmótica
OSMOSIS
En Fisiología Animal  Tonicidad:
osmolaridad de una solución respecto del plasma.
Isotónico: osmolaridad igual al plasma.
Hipertónico: osmolaridad mayor que la del plasma.
Hipotónico: osmolaridad menor que la del plasma.
OSMOSIS
OSMOSIS
La presión osmótica (π) equivale a la presión que se
debería ejercer para evitar el flujo del solvente.
Ph = δ g h
h
En el equilibrio: π = Ph
Expresión de van’t Hoff
Δπ = R . T . ΔOSM
OSM = [M1 + M2 + …]/ l soluc
M : concentración molar de partículas
π es una prop. coligtaiva
membrana permeable al agua y a los solutos
π?
π = 0
membrana permeable al agua y a los solutos
π = 0
OSMOSIS
¿Que pasa si la membrana es permeable al agua, y
tiene además permeabilidad selectiva para ciertos
solutos?
Que ocurre?
○ permeable
● impermeable
Osm1= Osm2
π1 = π2
[o]1 > [o]2
La célula mantiene osmolaridades iguales en sus medios extra
e intracelular gracias a sistemas activos de transporte.
Considerando la moderada permeabilidad de la membrana al H2O
¿Cómo se producen flujos masivos de H2O cuando se somete a las células a
cambios bruscos de osmolaridad (y de volumen) dentro de un rango
fisiológicamente compatible con la vida de la célula?
Túbulo colector del riñón, algunas células epiteliales
vol
Shock
hiposmótico
RVD (regul.vol.decrease)
KOaqp
t
Peter Agre (premio Nobel 2003)
Acuaporina 1
PORO ACUOPORINA: 3 A
MOLECULA H2O: 2.8 A
3.109 MOLECULAS de H2O POR MONOMERO X SEG
FLUJO DE SOLUTOS
• Difusión simple
FUJO PASIVO
• Difusión a través de canales
(no necesitan E?)
• Transporte facilitado
• Transporte activo primario
FUJO ACTIVO
• Transporte activo secundario
En la movilizacion pasiva de los iones intervienen dos fuerzas
impulsoras, C y V, pero para compuestos no cargados
solamente C .
μ = C + V
+
V
C
- +
+
+
+
+
+
+
+
Dichas fuerzas pueden……….
Actuar en = dirección
oponerse
Obedeciendo a estas furezas los compuestos pueden atravesar la membrana
pasivamente por difusión simple, por canales, o carriers
Dif Simple
…. u oponiéndose a dichas fuerzas, los compuestos pueden pasar
activamente por bombas, como por ejemplo la Na/K ATPasa
Resumiendo ……..
V
TRANSPORTE PASIVO
A FAVOR DE GRADIENTE
ESTOS FLUJOS SE COMPENSAN
MANTENIENDO UN ESTADO ESTACIONARIO
TRANSPORTE ACTIVO
CONTRAGRADIENTE
En equilibrio termodinámico: sistema en un mínimo de E.
2
1
1
ESTADO DE EQUILIBRIO
2
Una vez alcanzado el equilibrio no hay entrada ni salida de E. ΔG = 0
Pero un ser vivo es un Sistema Abierto en Estado Estacionario
materia
energía
(química)
SER VIVO
Q
Estado Estacionario
ΔG < 0
B
A
Q
bomba
E. Química
J tot de sust difusible = 0
FLUJO DE SOLUTOS
Transporte pasivo – Difusión Simple
(no requiere energía metabólica)
Flujo de moléculas a través de una membrana: número de
unidades de masa de moléculas que atraviesa una dada superficie
(ej 1 μm2) en una unidad de tiempo (1 segundo).
Ley de Fick
J = -D dC/dx
D: coeficiente de difusión en μm2 / s;
dC: diferencia de concentración en Molaridad
x: distancia en que se establece dicho dC.
J (mol / s . μm2)
Para Difusión simple de compuestos permeables
en membrana (gases, agua, etc)
T2>T1
J = -D dC/dx
J
T2
T1
x (de membrana)
C1
pendiente: P
C2
J = P C
C
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
Transporte pasivo
(no requiere energía)
Transportadores (transporte facilitado)
Canales
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
(Voltaje dependiente)
Canales iónicos
Canal de K+
• Selectividad: especie iónica determinada (Na+, K+, Cl-, etc)
• Compuerta: abierto - cerrado
• Sensor: sensible a ligando, o a voltaje, o a otro estímulo.
Canal de Na+
Sensor de voltaje
S4
“Loop” que forma la
boca del poro
Si lo vemos desde arriba …
Loop S5-S6
Sensor de
voltaje
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
Transportadores: transporte facilitado
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
transportadores
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
Cinética
difusión simple o
por canales
difusión facilitada
por carriers
¿Por qué se satura?
Los transportes pasivos ya sean simples
o facilitados utilizan la E del μ.
Pero si la célula tuviera solamente
mecanismos de transporte pasivo, que
pasaría?
TRANSPORTE ACTIVO PRIMARIO DE SOLUTOS
Bomba Na+/K + ATPasa
Transporte Activo
Bomba Na/K : sistema que permitió obtener los conocimientos iniciales
E qca  E potencial (gradiente)
cpm captados por las células
Dependencia con el metabolismo  Transporte Activo
Se midió velocidad de
captación de K+ radiactivo
en glóbulos rojos
tiempo
R. Whittam. J. Physiol. (1958) I40, 479-497
Se realizó a distintos tiempos
luego de inhibir metabólicamente a las células
En glóbulos rojos:
Influjo de K+: Jmax = 2 mmol/l cell/hora
K0.5= 2 mM
Glynn, J. Physiol. (I956) I34, 278-3IO
Eflujo de Na+: Jmax = 5 mmol/l cell/hora
K0.5= 11 mM (otro paper)
Glynn y col J. Physiol. (1970), 207, pp. 371-391
SISTEMA ASIMÉTRICO
Na+i + K+o
ATP
Na+o + K+i
ADP + Pi
Definir Estequiometría del sistema:
Post y Jolly (Biochem Biophys Acta 25: 118 (1957)
Flujos unidireccionales activos de Na y K
Influjo K/ eflujo Na = 0.66  0.02 = 2/3
3 Na+i + 2 K+o
SISTEMA ELECTROGÉNICO!!!
3 Na+o + 2 K+i
+
Estequiometría para el ATP
Whittam y Ager, Biochem J 97: 214 (1965)
[Na]i
(mM)
Act. ATPásica
ouabaína
sensible
Influjo K
ouabaina
sensible
(umols/ml
cells.hora)
(umols/ml
cells.hora)
Infl K
Act ATPasica
12
0.8
1.8
2.3
18
1.6
2.8
1.8
31
2.0
4.3
2.1
100
2.0
4.2
2.1
3 Na+i + 2 K+o
1 ATP
Fluyen 2 K por cada
ATP hidorlizado
3 Na+o + 2 K+i
1 ADP +1 Pi
- Sachs y Welt 1967: definen cooperatividad del sistema.
Las curvas de flujo son claramente sigmoideas
- Simultaneidad: Na y K se transportan de manera simultánea.
-Reversibilidad: Se puede inducir la síntesis de ATP invirtiendo los flujos de
Na y K (a favor de gradiente). ESTO NO ES FISIOLÓGICO.
- Post y col (JBC 240: 1437, 1965; JGP 54:306, 1969): analizan al sistema
como a una ATPasa activada por Na y K y concluyen que:
Actividad quinasa dependiente de Na (autofosforilacion):
ATP + E
EP + ADP
Na y Mg
Actividad fosfatasa dependiente de K:
EP + H2O
Pi + E
K y Mg
TRANSPORTE ACTIVO PRIMARIO DE SOLUTOS
Bomba Na+/K + ATPasa
Retículo endoplásmico
(SERCA)
2
TRANSPORTE ACTIVO SECUNDARIO
cotransportador
GRADIENTE
Intercambiador o
contratransportador
TRANSPORTE ACTIVO SECUNDARIO
Symport (o cotransporte)
Na+/glucosa
Na
Ca
Na
Na
Na
Ca
Na
Na
Na
Na
Ca
Na
3 Na+
Ca
1 q+
Ca
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Ca
1 Ca++
Na
Antiport
(Contratransporte)
Intercambiador Na/Ca
Na
SISTEMA ELECTROGENICO
Y REVERSIBLE
ACOPLE ENTRE TRANSPORTE ACTIVO PRIMARIO Y SECUNDARIO
¿Cuáles son las diferencias entre los canales y los
transportadores?
 Los transportadores son fácilmente saturables mientras que los
canales no (10 x 106 Na+/seg atraviesan UN SOLO CANAL
sensible a acetilcolina).
 Los transportadores mueven solutos a traves de un cambio
conformacional de la proteína, mientras que los canales poseen un
poro hidrofílico.
 En muchos casos los transportadores movilizan solutos en contra
de sus gradientes electroquímicos utilizando directamente o
indirectamente la energía de hidrólisis del ATP. Los canales siempre
movilizan sustancias en forma pasiva a favor de gradiente.
TRANSPORTE TRANSEPITELIAL
Absorción de sodio
Es fundamental la polarización de la célula (distribución de bomba)
y el “sellado” de la vía paracelular.
TRANSPORTE TRANSEPITELIAL
Absorción de sodio
H2O
3 Na
3 Cl
Es fundamental la polarización de la célula (distribución de bomba)
y el “sellado” de la vía paracelular.
TRANSPORTE TRANSEPITELIAL
Absorción de glucosa
Es fundamental la polarización de la célula (distribución de transportadores de glucosa)
¿Qué pasa cuando queremos transportar entre el medio
interno y el externo celular compuestos grandes como
proteínas?
¿o si tenemos que liberar en forma masiva un compuesto
grande y/o polar de señalización como una hormona o un
neurotransmisor?
¿o tenemos que reciclar proteínas de la membrana
plasmática?
EXOCITOSIS - ENDOCITOSIS
TRANSPORTE DE COMPUESTOS:
6
3
En Membrana Vesicular:
- PROTEINAS DE MEMBRANA
En Matriz Vesicular:
- COMPUESTOS NO LIPOSOLUBLES
- ALTO PESO MOLECULAR
- PROTEINAS
PUEDE EN CASOS ESPECIALIZADOS
FORMAR PARTE DE COMPLEJOS
MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN
INTERCELULAR.
FISIÓN
FUSIÓN
2
1
5
4
EN MEMBRANA: EXOCITOSIS - ENDOCITOSIS
EN GENERAL:
(FUSIÓN - FISIÓN)
EXOCITOSIS
EXOCITOSIS
SINAPTOBREVINA O VAMP
(V-SNARE)
COMPLEJO SNARE
Membrana plasmática
vesícula
SINTAXINA
T-SNARE
SNAP-25
SNARE: SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) Receptor
ENDOCITOSIS
dinamina
EXOCITOSIS: SECRECIÓN DE SUSTANCIAS
DE SEÑALIZACIÓN
-LA LIBERACION SE PRODUCE EN
UNIDADES DISCRETAS (CUANTOS)
- EL PROCESO SE HALLA
FINAMENTE REGULADO POR
CALCIO
EXOCITOSIS
Imágenes TIRF de exocitosis de gránulos de insulina en celula que expresa sinaptofluorina.
COMPOSICIÓN LIPÍDICA
DE LAS MEMBRANAS
fosfatidiletanolamina
fosfatidilcolina
esfingolípidos
colesterol
otros
CITOESQUELETO
Microtúbulos
fibra
muscular lisa
PROTEINAS DE MEMBRANA
Solubilización
CITOESQUELETO
Fibras intermedias
epitelial
Composición de la solución intra y extracelular
CANALES
Nobel Prize in Chemistry 2003
“for the discovery of
water channels"
Peter Agre
“for structural and
mechanistic studies
of ion channels"
Roderick MacKinnon
FLUJO PASIVO DE SOLUTOS
Canales iónicos
• Selectividad: especie iónica determinada (Na+, K+, Cl-, etc)
• Compuerta: constitutivamente abierto o abierto - cerrado
• Sensor: sensible a ligando o voltaje
EXOCITOSIS
CITOESQUELETO
Microfilamentos - Moléculas de Adhesión
Transportador
de ABC family
Fig. 1. Traditional definition of the various proteins involved in lipid translocation within biological membranes.
Transición gel-líquido cristalino (Tc)