GeneticaInteraccionH-P.pdf
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Genética de la Interacción Hospedante -Patógeno Instituto de Genética “Ewald A. Favret” CICVyA – INTA Castelar Francisco Sacco Héctor Saione Lorena Ingala Majo Diéguez Nanda Pergolesi Micaela López Lara Tapia Martín Darino Melina Velásquez Camila Petignat Roberto Navarro Santiago Lamuedra Virginia Mercante Medio ambiente Hospedante Reacción Resistente-susceptible Enfermedad Patógeno Tipo de infección Patogenicidad Cuali-cuantitativo Virulento-avirulento Roya de la hoja del trigo (roya anaranjada, Puccinia triticina) 0 ; 1 2 3 4 x Escala de Mains y Jackson, donde se establecen distintos grados de resistencia o susceptibilidad de acuerdo al tipo de respuesta del huésped 1 gen 2 genes A a A AA Aa a Aa aa Frecuencias genotípicas 1:2:1 Frecuencias fenotípicas 3:1 AB Ab aB ab AB AABB AabB aABB aAbB Ab AABb Aabb aABb aAbb aB AaBB AabB aaBB aabB ab AaBb Aabb aaBb aabb Frecuencias genotípicas 9:3:3:1 Frecuencias fenotípicas 15:1 GENES R -Interacción directa con avr -Hipótesis de los “guardianes” -Detoxificación de avr -Toxificacion del medio La roya de la hoja del trigo Principales características de esta enfermedad en nuestro país • Históricamente es la principal enfermedad de trigo. Se estiman pérdidas anuales de rendimiento que varían entre un 5-10 % de la producción, según las condiciones ambientales. • El agente productor es el hongo biótrofo Puccinia triticina. Se reproduce a través de esporos microscópicos de origen asexual que se diseminan por el viento. • La enfermedad está determinada por factores genéticos del hongo (genes para patogenicidad) y de la planta (genes para reacción). Descripción de la situación actual • Resulta recurrente que la mayoría de las variedades comerciales se vuelven susceptibles a los pocos años de alcanzar cierta difusión. • En los últimos años la vida útil de los cultivares comerciales se ha acortado sensiblemente en relación a esta enfermedad, siendo una de las principales razones para el recambio de variedades. • Algunas variedades muestran resistencia durable a esta enfermedad. Características de las poblaciones del hongo. • Gran potencial de variabilidad para patogenicidad, que permite una rápida adaptación de formas virulentas. • Enorme capacidad de producción de inóculo que se disemina fácilmente por grandes regiones. Características de las fuentes de resistencia a roya de la hoja. • Genes de resistencia de expresión en plántula provenientes de trigo y especies afines. Son los más conocidos y usados, sin embargo poco efectivos. • Genes de expresión en planta adulta. Poco explotados y la base genética es poco conocida. - Cruzamiento de 2 lineas puras: gen Aa Parentales AA x aa Gametas A y a F1 Aa Gametas ½ A y ½ a F2 A a A AA Aa a aA aa Fenotipos A a Frecuencia 3 1 Raza C2-12 Lr3 p(1:2:1)= Raza 99-28 p(1:2:1)=0.80-0.90 SV1 Resistente Heterozygous Susceptible Resistente 7 11 6 24 Heterocigota 11 31 9 51 Susceptible 5 7 6 18 23 49 21 93 0.30-0.50 93 familias F3 del cruzamiento Sinvalocho X Gama6 testeadas en plántula y hoja bandera con las razas de P. triticina 99-28 y C2-12 . p value (test de independencia) entre SV1 y Lr3 = 0.30-0.50. Race F05 p(1:2:1)=0.90-0.95 SV2 Resistant Heterozygous Susceptible Race 99-28 SV1 Resistant 6 9 8 23 p(1:2:1)= Heterozygous 14 24 11 49 Susceptible 5 12 4 21 25 45 23 93 0.80-0.90 Ninety three F3 families from the cross Sinvalocho X Gama6 were tested at flag leaf stage using P. triticina races F0-5 and 99-28.The p value (independence test ) between SV1 and SV2 genes was 0.50.7. Race F05 p(1:2:1)=0.90-0.95 SV2 Resistant Heterozygous Susceptible Race C2-12 Lr3 Resistant 10 9 5 24 p(1:2:1)= Heterozygous 11 28 12 51 Susceptible 4 8 6 18 25 45 23 93 0.30-0.50 Ninety three F3 families from the cross Sinvalocho X Gama6 were tested at flag leaf and seedling stage using P.triticina races F0-5 and C2-12 respectively. The p value (independence test ) between SV2 y Lr3 genes was 0.30-0.50. Asociar un marcador molecular con un gen de interés A B C D Búsqueda de Marcadores en regiones específicas (responsables de un determinado fenotipo) • RILs • Líneas casi isogénicas (NILs = Near Isogenic Lines) - Retrocruzamientos recurrentes - Subproducto de Mejora • Análisis de bloques segregantes (BSA = Bulk Segregant Analysis) - NILs virtuales • Mapeo por deleción P1 Parentales P2 x Hibrido F1 Líneas Recombinantes homocigotas (RILs = Recombinant Inbred Lines) - Método de descendiente de semilla única (SSD = Single Seed Descendant) Het Población F2 50 % F2 F3 25 % F4 12.5 % F5 6.3 % F6 3.1 % F7 1.6 % F8 0.8 % Línea Recombinante homocigota S R S R R R R S x Líneas casi isogénicas (NILs = Near Isogenic Lines) -Retrocruzamientos recurrentes - Subproducto de Mejora x x x R BSA dominante TT a b c d Parentales tt x P1 a b c d F1 F2 Tt a b c d TT Bloques P2 Tt tt a b c d T- tt Rust resistant F2s Rust susceptible F2s SV G6 M 275b 250b 225b 200b 175b 150b Figure 3: Silver-stained 6% denaturing polyacrilamide gel showing the AFLP pattern obtained with primers P34/M32. SV: Sinvalocho, G6: Gamma 6, M: size marker (25 bp ladder, Promega). The arrow points the polymorphic fragment. Trigo: alohexaploide 3 genomas homeólogos A, B y D - Subgenomas/capacidad buffer Durum TRIGO BM SV D M BM SV D M Localización por genomas BM1 P397M41 P35/M43 Mapeo por deleción S R S AFLPs C-banding A1, B8 34/33b, 34/37, 34/42, 35/38a, 37/35 B8, B9 C14 34/41 34/41 37/42 38/42 34/33a, 34/34 34/31, 34/36, 35/36, 35/38c, 37/39, 37/41, 38/36, 43/32 31/32*, 34/32*, 34/39, 35/31, 35/33, 35/38b*, 35/38d, 35/39, 35/40a, 35/40b, 38/34, 39/34a, 39/34b*, 41/31, 41/35, 41/38, 42/33, 43/40*, 46/31 C12 B11, B12, B13, B14, B15, B16 B1 B1, B3, B5, B6, B7 0 C16 B9, C14 B10, B15, C12 B1, B3, B5, B6, B7, B11, B12, B13, B14, B16 A2, B2, C16 2BL 3BS 2DS 6BL gwm389 gwm261 0.8cM 2.2cM P31/M37 0.5cM P40/M35 P31/M42 0.7cM SV1 P40/M35 0.4cM SV2, P31/M39,P31/M37 16cM gwm533 2.4cM gwm5 1.6cM gwm526 7.4cM 8.3 cM 0.6cM G6 gwm382, barc159 gwm35 P40/M31 12.3cM 0.5 cM gwm317 Lr3 Esquema de los brazos cromosómicos 2DS, 3BS, 2BL y 6BL con los genes de resistencia y sus marcadores asociados. El circulo de color indica el centrómero Lorena Ingala (Tesis Doctoral FCEyN - UBA 2008) Evaluación a campo (condiciones de infección natural) 70 60 50 40 63 30 20 29 10 32 34 38 38 41 17 0 SV1-SV2-G6 SV2-G6 SV1-G6 SV1-SV2 G6 SV1 SV2 ninguno Promedio del número de pústulas por cm2 de las distintas combinaciones de genes de resistencia SV1, SV2 y G6 en 9 ensayos a campo. Se evaluaron en promedio 11 líneas de cada combinación de genes. Mapa fino distancia genética (cM) representa la distancia física (Kb) miles de individuos F2 A a A AA Aa a aA aa Fenotipos A a Frecuencia 3 1 AFLPs: Marcadores dominantes. Buscar bandas asociadas al alelo dominante y detección de recombinantes por presencia de la misma en homocigotas recesivos Microsatélites: Dominantes o codominantes -Lr3 recesivo homocigotas recesivos RESISTENTES a la raza 66 de P. triticina en plántula -SV2 dominante homocigotas recesivos SUSCEPTIBLES a la raza Ca02-γ 1R de P. triticina en planta adulta Mapeo genético de marcadores de AFLP en 195 individuos resistentes a la raza 66 de roya de la hoja (homocigotas recesivos) de una población F2 de Sinvalocho MA x Gamma 6 Centrómero Bin IV P40/M35120 8,3 cM 0,5 cM Bin III P40/M31125, P46/M42310, P37/M44160, P33/M36325 Lr3 Log likelihood = -159.10 Bin II Bin I Telómero María Fernanda Pergolesi (Seminario de Licenciatura FCEyN-UBA) SV2: -Raza Ca02-γ 1R de P. triticina -Dominante -Resistencia en planta adulta -3BS (genoma B 6Gb, Chr 3B 1Gb=2.5x genoma de arroz, aprox 6000 genes) gwm389 P barc75 D gwm285 P not lig cft3530 NP barc87 D gwm493 D cft3296 NP barc92 NT wmc54 NP gwm4181 NT barc101 P not lig wmc69 NT barc75 NP barc102 D wmc78 NP cft3417 P barc133 NP wmc430 NA gwm1034 NT barc147 D wmc500 NT cft4002 NP barc218 D wmc597 NA cft5038 NP cfd79 NT wmc674 NA cft5010 P cfd28 NP wmc754 NA gpw7757 NP gwm72 NP wmc808 NP gwm533 P gwm284 NP gwm285 P not lig cfp54 Gypsy-like + low copy sequence NP cfp132 COPIA WIS + LOW COPY NP cfp55 Gypsy-like + low copy sequence NP cfp3131 Low_copy + LINE NP cfp3132 Low_copy + TRIM NA cfp140 seq telo + LINE ISABELLE D cfp68 copia + cacta D cfp63 Copia-like + LINE NA cfp183 COPIA BARBARA + UNKNOWN NA cfp182 CACTA CASPAR + LOW COPY NP cfp1410 Athila + Low_copy SNP cfp3061 Flanking + Copia NA cfp3062 Unclassified + Low_copy NP cfp3484 Athila + CACTA D cfp1788 Flanking_DNA + CACTA NA cfp37 Copia-like + unknown repeat NP cfp40 CACTA + low copy sequence NA cfp41 Athila + CACTA SNP cfp42 CACTA + low copy sequence NP SSR markers ISBP markers n=341 n=1308 cfp40, STS69 gwm533, STS89 swm13 STS47 0.15 cfp37, cfp41, cfp42 BE499320 cfp5000-cfp5047 cfp3484 cfp3161, cfp3162 gwm533 / swm13 contig 2500Kb gpw7080, cfb5010 cfp1410 wmm1104, cfb5038, glk683, STS94, CA640157 swm13 Recombinantes entre los marcadores flanqueantes: Determinación del punto de crossover F2 swm13 M1 M2 M3 M4 M5 M6 gwm533 1 H H H H H H 0 0 2 H H 1 1 1 1 1 1 3 0 0 0 0 0 H H H 4 1 1 1 H H H H H Ubicación física del gen -BAC= 100-150Kb -Secuenciación -Determinación de ORFs -Validación: transformación, silenciamiento (VIGS), mutación (TILLING), etc Ventajas de la Mejora Asistida por Marcadores Moleculares • No está influenciada por el ambiente • Selección en estados tempranos (embrión, semilla, plántula) • Selección en ambientes sin stress (invernaderos...) • Los heterocigotos son detectables (marcadores codominantes) • Tamaños de población menores • Introgresión por retrocuzas asistidas por marcadores + selección del “background” del padre recurrente por “fingerprinting” Muchas gracias!!!!!!!!