Transcriptomica y Metabolómica II (1).pdf

DISCIPLINAS POST-GENÓMICAS
APLICADAS AL ESTUDIO DE
INTERACCIONES HOSPEDANTE –
PATÓGENO: ANALISIS INTEGRADO
TRANSCRIPTÓMICA Y METABOLÓMICA
PARTE II
Ruth Heinz
Instituto de Biotecnología
INTA Castelar
TRANSCRPTOMICA
MICROARREGLOS
Ventajas:
• tecnología madura, con años de análisis y validaciones
• Procesamiento y comparación simultánea de muchas
muestras en paralelo
• Han sido extensamente estudiados en interacciones H-P
Desventajas:
• Limitados a identificar transcriptos de genes conocidos
• Background puede ser alto por señales inespecíficas
• Señal saturada a altos niveles de expresión génica
TRANSCRIPTÓMICA POR RNA-seq



Se han generado ESTs de 18 especies de
hongos fitopatógeno y 2 Oomicetes,
Estas bases no son completas, no sirven para
análisis cuantitativos.
NGS de segunda y tercera generación estan
empezando a revertir esas falencias
principalmente en hongos.
TRANSCRPTOMICA POR RNA-seq

•
•

•
•
•
Genoma de referencia:
Se mapean las lecturas sobre el genoma de referencia,
utilizando programas de detección de sitios de splicing.
Se pierden sitios no canónicos comunes en plantas, hongos,
oomicetes
Sin genoma de referencia
Ensamblado “de novo”.
Bioinformaticamente mas complejo que secuenciación
Genómica “de novo” .
Requiere normalización de colecciones ADNc antes de la
secuenciación masiva
EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN
FITOPATÓGENOS

•
•
•

•
P. syringae pathovar tomato strain DC3000,
RNASeq por Illumina GA2
30 milliones de lecturas de 32 nucleotidos
Comparación con genoma de referencia arrojaron
algunas discrepancias
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)
dRNA-seq (enriquecimiento en secuencias 5’) y 454
seq, permitió identificar sRNA implicados en el
proceso de virulencia.
Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 5
EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN EL
ESTUDIO DE RELACIÓN H-P
Ploplar Melampsora larici-populina: LCM – 454 pirosecuenciación
Journal of Pathogens
Volume 2011, Article ID 716041, 11 pages
IDENTIFICACION DE FACTOR Avr Ve1 EN
Verticilliun dahliae POR RNA-SEQ
Estrategia de secuenciación genómica de
variantes y RNA seq por ILLUMINA para la
identificación del Factor de Avr Ve1 de
Verticillium dahliae que interactua con el gen R
Ve1 de tomate.
5110–5115 | PNAS | March 27, 2012 | vol. 109 |
no. 13
METABOLÓMICA
•
Disciplina postgenómica que permite
analizar cambios en metabolitos
originados por cambios a nivel
genético, transcriptómico o
proteómico
•
Permite evaluar el efecto de un
transgene en el metabolismo
primario y secundario
•
Recientemente se ha difundido el uso
de varias estrategias de análisis de
metabolitos para el estudio de la
respuesta de plantas a patógenos,
plagas y estreses abióticos
VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA METABOLOMICA
Ventajas
 Dado que los metabolitos constituyen el producto final de la
expresión de los genes, el estudio cuali y cuantitativo de la
composición metabólica de un organismo permite identificar la
función de muchos genes.
 Permite conocer el estado metabólico de un organismo
La metabolómica constituye la herramienta más informativa a
nivel funcional entre todas las tecnologías ‘omicas’
Limitantes
 Incapacidad de estudiar el exhaustivamente todo el metabolismo
 limitaciones técnicas, complejidad química del metabolismo,
variabilidad de los organismos.
TECNOLOGÍAS UTILIZADAS PARA ESTUDIOS
METABÓLICOS
Para obtener un perfil metabólico completo, es necesario el uso de
diferentes tecnologías:
• IR Espectroscopía Infrarroja
• FTIR Espectroscopía Infrarroja con Transformación de Fourier
• NMR Resonancia Magnética Nuclear
• EC Electroforesis Capilar
• TLC Cromatografía en capa delgada
• GC Cromatografía Gaseosa
• HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución
• Cromatografías acopladas a Espectrometría de Masa (CG-MS, LC-MS,
UPLC-MS)
• Cromatografías acopladas a Espectrometría en Tándem (LC/MS/MS, etc)
LA ELECCIÓN DE LA TÉCNICA CORRECTA ES UN COMPROMISO ENTRE
RAPIDEZ, SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD, DEPENDIENDO DEL
OBJETIVO DE ESTUDIO
METABOLÓMICA EN PLANTAS
•
•
•
Metabolitos identificados en el reino vegetal: 100200.000 correspondientes a metabolismo primario y
secundario
Técnicas que permiten realizar un “fingerprinting”:
detección masiva de metabolitos en una muestra sin
identificación
Técnicas de análisis de perfiles: detección,
cuantificación e identificación de metabolitos
ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS
METABOLÓMICO

GC-MS: separación por cromatografía (GC or LC) acoplada a espectrometría de
masa (MS). Compuestos termo estables y volátiles, polares y no polares

ESI-MS: infusión directa por electrospray - MS . Para fingerprinting. Requiere
validación posterior para identificación

NMR (menor sensibilidad que GC) , Fourier transform (FT)-IR spectroscopy

LC-MS: para metabolitos secundarios, de mayor tamaño
CRONOLOGÍA DE ESTUDIO DE METABOLÓMICA EN RELACIONES
HOSPEDANTE-PATÓGENO
(__)General MS profiling (gene function analysis/physiological analysis/development/ protocols); (__ ), plant–host studies; (__ ),
FT-IR fingerprinting; (__ ), NMR fingerprinting/profiling. Allwood et al.. Physiol. Plantarum 132: 117–135. 2008
Estudios de perfiles metabólicos GC-MS
Estudios de perfiles metabólicos por GC-MS
Metabolismo primario:
•Aminoacidos
•Azúcares
•Alcoholes
•Acidos organicos
•Acidos grasos
Metabolismo secundario: alcaloides,
fenilpropanos, terpenos,
Metabolómica de la respuesta de girasol al patógeno Sclerotinia sclerotiorum

Agente
Antecedentes
 Agente Causal:
• Sclerotinia sclerotiorum (necrotrófico)
 Factores de patogenicidad:
•
•
Ácido oxálico
Enzimas hidrolíticas (poligalacturonasas)
 Síntomas de la enfermedad:
• Maceración de tejidos del capítulo
• Formación de esclerocios
Análisis transcriptómico y metabolómico:
resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol
Material Vegetal
Estadio reproductivo
R5.2
R5.6
Días post-inoculación
D0
D2
R5.8
D4
R6
D12
Estudios de perfiles metabólicos
Extracción muestras de tejido objeto
(incluyendo un estandar de masa y un
estandar de tiempo de corrida)
Derivatización
Inyección en GC-MS.
se inyectaron 2 volúmenes (100 y 200 ml)
debido a la alta concentración de los
azucares.
IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS
Cromatogramas iónicos totales obtenidos por la técnica
de GC-MS de extractos de frutos de tomate (A),
de flores de girasol (B) y de una mezcla estequiométrica
de extractos de frutos de tomate y flores de girasol (C).
•71 (70–80)
RUTAS METABÓLICAS INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA AL
S.CLEROTIORUM
Se identificaron 63 metabolitos
en flores de girasol y se
cuantificaron 50 por GC-MS
Se identificaron metabolitos cuyo perfil
varia significativamente en respuesta
al patógeno en el genotipo R y S
Se identificaron metabolitos
que permiten discriminar los genotipos
por su respuesta al patógeno
Peluffo et al. 2010, Phytochemistry 71: 70-80
Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)
HA89 Susceptible
RHA801 Moderadamente resistente
Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)
Azúcares
Polioles
Int. Fosforilados
Ácidos del TCA
Ác. Grasos
En el genotipo R:
Cambios significativos
en azucares (trealosa), azúcares
alcoholes (manitol, glicerol),
ácidos grasos(metabolitos TCA)
Ácidos Orgánicos
Aminoácidos
HA89 (S)
RHA801 (MR)
En el genotipo S:cambios
en niveles de aminoácidos
como prolina
Análisis del complemento metabólico en genotipos
resistentes y susceptibles
Análisis de agrupamiento
Análisis correlación entre metabolitos
El complemento metabólico del genotipo R
Se aparta del control sin inocular a 2 y 4DPI,
mientras que para el genotipo S esto ocurre mas tardíamente
El genotipo R presenta una mayor concertación de cambios
metabólicos dentro de ciertas rutas metabólicas como el ciclo
de TCA, asociado a foto respiración. Los intermediarios
de TCA aumentan significativamente a los 2 y 4 DPI,
y luego disminuye, en forma concomitante con el aumento de
actividad catalasa en ese periodo
Asociación de los cambios metabólicos con el nivel de susceptibilidad/resistencia
Objetivo: Corroborar si alguno de los cambios detectados en las distintas vías metabólicas
tienen un correlato con las actividades de las enzimas asociadas a dichas vías
Inoculado con agua (mock )
DPI
0
1
4
1
2
4
9,340,56
10,820,51
-
-
9,420,96
9,481,17
Invertasa de Pared celular (µmol azúcares reductores . min . gDW )
HA89
2,87010
2,690,02
RHA801
2,750,03
2,350,10
-
-
2,780,06
2,410,15
Invertasa citosólica (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )
HA89
0,510,01
0,200,01
RHA801
0,590,05
0,430,13
-
-
0,280,02
0,400,03
Invertasa vacuolar (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )
HA89
1,130,05
0,500,02
RHA801
1,460,09
0,980,22
-
-
0,670,04
1,040,07
3,180,71
3,610,61
5,461,03
2,380,32
4,250,55
5,651,21
0,240,07
0,340,08
0,910,05
0,110,02
0,270,02
nd
-1
Enzimas
claves del
metabolismo
primario del
carbono
Fotorrespiración
Metabolismo de
los
fenilpropanoides
2
Inoculado
-1
Sacarosa Sintasa (nmol UDP-glu . min . mg proteina )
HA89
8,590,78
RHA801
7,300,66
-1
Catalasa (Unidades . mg proteina -1 )
HA89
3,930,39
5,360,83
RHA801
2,640,64
2,510,32
4,720,62
2,570,27
-1
4,371,14
1,880,22
Fenilalanina
amonio-liasa (nmol ácido cinamico . min -1 . µg proteina-1)
Fenilalanina ammonio-liase
HA89
RHA801
1,660,04
0,630,01
0,580,09
0,650,05
1,200,18
nd
0,690,09
nd
De las enzimas evaluadas, la actividad de la catalasa corroboró los cambios metabólicos
ANÁLISIS DE PERFILES TRANSCRIPCIONALES POR QRT-PCR
Y HORMONALES POR LC-ESI-MS/MS
La expresión de genes candidatos con similitud a:
elemento de respuesta a etileno, WRKY7 y quitinasa
se induce en tiempos tempranos post infección en el
genotipo R.
Otros genes como PR5 se detectan en mayores
niveles hacia el 2 y 4 DPI tanto en plantas NI como I;
indicando en este caso que los niveles de este gen no
son inducibles sino pre existentes.
Línea
: DPI
El nivel de ácido jasmónico es
superior en flores del genotipo
R respecto del S, en días
tempranos post infección
Los niveles de acido salicílico
fueron mayores en plantas S inoculadas a
partir de 2 DPI, mientras que el genotipo
R no presenta diferencias entre
I y NI y los niveles son muy
inferiores
Peluffo 2010, Tesis doctoral
HA89 (S)
RHA801 (MR)
Análisis de perfiles
metabólicos
Análisis de perfiles
hormonales (SA y JA)
Mediante estos análisis se
encontraron diferencias en los
componentes metabólicos que
pudieron ser asociadas al
comportamiento contrastante de
las líneas frente a S.
sclerotiorum.
Se encontró una correlación
entre los niveles de estas
fitohormonas y la
susceptibilidad (SA) y
resistencia (JA).
Fue posible correlacionar
cambios en los perfiles
metabólicos con variaciones en
los niveles de las fitohormonas
analizadas.
Construcción de clonotecas
diferenciales y análisis
transcripcionales de genes
candidatos
Se identificaron 3 genes
que estarían implicados en
la respuesta de defensa de
la línea de girasol RHA801
(MR) frente a la inoculación
con S. sclerotiorum.
RESUMEN RESULTADOS CAMBIOS METABÓLICOS CLAVES
ASOCIADOS A LA INTERACCIÓN GIRASOL –SCLEROTINIA
•
•
•
•
•
•
•
Se valido la técnica de GC-MS para identificación y cuantificación de
metabolitos en capítulos de girasol
Se detectaron cambios significativos en metabolitos en estadios
tempranos del proceso de infección en genotipos con respuesta
contrastante al patógeno S. sclerotiorum
El genotipo R presento cambios en niveles metabólicos significativos en
los D 2y D4 post infección
Los estudios concertados de metabolitos muestran patrones de
regulación diferencial en genotipos R y S, presentando el genotipo R
mayores interacciones intermódulo, lo que señalaría mayor concertación
de determinadas rutas metabólicas
Alcoholes (ononitol, glicerol, malitol), derivados de pared celular
(xilosa, ramnosa, gluconato) carbohidratos como la trealosa.
Los metabolitos relacionados con la producción de polifenoles (cafeato
y clorogenato), presentan mayores cambios en el genotipo S .
Metabolitos asociados con removilización de N (aumento de prolina) se
han detectado en el genotipo S
Ensayo experimental desarrollado en EMBRAPA Londrina
V2 o V3
INFECCIÓN
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192
horas post infección
I
NI
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192
horas post infección
I
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192
horas post infección
NI
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192
horas post infección
Resistente
PI594754 (Rpp1)
Susceptible
BRS 184
MUESTRAS (6 replicas por muestra)
Estudios de perfiles metabólicos por la técnica GC/MS en un sistema
de interacción con hongo biótrofo (soja- Phakopsora pachyrhizi )
Resistente
PI594754
I
NI
Susceptible
BRS 184
6 h PI
12 hpi
94 hpi
6 réplicas
biológicas
Determinación del complemento metabólico en hojas de soja en las líneas
BRS 184 (S) PI594754 (R) inoculadas con roya
Análisis de
coordenadas
principales (PCA)
175 metabolitos
•
•
•
ANOVA para los niveles en cada
genotipo, tiempos PI y estados
de inoculación (I y MI)
99 metabolitos cuantificables
Análisis de
correlaciones
y de redes
Identificar cambios metabólicos asociados a la respuesta al patógeno
Identificar rutas metabólicas involucradas en el proceso de resistencia/susceptibilidad
Contribuir a la identificación de genes candidatos
Análisis de varianza (ANOVA) de perfiles metabólicos diferenciales
102 metabolitos cuantificables e identificados
Tiempo:
6, 12 y 96 h PI
Genotipo
RyS
21
14
1
0
21
4
Aspartato
Glucosa
Eritrose
Histidina
Treitol
Shikimato
3
Glutámico
Nonadecano
Xilulosa
Tratamiento (I vs NI)
7 metabolitos interacciones tratamiento
7 metabolitos interacción tiempo*línea
31 metabolitos no mostraron diferencias para ningún factor o interacción
Erytrose
Nonadecane
Treitol
Hexadecane
Myo-inositol-2-phosphate
Análisis de Componentes Principales
Efecto genotipo
S
R
Correlaciones línea resistente
(PI594754)
Inoculado: 83 correlaciones significativas
Control: 65 correlaciones significativas
Correlaciones línea susceptible (BRS 184)
Inoculado: 47 correlaciones significativas
Control: 57 correlaciones significativas
Meiezitose
Raffinose
Sucros
e
Talose
Galactinol
Gluconolacton
e
Trehalose
D-Galactono-1,4-lactone
Galactose
Xylose
Fucose
Xylogluca
n
Rhamnogalacturan
Arabinose
Gluconate
Glucose
F6P
Ribose
Psicose
Galacturonic
Ononitol
Myo-Inositol
Cystine
PEP
Cysteine
Leucine
Threonin
e
Threitol
Glycerate
Glycerol
Shikimate
Alani
ne
Valine
Quinate
GlycerolP
Tryptopha
n
Tyrosine
Tyramine
Phenylalanine
Caffeate
Chlorogenate
Pyruvate
Lactate
Isoleucin
e
Glyoxylate
Homoserine
Nicotinate
Dehydroascorbat
e
Sorbos
e
Mannitol
Serine
Nicotiamine
Galactarate
Myo-Inositol-1P
3PGA
Glycine
Threonat
e
L-Ascorbate
Mannose
Fructose
Lactulose
G6P
Glucose 1P
Maltose
Maltitol
Rhamnose
Acetil- CoA
Benzoate
Saccharat
e
Palmitate
2-Coumarate
Stearate
Glycolate
Oxalacetate
Citrate
Lysine
ß-Alanine
Uracil
Aspartate
Malonate
Methionine
Malate
Asparagine
Aconitate
TCA cycle
Fumarate
Isocitrate
Glutaric Acid
Pyrroline-2-carboxylate
Prolin
e
Hydroxyproline
Succinate
Ctrl1
Ctrl2
Ctrl3
WS1
WS2
WS3
2-oxoglutarate
SuccinylCoA
Urea
Ornithine
-4
0
Arginine
Glutamat
e
ɣ-aminobutyrate
Glutamin
e
Pyroglutamate
Histidine
Cambios metabólicos en plantas asociados a respuestas de
defensa inducidas
Parker et al., (2009)The Plant Journal 59, 723–737
MUCHAS GRACIAS