RT- PCR diagnóstica del Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) en plantas de algodón La identificación rápida y precisa de los patógenos que afectan a los cultivos de interés agronómico es crítica para predecir y controlar las enfermedades y para seleccionar plantas tolerantes o resistentes en los programas de mejoramiento. Para el caso de infecciones virales, en los últimos años se han desarrollado y optimizado métodos de diagnóstico por RT-PCR de virus pertenecientes a la familia Luteoviridae La enfermedad azul del algodón es producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV). El genoma del CLRDV fue recientemente secuenciado por nuestro grupo y se desarrolló un método efectivo de diagnóstico de la enfermedad permitiendo realizar un diagnóstico temprano del virus en las zonas afectadas. Objetivo del TP: Discutir protocolos de extracción de ARN a partir de muestras de origen vegetal y la subsiguiente síntesis de ADN copia. Realizar el diagnóstico molecular del CLRDV mediante la detección de secuencias propias del virus en plantas de algodón infectadas mediante la técnica de RT-PCR (transcripción reversa y posterior PCR). Parte I: Discutir con los docentes el protocolo de extracción de ARN a partir de plantas del algodón y síntesis del ADN copia (ADNc), observando los detalles importantes para obtener de manera óptima estas moléculas. Tejido vegetal infectado Sanas Obtención de RNA total RT-PCR Enfermas Los protocolos de extracción de ARN involucran en general 4 etapas básicas: 1- Maceración mecánica para romper las paredes y membranas celulares del tejido. La maceración de tejido fresco se hace en presencia de nitrógeno líquido. 2- El tejido se resuspende en el buffer de extracción para la lisis del mismo y la solubilización de las membranas lipoprotéicas y desnaturalización de las proteínas, en tanto que el ARN es protegido de la acción de enzimas degradativas. 3- La suspensión se somete a una extracción con solventes orgánicos, como Fenol ácido (ph 4,5) y cloroformo, y las fases orgánica y acuosa se separan por centrifugación. En esta extracción, lípidos, proteínas, la mayoría de los polisacáridos y el ADN quedan retenidos en la fase orgánica en tanto que el ARN y algunos polisacáridos quedan en fase acuosa. A la fase acuosa obtenida en la etapa anterior se le adiciona alcohol (etanol o isopropanol). El ARN en presencia de alcohol forman un precipitado, que a veces es visible, que puede ser sedimentado por centrifugación. A este precipitado luego se lo lava con alcohol para eliminar las sales remanentes. 4-En la última etapa, el ARN es resuspendido en agua MiliQ libre de RNAsas (agua con Dietil Pirocarbonato). Protocolo de extracción de ARN utilizando TRIZOL Buffer de extracción Sanas Enfermas Nitrogeno líquido 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4 C durante 10 minutos a 12.000 rpm para obtener un sobrenadante limpio sin restos de material vegetal Trizol (Isotiocianato de Guanidinio-fenol ácido, pH: 4,5) 100 mg de tejido Sobrenadante cloroformo frío hasta volumen final de 1,4 ml. Vortex 2 min y centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4 C durante 10 minutos a 12.000 rpm. Fase acuosa: ARN 1 volumen de isopropanol. Dejar durante la noche a -20 C Interfase: ADN y proteinas Fase orgánica: AND y Proteinas Fase acuosa Descartar el máximo posible de sobrenadante sin perder el pellet Lavar el pellet con 250 μl de etanol 70%. Centrifugar 10 min a 14.000 rpm a 4 C. Repetir Resuspender el pellet en 50μl de agua libre de RNAsas (agua DEPC: Dietil Pirocarbonato) Centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4 C durante 30 minutos a 14.000 rpm Guardar el ARN a -80 C El RNA es muy lábil y fácilmente degradado por la acción de RNAsas presentes en la piel y por temperaturas superiores a 4ºC, lo que constituye el principal problema de la extracción del RNA, por ello se utiliza inhibidores de RNasas, guantes para su manipulación, se utiliza todo el material libre de RNAsas y se trabaja a temperaturas inferiores a 4ºC. S E Síntesis de ADNc. RNA cDNA 3 5 Primers al azar o poliT Transcriptasa reversa cDNA 1ª cadena 3 5 PCR Gel Secuenciar cDNA Para la síntesis de ADNc se utilizara el kit comercial SuperScript III (Invitrogen) ARN dNTPs (10 mM) Random primers (150 ng/ l) H2O Depc 1 1 1 X g l l l Volumen 15 l Colocar 5 min a 70 C y luego inmediatamente en hielo. Hacer un spin. Agregar la siguiente mix: Buffer 1st strand 5x DTT 0,1M (Dithiothreitol) RNAse out (40U/ l) Transcriptasa reversa (200U/ l) (Superscript III) 4 1 1 1 l l l l 22 Colocar en un termociclador con el siguiente programa: 25 ºC 2 min 50ºC 2 hs 70ºC 15 min 16ºC ON PARTE II: Detección de secuencias específicas del CLRDV mediante PCR para su diagnóstico molecular. ORF 0 ORF 3 785 pb 606 pb ORF 0: 785 pb ORF3: 606 pb Gh Ubiquitina: 500 pb Se realizará otro control (control positivo) para confirmar que la reacción de amplificación por PCR funcionó. Para ello utilizaremos un plásmido que tiene clonado el ORF 0 (P0) y otro plásmido que tiene clonado el ORF 3 (CP) con los primers correspondientes. Control con DNA Gh para primers Ubi Tubo 1: ADNc planta enferma con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 2: ADNc planta sana con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 3: plásmido CP con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 4: mix sin ADNc con Primers 1 y 2 (CP) Tubo 5: ADNc planta enferma con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 6: ADNc planta sana con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 7: plásmido P0 con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 8: mix sin ADNc con Primers 3 y 4 (P0) Tubo 9: ADNc planta enferma con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 10: ADNc planta sana con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 11: ADN algodón con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Tubo 12: mix sin ADNc con Primers 5 y 6 (Gh UBI) Reactivos Concentración final Volúmen en l Volúmen total MIXADNc plásmido o ADN H2O MilliQ ---- 16,45 l Buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 50mM 1,5 mM 0,75 l dNTPs 10 mM 0,4 M 1 l Primer up 50 ng/ l 1 Primer low 50 ng/ l 2 ng/ l Taq Platinum (10 U/ l) 0,08 U/ l 1 l 0,3 l ADNc ó plasmido (1 ng/ l) 2 (por tubo) Volúmen final 25 l El programa de amplificación es el siguiente: 1 ciclo 94 C, 4 min (desnaturalización inicial) 35 ciclos 94 C, 1 min (desnaturalización) 55 C, 1 min (hibridación) 72 C, 1 min (extensión) 1 ciclo 72 C, 10 min (extensión final) 16 C, infinito