Teo II Cultivo de tejidos MRivero AGBT 2013.pdf
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AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2013 Cultivo de tejidos vegetales II María Mercedes Rivero Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires - Sumario La micropropagación masiva en la práctica comercial Montaje del laboratorio y costos de producción Control fitosanitario y varietal Gestión productiva Otras aplicaciones de la micropropagación Agrobiotecnología Referencias Micropropagación masiva La micropropagación masiva en la práctica comercial Agrobiotecnología Micropropagación masiva La micropropagación a gran escala es una técnica que implica mano de obra intensiva Agrobiotecnología Micropropagación masiva • La micropropagación vegetal ha evolucionado en los últimos 20 años. • Sin embargo, el método actual de micropropagación masiva continúa siendo la clásica propagación por división de vástagos axilares. Existen pocas empresas dedicadas a la micropropagación comercial debido a los altos costos involucrados Agrobiotecnología Micropropagación masiva Factores a considerar antes de emprender una clonación masiva Agrobiotecnología Micropropagación masiva Las distintas etapas del proceso de micropropagación definen cada nuevo procedimiento a realizar • Etapa I: establecimiento de un cultivo aséptico - Esta etapa se considera finalizada cuando se logra un adecuado número de explantos sobrevivientes sin contaminación. • Etapa II: producción de nuevos propágulos, que separados de su macollo inicial puedan dar origen a nuevas plantas - La multiplicación se realiza a partir de los nuevos vástagos, tanto apicales como axilares, que a su vez serán subcultivados incrementando su número. • Etapa III: preparación para el crecimiento en su ambiente natural - Los vástagos o plantines deben crecer lo suficiente como para poder fotosíntetizar y así sobrevivir sin el suplemento artificial de carbohidratos. En esta etapa se incluye el enraizamiento in vitro. Agrobiotecnología Micropropagación masiva • Etapa IV: transferencia al ambiente natural - La transferencia de los plantines de in vitro a ex vitro es sumamente importante. Si no se realiza cuidadosamente puede resultar en importantes pérdidas del material micropropagado. La micropropagación puede iniciarse a partir de la extracción de yemas de la planta madre Propagación a partir de yemas apicales y/o axilares ( I ) Agrobiotecnología Micropropagación masiva Adaptado de: Edwin George. Plant Propagation by Tissue Culture,1996. Los meristemas se introducen en tubos individuales para evitar contaminaciones masivas Agrobiotecnología Micropropagación masiva Meristemas de caña de azúcar en crecimiento El explanto inicial sigue su diferenciación a vástago (plantín en crecimiento) Etapa I: Diferenciación del explanto Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantín de arándano a los 30 días de su iniciación in vitro La clonación de plantines se realiza bajo condiciones de asepsia absoluta Etapa II: Subdivisión de microplantines bajo flujo de aire estéril Agrobiotecnología Micropropagación masiva Multiplicación de soja in vitro Se optimiza la tasa de multiplicación para obtener un máximo rendimiento Etapa II: Multiplicación a gran escala Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantines de papa multiplicados in vitro Antes de cada nueva subdivisión se constata la calidad del material en propagación Etapa II: Monitoreo de la calidad y homogeneidad de los plantines Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantas transgénicas de soja multiplicadas clonalmente La micropropagación también puede iniciarse partiendo de segmentos de hoja o pecíolo Agrobiotecnología Micropropagación masiva Propagación por medio de vástagos adventicios o embriones: tipos de morfogénesis Se pueden desarrollar plantines completos a partir de diferentes explantos mediante morfogénesis directa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Morfogénesis directa La morfogénesis directa permite obtener una gran cantidad de plantines en la etapa inicial de la micropropagación Micropropagación por morfogénesis directa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantines de Begonia rex originados por morfogénesis directa La morfogénesis indirecta permite regenerar plantas a partir de callos formados por células desdiferenciadas Morfogénesis indirecta La embriogénesis indirecta puede utilizarse para generar plantas transgénicas Agrobiotecnología Micropropagación masiva Callos de alfalfa en regeneración en medio selectivo La ontogenia de un embrión somático es similar a la diferenciación de un embrión de origen sexual Embriogénesis somática en alfalfa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Izq. Callo embriogénico de alfalfa; Der. Detalle de embrión somático de alfalfa Etapa III: enraizamiento El enraizamiento ideal depende de la especie de interés Métodos alternativos de enraizamiento Las especies que enraizan in vitro tienen mayor probabilidad de supervivencia durante la aclimatación Etapa III: enraizamiento in vitro Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantas de alfalfa regeneradas y enraizadas in vitro La rusticación es una de las etapas más críticas de la micropropagación Agrobiotecnología Micropropagación masiva Etapa IV: Invernadero - Rusticación / Aclimatación - Tamaño comercial - Calendario de entregas Costos vs. productividad Agrobiotecnología Micropropagación masiva La infraestructura productiva debe ser pensada para procesar anualmente una cantidad rentable de plantines • Laboratorio de producción - Estructura para producir cantidades de 3.000 a 10.000 plantines diarios - Cámaras de crecimiento con capacidad para 300.000 a 1.000.000 de plantines Agrobiotecnología Micropropagación masiva Gentileza de Indear S.A. La mano de obra intensiva es el mayor costo involucrado. Esta debe ser respaldada por buen equipamiento Agrobiotecnología Micropropagación masiva El entrenamiento del personal es clave para lograr una producción eficiente El tipo de equipamiento debe acompañar el escalado de producción El personal debe estar capacitado para trabajar en condiciones de esterilidad Agrobiotecnología Micropropagación masiva Subdivisión de plantines bajo flujo de aire estéril Se requiere un equipamiento mínimo para la preparación de medios de cultivo a gran escala • Elaboración de medios de cultivo - Soluciones madres - Contenedores de gran volumen (10 L) - Agitadores magnéticos - Microondas - Balanza - Medidor de pH - Bombas dispensadoras Agrobiotecnología - Autoclave eléctrico Micropropagación masiva - Recipientes esterilizables para las plantas Existen varias modalidades y alternativas de recipientes para el cultivo in vitro de plantas Diferentes modalidades de cultivo in vitro de plantas Plántulas de arroz regeneradas in vitro Rescate de embriones inmaduros de maíz Agrobiotecnología Micropropagación masiva Embriones somáticos de alfalfa en germinación Plántulas doble haploides de maíz Los esterilizadores eléctricos de instrumental resultan menos riesgosos y más productivos Agrobiotecnología Micropropagación masiva Área de trabajo aséptica mostrando un esterilizador eléctrico, instrumental de trabajo y recipientes de cultivo. La rusticación es una etapa crítica en la que gran cantidad de plantas deben ser aclimatadas gradualmente Etapa IV: Invernaderos / Aclimatación de plantas Agrobiotecnología Micropropagación masiva Rusticación de plantas transgénicas de soja (izq); eventos transgénicos de maíz y alfalfa en invernáculo (der) El proceso culmina con el desarrollo de las plantas hasta alcanzar el tamaño comercial Etapa IV: Invernaderos / Finalización Agrobiotecnología Micropropagación masiva Rusticación de plantas transgénicas de soja (sup.); Plantas doble haploides de maíz obtenidas y multiplicadas a partir de la tecnología de cultivo in vitro. Control fitosanitario y varietal Agrobiotecnología Micropropagación masiva El tejido vegetal debe indexarse en todas las etapas del proceso de micropropagación Control fitosanitario • Los métodos para detección de contaminantes no visibles que se utilizan son: Agrobiotecnología Micropropagación masiva - Ensayo en planta indicadora - Test inmunoenzimáticos (ELISA) - PCR El control varietal puede realizarse utilizando marcadores moleculares • Control varietal El control varietal puede desarrollarse por distintas técnicas de marcadores moleculares: - RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA. - AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms. - SSR: Simple Sequence Repeats (microsatélites). - SNP: Single Nucleotide Polymorphism. - RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. Agrobiotecnología Micropropagación masiva El control varietal puede realizarse utilizando marcadores moleculares Agrobiotecnología Micropropagación masiva Puesta a punto de la técnica de microsatélites para identificación varietal en arándanos Gestión productiva Agrobiotecnología Micropropagación masiva Contar con una logística que coordine cada paso del proceso es clave para desarrollar una gestión exitosa • Coordinación de la producción - Conocimiento de tasas proliferativas - Calendario de producción - Programación horas/operario - Observaciones periódicas - Programación de elaboración de medios - Ciclos de enraizamiento Agrobiotecnología - Ciclos de aclimatación Micropropagación masiva El asesoramiento post-venta durante un cierto período completa la tarea de comercialización Factores involucrados en la comercialización: • Calendario • Preparación y expedición • Post-venta - Fecha de siembra - Manejo del cultivo • Clientes Agrobiotecnología Micropropagación masiva - Contratos exclusivos - Producciones continuas - Estudio de mercado Otras aplicaciones: Multiplicación de plantas para ensayos agronómicos Agrobiotecnología Micropropagación masiva Papas transgénicas resistentes al Potato virus Y (PVY) Proyecto Biosidus- Lab. Agrobiotecnología, FCEyN-UBA Agrobiotecnología Micropropagación masiva Micropropagación masiva de plantines transgénicos de papa destinados a ensayos de campo en condiciones controladas Las infecciones virales producen grandes pérdidas económicas en la producción de papa en la Argentina Los virus económicamente más relevantes son: • Potato leaf roll virus . (PLRV) • Potato virus Y . (PVY) • Potato virus X . (PVX) Síntomas producidos por una infección del virus PVY en plantas de papa Selección de líneas resistentes al virus PVY en condiciones contenidas Ensayos de infección con el virus PVY de líneas transgenicas de papa en condiciones de invernadero 300 líneas Agrobiotecnología 200 líneas Infección mecánica Micropropagación masiva 100 líneas Selección a campo 100 líneas Agrobiotecnología Micropropagación masiva 80 líneas Infección natural 20 líneas Ensayos comparativos con la línea transgénica SY233 Se realizan ensayos en cuatro regiones distintas de Argentina Agrobiotecnología Micropropagación masiva Infección natural SY233 1/1500 infectadas Control 450/1500 infectadas Eventos transgénicos de alfalfa con resistencia a estrés hídrico Agrobiotecnología Lab. de Transformación y cult. de tejidos Indear- Bioceres Micropropagación masiva Evaluación fenotípica de eventos transgénicos de alfalfa multiplicados clonalmente in vitro en ensayos de resistencia a estrés hídrico a campo y bajo shelter. Etapas del proceso regulatorio CONABIA 1° Fase de Evaluación CONABIA 2° Fase de Evaluación SENASA DIRECCION NACIONAL DE MERCADOS AGROALIMENTARIOS (SAGPyA) CERTIFICACION DE PAPA SEMILLA Agrobiotecnología Micropropagación masiva COMERCIALIZACION
