Clase Flavio - Biotech Animal 2015-II.pdf

Biotecnología
animal
II
Conceptos y Técnicas
en Biotecnología
2015
Flávio S. J. de Souza
Manipulación genética molecular de mamíferos
Aplicaciones potenciales
- producción de proteinas recombinantes (p. ej:
hormonas de mamifero en leche, etc)
- mejoramiento de la calidad nutricional de carne o
leche (p. ej: leche con más proteinas, carne de cerdo
con omega-3 etc)
- generación de mejores modelos de enfermedades
humanas (p. ej: cerdos con fibrosis quistica, monos
con enfermedad de Huntington)
- modelo de fibrosis quística:
knockout del gen CFTR en cerdos
- deleción del exon 10 por un cassette
de neo
- manipulación de fibroblastos fetales
seguido de clonación
- cerdos tienen los mismos síntomas
de humanos con fibrosis quística
sintomas en humanos:
- obstrucción del intestino
- insuficiencia pancreatica
- deformidades en el higado
- inflamación crónica del pulmón
modelos de ratón:
- fenotipo suave
cerdo modelo:
- obstrucción del intestino
- insuficiencia pancreatica
- deformidades en el higado
- modelo de fibrosis quística: knockout del gen CFTR en el hurón
- deleción del exon 10 por un cassette de neo utilizando un vector viral (virus
adeno-asociado) para la recombinación homóloga
- manipulación de fibroblastos fetales seguido de clonación
- fenotipos semejantes a humanos en pulmón, páncreas, obstrucción del
intestino (menos grave que en cerdos)
- alta incidencia de infecciones pulmonares posnatales (como humanos)
distribuidor de hurones
CFTR knockout
- knockout del gen del low-density lipoprotein receptor (LDLR) en cerdos
- hetero- y homocigotas para la mutación desarrollan altos niveles de coleterol
en sangre seguido de arterosclerosis
Transgénesis con vectores virales
- transgenes de interés insertados en vectores derivados de lentivirus
lentivirus: retrovirus (RNA) capaz de insertarse en el genoma
: capaz de infectar tanto células en división (p. ej. cigota)
como células que no se dividen (p. ej. ovocito)
- alternativa a la inyección pronuclear
vantajas: alta eficiencia de transgénesis
: alta supervivencia de embriones manipulados
desvantajas: baja capacidad para inserto (c. 10 kb)
: bioseguridad con lentivirus
Transgénesis con vectores virales
LTR: long terminal
repeats
Transgénesis con vectores virales
Transgénesis con vectores virales
inyección pronuclear x vectores lentivirales
Transgénesis con vectores virales
vectores lentivirales: especies e eficiencia
Transgénesis con vectores virales
- primates transgénicos:
hair
placenta
nails
Transgénesis con vectores virales
- Huntington's: enfermedad genética degenerativa dominante no tratable;
causada por repeats de CAG (glutamina) en la huntingtina
human huntingtin
with Q CAG-repeats
GFP
- 130 oocitos tratados con retrovirus
- 5 nacimientos de transgénicos (100%)
Transgénesis con vectores virales
- monos transgénicos con sintomas semejantes a Huntington's:
distonia, corea, dificultad de deglutición
Transgénesis con vectores virales
anti-HTT polyQ
immunostaining
nuclear inclusions
neuropils (array-like)
Transgénesis con vectores virales
Callithrix jacchus
Transgénesis con vectores virales
Callithrix jacchus
Macaca sp. (Rhesus)
-gestation time: 144 days
-gestation time: 135-195 days
-sexual maturity: 12-18 months
-sexual maturity: 3 years
-offspring per female lifespan: 40-80
-offspring per female lifespan: 10
Transgénesis con vectores virales
lentiral injection into: oocytes followed by intracytoplasmic sperm injection
: zygotes from natural mating
EGFP transgenic
Transgénesis con vectores virales
transgenic blastocysts
born transgenic pup (F1)
transgenic skin
Animales transgénicos comerciales
productos comerciales de la biotecnología moderna
(organismos geneticamente modificados - GMO)
- 1982: insulina humana recombinante de E. coli (Genentech)
(primer producto derivado de un GMO aprobado para
consumo humano)
- 1994: tomate Flavr Savr (Calgene)
- 1994: soja Roundup Ready (Monsanto)
- 2003: GloFish zebrafish (pez ornamental fluorescente - EEUU)
- 2003: TK-1 medaka fish (pez ornamental fluorescente - Taiwan)
- 2006: ATryn anti-trombina de la leche de cabras transgénicas
(GTC Biotech; aprobado en Europa 2006; EEUU 2009)
- 2013: salmon transgénico de crecimiento rápido (no aprobado aun)
Peces transgénicos
- microinyección en embrión de 1-célula:
plásmido con gen de interés
flanqueado con sitios Tol2
mRNA de transposasa
- transposasa integra gen de interés
al genoma de las células del embrión
(se genera un pez mosaico);
- peces transgénicos pueden ser usados
para generar una linea estable si el
transgén se encuentra insertado en la
linea germinal.
Kawakami Genome Biology 2007 8(Suppl 1):S7
Peces transgénicos
Alexandra Almeida
triple transgenic zebrafish embryo
Crx-CFP (photoreceptor and bipolar cells); Ath5-RFP (retinal ganglion cells, projects into the brain);
Ptf1a-GFP (horizontal and amacrine cells, hindbrain neurons). Confocal fluorescence
Peces transgénicos
- enhancers del gen de Pomc de ratón dirigen la expresión de GFP a neuronas
hipotalámicas de embriones de zebrafish
embryonic
hypothalamus
& pituitary
Pomc/ACTH
(endogenous)
x
EGFP
(transgene)
adult brain
- modelo de melanoma en zebrafish transgénico para BRAF (MAP kinasa) con
una mutación activante (gain-of-function) encontrada en melanomas humanos
- BRAF mutante (BRAFV600E) expresada con promotor de mitfa (específico de
melanocitos) origina tumores benignos en melanocitos (nevi)
- zebrafish transgénicos para BRAF mutado y además p53-/- desarrollan
melanomas como los humanos
- screening de genes que aceleran el desarrollo de melanoma en zebrafish
transgénicos para el BRAF mutado (BRAFV600E) y p53-/-
- la metiltransferasa de histonas SETDB1 estimula la formación de melanomas
en los peces... y está aumentada en 70% de los melanomas humanos
Peces ornamentales fluorescentes (GloFish)
tetra (Gymnocorymbus ternetz)
zebrafish (Danio rerio)
primer animal transgénico comercial en Ocidente (2003)
Salmón transgénico
- salmón transgénico que sobreexpresa hormona de
crecimiento (crece 2x más rápido)
- US$ 60 milliones invertidos
1989 - generación de salmón del Atlántico transgénico para hormona de crecimiento (Canada)
1995 - empiezan los trámites en el FDA (Food and Drug Administration) de EEUU (empresa AquaBounty)
2001 - AquaBounty somete el primer estudio regulatorio al FDA
2009 - AquaBounty termina la aplicación al FDA
2010 - FDA dictamina que el salmón GM es seguro como alimento
2012 - FDA termina el examen de impacto ambiental
si es aprobado, sería el primer animal transgénico para consumo humano
Salmón transgénico
ATryn: anti-trombina humana
- anti-trombina: proteina glicosilada de 432 aa con 3 puentes disulfuro
: agente anticoagulante;
: usada para tratar pacientes con deficiencia hereditaria de anti-trombina
- ATryn: anti-trombina humana extraida de la leche de cabras transgénicas
- cabras transgénicas desarrolladas en 1993 (por microinyección pronuclear)
- aprobada en 2006 (EMA - Unión Europea) y 2009 (FDA - EEUU)
- primera proteina recombinante para uso humano producida en animales transgénicos
Células-madre humanas
(puede originar
todo el organismo)
(ICM: puede originar
las 3 capas germinales)
(originan
celulas
de un linaje
limitado)
Células-madre humanas
- células-madre hematopoyeticas: usadas en el tratamiento de ciertos cánceres
(leucemia, linfoma) por transplante de médula osea
Células-madre humanas y terapia génica
Dec 2006
- epidermolisis bulosa: enfermedad de adhesión de la epidermis
: deficiencia en el gen de laminina 5-3 (LAMB3)
- aislamiento de células-madre de
keratinocitos (holoclones)
Células-madre humanas y terapia génica
- vector retroviral para expresión de
LAMB3
- transducción de células-madre de
keratinocitos del paciente
- verificación de la expresión del
transgén
Células-madre humanas y terapia génica
- transplante al paciente:
experimentos fueron cancelados por el uso de vectores retrovirales
Células-madre humanas y terapia génica
April 2000
- tratamiento de SCID (immunodeficiencia combinada severa) ligada al X en humanos
- enfermedad causada por deficiencia en la subunidad c de receptores de
interleukinas 2, 4, 7, 9 y 15
- falla en la diferenciación de linfocitos T y Natural Killers (NK)
Células-madre humanas y terapia génica
April 2000
- pacientes: P1 y P2 (11 y 8 meses de edad)
- tratamiento: transducción de células-madre hematopoyeticas (CD34+) de los pacientes
con un vector retroviral (MMLV) con el gen corregido
: transferencia de las células transducidas a los pacientes
- pacientes: después de 90-95 días dejaron el aislamiento y se fueron a casa
Células-madre humanas y terapia génica
April 2000
primer caso de terapia génica claramente exitosa
Células-madre humanas y terapia génica
Oct 2003
- pacientes: 2 de 11 desarrollaron leucemia
- causa: inserción del vector retroviral cerca del protoncogén LMO2
Células-madre humanas y terapia génica
- pacientes: 2 de 11 desarrollaron leucemia
- causa: inserción del vector retroviral cerca del protoncogén LMO2
: tropismo del vector derivado de MMLV por cercanía a oncogenes
: MMLV - Moloney murine leukaemia virus
Células-madre humanas y terapia génica
- solución: uso de vectores basados en virus que NO estén asociados a cancer
: lentivirus - HIV - Human immunodeficiency virus
Células-madre humanas y terapia génica
Nov 2009
- Adrenoleucodistrofia ligada al X: deficiencia en un transportador de membrana que une
ATP (ALD, codificado por el gen ABCD1)
- falta del gen en microglia (células inmunes del sistema nervioso central) causa
desmielinación en varones afectados
- síntomas empiezan a los 6-8 años, causa muerte antes de la adolescencia
Nov 2009
- agregado del gen ABCD1 a HSCs del
paciente
- vector basado en HIV (lentivirus)
- células derivadas de las HSCs modificadas
migran al sistema nervioso (microglia)
- 2 pacientes tratados (7 & 7.5 años de edad),
seguimiento por 20 meses demostró arresto
casi total de los síntomas