EXPRESION DE PROTEINAS EN LEVADURAS FCEN 2014 (alumnos).pdf
Anuncio
Expresión de proteínas recombinantes en levaduras Mercedes Goin Laboratorio Denver Farma Área Biotecnología Elección del sistema de expresión Complejidad de la molécula: estructura terciaria y cuaternaria, modificaciones postraduccionales Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico Cantidad de producto Economía Aspectos regulatorios BACTERIAS Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores. Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L). En general las proteínas tendrán metionina N-terminal. Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión. No produce eventos postraduccionales. Endotoxinas LEVADURAS Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores. Buenos rendimientos (0.01-1 g/L). Introduce modificaciones postraduccionales. La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas” La proteólisis suele ser un problema. CÉLULAS DE MAMÍFEROS Los cultivos en grandes escalas son difíciles de realizar y muy costosos. Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1 g/L). Se producen modificaciones postraduccionales. Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de expresión posible. PLANTAS Se producen modificaciones postraduccionales Expresión localizada en diferentes órganos Expresión en estadíos específicos del crecimiento Crecimiento en campo barato La glicosilación es distinta que la de mamíferos Eficiencias bajas de transformación y expresión Seguridad controvertida EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS Producción de proteínas biofarmaceúticas Levaduras E. coli Cel. Eucariotas superiores Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17. Saccharomyces cerevisiae Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Nº de copias levadura /célula Frec. transformación (a) Inestabilidad mitótica (b) Integrativos YIp ADN homólogo ≥ 1 102 0,1 % Reemplazo ADN homólogo 1 10 Estable ADNr ADNr 100-200 nd Estable ARS 1-20 104 20 % 1-2 104 1% 104 2,8-0,2 % Episomales Replicadores (YRp) Centroméricos (YCp) ARS/CEN Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP 25-200 /FLP (a) (b) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos Células sin plásmido por generación en medio no selectivo. Integración cromosómica de ADN por recombinación homóloga Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Nº de copias levadura /célula Frec. transformación (a) Inestabilidad mitótica (b) Integrativos YIp ADN homólogo ≥ 1 102 0,1 % Reemplazo ADN homólogo 1 10 Estable ADNr ADNr 100-200 nd Estable ARS 1-20 104 20 % 1-2 104 1% 104 2,8-0,2 % Episomales Replicadores (YRp) Centroméricos (YCp) ARS/CEN Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP 25-200 /FLP (a) (b) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos Células sin plásmido por generación en medio no selectivo. Marcadores de selección 1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en cepas auxotróficas. Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas para leucina, triptofano, uracilo e histidina 2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de cepas. Ej: Tn903kanr: selección con G418 DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol Promotores y terminadores transcripcionales Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa ADH: alcohol deshidrogenasa Son inducidos varias veces por glucosa Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados. Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2µ Secreción de proteínas en Saccharomyces cerevisiae ¿Para qué? Plegamiento correcto Evitar efectos tóxicos Facilita la purificación Péptido señal MFα1: feromona SUC2: invertasa PHO5: fosfatasa ácida péptido N-terminal hidrofóbico propio de levaduras Construcción del gen para expresar en levaduras • 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción • 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente AAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción • 3- Uso de codones propios del sistema • 4- Usar ADNc • 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc. • 6- Incluir sitios de restricción para el clonado Problemas asociados a la producción en S. c. •La mayoría son promotores constitutivos. •Falta de promotores fuertes. El producto representa 1-5% del total de las proteínas producidas. •Inestabilidad plasmídica. •Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas. Casi todos los productos derivados de levaduras que están en el mercado son producidos en Saccharomyces cereviciae 2009: la FDA apueba la 1era proteína biofarmaceútica producida en una levadura distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína producida en Pichia pastoris por Dynax Inc. LEVADURAS METILOTRÓFICAS • Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C • Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente escalable a grandes volúmenes de producción • La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles celulares. • Sistema actualmente muy difundido Hansenula polymorpha (Pichia angusta) Candida boidinii Pichia methanolica Pichia pastoris Pichia pastoris ALCOHOL OXIDASA •Son las primeras enzimas del camino metabólico de metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2. •A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de homología •AOX esta constituída por un octámero de subunidades idénticas a las que se le unen moléculas de FAD. PEROXISOMA CITOSOL CH3OH CH3OH AOX O2 H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2 FLDH NAD NAD NADH2 NADH2 CATALASA DHAS 1/2O2 + H2O FDH GSH Xu5P GAP DHA 1/3 GAP DHA ATP DHAP ADP GAP FBP F6P P2 constituyentes celulares •AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células compensan esta baja actividad catalítica sintetizando grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable, mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de las proteínas celulares solubles. •La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional. Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil Inductor: Metanol Represor: glucosa, glicerol, etanol Peroxisomas Vectores de expresión para Pichia pastoris Inducción con metanol Cepa a transformar His-: GS115 Inducción con glucosa o glicerol Reemplazo génico Integración del ADN en genoma Inserción génica Recombinación homóloga Inserción génica en AOX Reemplazo génico Vectores de expresión para Pichia pastoris Inducción con metanol Cepa a transformar His-: GS115 Selección de cepas recombinantes His+Mut+ e His+Muts Mut + Muts Muts Medio MD Medio MM Confirmación por PCR y Southern blot Selección de cepas recombinantes His+Mut+ e His+Muts MD MM Caracterización del producto de expresión SDS PAGE +/- DTT Western blot Caracterización de la cepa productora PCR: presencia y estabilidad del gen Southern blot: Mut+/Muts Dot Blot: Nº de copias del gen PCR cuantitativa: Nº de copias del gen GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS 1- N- GLICOSILACIÓN 2- O- GLICOSILACIÓN Glicosilación de proteínas • Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi donde los hidratos de carbono sufren modificacines • N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación. • Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150 manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales α 1-3 glicano N- GLICOSILACIÓN “Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier aa menos Prolina Asn O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS α - manosa α – 1,2 manosa Ser/Treo Sequon? Abundancia inusual de ser/treo Prolinas cerca de ser/thr aa cargados cerca de ser/treo GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras Tunicamicina Cepas mutantes Enzimas para desglicosilar No usar la vía de secreción Mutagénesis dirigida Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas La productividad de un sistema recombinante está determinada por muchos factores genéticos y fisiológicos. Posibles cuellos de botella: ♣ Uso de codones ♣ Número de copias del gen ♣ Transcripción eficiente usando promotores fuertes ♣ Señales de traducción ♣ Translocación determinada por el péptido señal ♣ Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi ♣ Secreción ♣ Proteólisis Cambio de escala 50 ml Shake-flask cultures 2.5 l Fermenters, with 1.5 l working volume 20 l Fermenters, with 15 l working volume 400 l Fermenters, with 300 l working volume COSECHA CENTRIFUGACIÓN ¿Qué construcción? ¿Qué precursor? ¿Qué promotor? ¿Qué péptido señal? Fenotipo Mut Selección del clon Nivel de expresión proteica Nº de copias del gen
