TP GENETICA MOLECULAR CHEMES.pdf

TP Gené(ca Molecular 2013 Interacciones gené(cas en levaduras Docentes a cargo: Lucía Chemes (JTP) Carla Castro (Ay1) Manuel Sánchez (Ay2) Jazmín Cassinelli (Ay2) TP Gené(ca Molecular 2013 Cronograma y régimen de aprobación de Labo •  15% de la nota final de la materia •  Asistencia: 80% (se puede faltar a una clase) •  Un parcialito de TP a mitad de camino, el martes 29/10 •  Trabajo final: en grupos de 5-­‐6 personas (los mismos que se armen para el TP), exposición oral el día Jueves 20/11. Hay 15 días para prepararlo. Clase que viene charlamos sobre esto. •  **Nuevo **: Prác(cas tutoriales de bases de datos de interacciones gené(cas y proteína-­‐proteína y medición de índice de interacción. Aula A Computadoras Biblioteca: en horario de TP. Días 15/10, 22/10, 29/10 y 5/11. TP Gené(ca Molecular 2013 Obje(vos del TP •  Familiarizarse con el concepto de interacciones gené(cas •  Aprender a realizar el procedimiento de “SGA” a escala de laboratorio y adquirir experiencia en técnicas de estudio de levaduras •  Aprender a evaluar los resultados del SGA y compararlos con publicaciones previas •  Evaluar el cambio en las interacciones gené(cas en diferentes condiciones ambientales •  Generar posibles hipótesis biológicas a par(r de los resultados TP Gené(ca Molecular 2013 Análisis de interacciones gené(cas: “SGA” Es una metodología que permite analizar a escala genómica las redes de interacciones gené(cas. En levaduras, es posible “saturar” el análisis cubriendo virtualmente todo el genoma. Midiendo un parámetro de fitness como el crecimiento, es posible definir interacciones: Nega%vas o n (sinté%cas letales o enfermas): Δab < Δa*Δb La doble mutante crece menos que el producto de las simples Neutras (no hay interacción): Δab = Δa*Δb La doble mutante crece igual que el producto de las simples Posi%vas o p (epistá%cas o supresoras): Δab > Δa*Δb La doble mutante crece más que el producto de las simples TP Gené(ca Molecular 2013 Análisis de interacciones gené(cas: “SGA” Las interacciones nega(vas frecuentemente iden(fican a genes cuyos productos están en vías paralelas o compensatorias, mientras que las interacciones posi(vas suelen iden(ficar genes que intervienen en un mismo complejo o vía TP Gené(ca Molecular 2013 Análisis de interacciones gené(cas: “SGA” Analizan interacciones gené(cas sinté(cas para el 75% del genoma de S. cerevisiae, a escala de 5.4 millones de pares génicos. Los genes con funciones similares (Go annota(on) se agrupan respecto de sus patrones de interacción, que cons(tuyen una “huella digital” de cada gen Costanzo et al, Science 2010 TP Gené(ca Molecular 2013 Análisis de interacciones gené(cas: “SGA” La mayoría de los genes presentan un bajo número de interacciones, mientras que pocos genes actúan como “hubs” presentando un alto número de interacciones, y los genes “hubs” son los que presentan feno(pos más extremos Las redes muestran dis(ntos patrones de conec(vidad por interacciones p o n La red de interacciones gené(cas no se superpone con la de interacciones lsicas (proteína-­‐proteína): muchas de las interacciones gené(cas ocurren entre complejos mas bien que dentro de un mismo complejo proteína proteína Costanzo et al, Science 2010 TP Gené(ca Molecular 2013 Network de interacciones de quinasas/fosfatasas Fiedler & Kogan, Cell 2009. Estudio de 100.000 interacciones en el network de fosforilación de S. cerevisiae. Se comparan datos obtenidos del estudio con previos datos bibliográficos: ssk2 posi(ve ubp3 nega(ve Las interacciones pueden ser posi(vas, nega(vas o neutras. La mayoría de las interacciones detectadas son neutras (gráfico de distribución). Distribución de interacciones en clases funcionales TP Gené(ca Molecular 2013 Network de interacciones de quinasas/fosfatasas Ejemplo de interacciones detectadas en la vía de MAP kinasas HOG (high osmolarity glycerol). Verde: Kinasas; Rojo: fosfatasas Interacciones posi(vas entre quinasas y reguladores nega(vos y nega(vas de los reguladores nega(vos entre sí Análisis de dinámica del network y ciertas vías frente a cambios en esqmulos ambientales (vía HOG es(mulada en rta a alta osmolaridad) Reportan diferencias significa(vas entre los datos de literatura y datos reportados en el estudio: a qué pueden deberse? Fiedler & Kogan, Cell 2009 TP Gené(ca Molecular 2013 Network de interacciones de quinasas/fosfatasas Se pueden analizar mo(vos triplete que presentan combinaciones de interacciones Y establecer patrones de la organización de la red Fiedler & Kogan, Cell 2009 TP Gené(ca Molecular 2013 Desarrollo del TP •  Cruzaremos dos cepas “bait” (con deleciones en los genes ssk2 y ubp3) con una mini colección (array) de 48 knock-­‐outs seleccionadas del genoma de S. cerevisiae •  Seleccionamos para el array a genes que (enen demostrada interacción gené(ca con los genes “bait” (Fiedler et. al., 2009): la lista está en la guía •  Ssk2 es una de las MAPKKK de la ruta de señalización en respuesta a alta osmolaridad •  Ubp3 es una proteasa procesadora de ubiqui(na que la libera de sus sustratos. Ubp3 interviene en la respuesta a señales ambientales y su mutación altera la función de muchas otras proteínas TP Gené(ca Molecular 2013 Procedimiento del SGA Paso 1: Se aparea la cepa “bait” con La colección o “array”. Luego de esto se seleccionan las diploides en medio Nat + G418. Medio YEPD rico Paso 2: Se induce la esporulación de las diploides heterocigotas para generar esporas haploides. Medio SPO bajo en nitrógeno y glucosa Paso 3: Se seleccionan las levaduras haploides MATa simples mutantes del array u(lizando el “magic marker” (en nuestro caso Pste2-­‐his3+). Medio definido -­‐His. Contraselección de diploides con canavanina y (laisina Paso 4: Se seleccionan las levaduras haploides MATa dobles mutantes. Mismo medio KanR que el paso 3 con can, (ali, Nat y G418 Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 TP Gené(ca Molecular 2013 Desarrollo del TP: Cronograma Día Labo Descripción Notas 8/10 Martes Ma(ng Apareamiento de cepas “bait” con array Los docentes hacen la selección de diploides 15/10 Martes Esporulación Esporulación en medio con bajo Nitrógeno Prác(ca Aula A: Bases de datos 22/10 Martes Germinación Selección MATa haploides alta y baja osmolaridad Prác(ca Aula A: Bases de datos 29/10 Martes Selección Dobles Mutantes Selección MATa haploides dobles mutantes en alta y baja osmolaridad Parcialito prác%co 45 min Prác(ca Aula A: PFAM/ImageJ 5/11 Martes Observación de resultados Documentación y medición de índices de interacción Prác(ca Aula A: Mediciones ImageJ 20/11 Jueves Exposiciones orales Exposiciones de 25 minutos por grupo TP Gené(ca Molecular 2013 Geno(po de las cepas a usar •  Cepas haploides “bait” MATα yyyΔ::natR can1::Pste2-­‐Sp_his5+ lyp1Δ his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 • 
yyyΔ::natR: deleción del gen ssk2 o ubp3 e inserción en ese locus del gen de resistencia a nourseothricin • 
can1::Pste2-­‐Sp_his5+: Pste2-­‐Sp_his5+ es el magic marker que permite seleccionar cepas haploides MATa en medios sin his(dina. his5+: gen de S. pombe que confiere la posibilidad de crecer en medio sin his(dina. Este magic marker además deleciona el gen can1 • 
lyp1Δ: deleción del gen LIP1 el cual en estado salvaje confiere en forma dominante sensibilidad a los análogos de aminoácidos arginina y lisina. • 
his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0: Los genes endógenos HIS3 LEU2 URA3 y MET15 están mutados en esta cepa. Cepas Bait: resistente a Nat, sensible a G418, resistente a canavanina y (alisina TP Gené(ca Molecular 2013 Geno(po de las cepas a usar •  Cepas haploides Array MATa xxxΔ::KanR CAN1 LYP1 his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 •  xxxΔ::KanR: deleción individual de los 48 genes del array e inserción en ese locus del gen de resistencia a G418 • 
CAN1 LYP1: genes salvajes CAN1 y LIP1 los cuales en estado salvaje confieren en forma dominante sensibilidad a los análogos de aminoácidos arginina y lisina • 
his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0: Los genes endógenos HIS3 LEU2 URA3 y MET15 están mutados en esta cepa. Cepas colección: resistente a G418, sensible a Nat, sensible a canavanina y (alisina TP Gené(ca Molecular 2013 Geno(po de las dobles mutantes obtenidas •  Cepa doble mutante haploides Array MATa xxxΔ::KanR yyyΔ::natR can1::Pste2-­‐Sp_his5+ lyp1Δ his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 • 
xxxΔ::KanR yyyΔ::natR : doble mutante para el gen “bait” y para cada una de las mutantes del array de la colección. • 
can1::Pste2-­‐Sp_his5+: permite a la cepa Mata haploide crecer en medio sin his(dina. • 
his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0: Los genes endógenos HIS3 LEU2 URA3 y MET15 están mutados en esta cepa. Dobles mutantes: Haploides MATa resistentes a Nat y G418, resistentes a canavanina y (alisina, crecen en medio sin his(dina TP Gené(ca Molecular 2013 Desarrollo del TP: Día 1 Ma(ng Cepa “bait” MATα ubp3Δ::natR Array 48 mutantes MATa xxxxΔ::KanR Suspensión de las cepas “bait” a par(r de un césped crecido en placas con medio rico YEPD 100µl 1-­‐ rastrillar la cepa “bait” en la placa. Cuidar que la distribución sea homogenea!! 2-­‐ Pinear la colección sobre el césped. Placas de petri con medio: YEPD-­‐Agar Incubar a temperatura ambiente (RT) por 24hs TP Gené(ca Molecular 2013 Desarrollo del TP: resultado del Ma(ng Cuidados: Distribuir bien la cepa “bait” al rastrillar para que haya material para el ma(ng Tener los cuidados para el pineo que vamos a describir a con(nuación Selección de diploides (lo hacen los docentes): Pinear de la placa de ma(ng a una placa de petri con medio: YEPD-­‐Agar + G418 + Nat Incubar a 30°C por 48hs TP Gené(ca Molecular 2013 Desarrollo del TP: resultado de la selección de diploides El martes 15/10 comenzaremos a trabajar con la placa que ya (ene la selección de diploides, que se verá (si todo salió bien!) así: En esta placa crecieron solamente las levaduras diploides que portan cada una de las mutaciones provenientes de la cepa “bait” y el array en heterocigosis. Por qué no crecen haploides? TP Gené(ca Molecular 2013 Controles de reac(vos y cepas •  Nat y G418: u(lizados para seleccionar las mutaciones de los genes “bait” (NatR) y del array (KanR) tanto antes como después de la esporulación Condicion: YEPD + Amp YEPD + Amp + G418 YEPD + Amp + Nat YEPD + Amp + G418 + Nat Colección + + -­‐ -­‐ TP Gené(ca Molecular 2013 Controles de reac(vos y cepas •  Nat y G418: u(lizados para seleccionar las mutaciones de los genes “bait” (NatR) y del array (KanR) tanto antes como después de la esporulación Condicion: YEPD + Amp YEPD + Amp + G418 YEPD + Amp + Nat “Bait” Δubp3 + -­‐ + “Bait” Δssk2 + -­‐ + Δubp3 Δssk2 TP Gené(ca Molecular 2013 Controles de reac(vos y cepas •  Canavanina y Tialisina (análogos de arginina y lisina): usados para eliminar diploides luego de la esporulación Condicion: KanR(+HIS) Amp KanR(+HIS) Amp + can + %ali KanR(-­‐HIS) Amp + can + %ali Colección + -­‐ -­‐ Cepa “Bait” + + -­‐