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Estudios de interacción de proteínas
utilizando sistemas bacterianos.
Dra. Laura Klepp
Las redes de interacciones entre proteínas pueden representarse
gráficamente mediante grafos.
El conjunto de interacciones entre todas las proteínas de una célula
recibe el nombre de interactoma.
 Para poder analizar una red de interacción de proteínas con la
teoría de grafos necesitamos una gran cantidad de datos de interacción
entre proteínas que las relacionen entre sí.
 Existen disponibles en la red bases de datos como la “Database of
Interacting Proteins” (DIP) especializadas en interacción entre
proteínas de diferentes organismos.
La gran ventaja de la elaboración del interactoma de una célula consiste en
poder tener una visión en conjunto de la maquinaria celular, pudiéndose predecir a
nivel global las repercusiones que se originan en alteraciones puntuales.
Ejemplos:
• Poder predecir los efectos secundarios producidos por el uso de una droga que
actúa aparentemente solo en un elemento de la maquinaria celular pero cuyo
efecto puede notarse en elementos muy alejados.
• Poder seguir las alteraciones moleculares producidas por una enfermedad como
el cáncer o por un patógeno para conseguir estrategias más eficientes en su
tratamiento.
Técnicas usadas para estudiar interacciones
proteína- proteína
Sistema TAP (tandem affinity purification)
Las proteínas del complejo se identifican por Western blot o por MALDI
Ensayo de GST- pull down
Sistema de co- inmunoprecipitación
Doble híbrido en levaduras
Sistema más comúnmente utilizado: Gal4, que controla la expresión del gen LacZ.
Screening para encontrar interacciones a
gran escala
Limitaciones del sistema de doble híbrido en levaduras
 No puede usarse en el caso de proteínas que inicien la transcripción por
ellas mismas.
 El uso de secuencias quimeras puede implicar una dificultad, ya que la
fusión puede llegar a cambiar la estructura y el plegado de la proteína.
 Las modificaciones postransduccionales difieren entre las levaduras y
otros organismos, por lo que puede ser difícil realizar un screening de
interacciones entre proteínas de mamíferos o de procariotas usando el
sistema de doble híbrido en levaduras.
Doble híbrido en bacterias
Se aprovechan las características de la adenilato ciclasa de Bordetella
pertussis que está conformada por los fragmentos complementarios T25 y T18.
 Se utilizan cepas de E. coli deficientes en adenilato ciclasa endógena: DHM1
o BTH101.
 Los plásmidos pKT25- Zip y pUT18c- Zip, los cuales codifican para cierres de
leucinas capaces de interactuar, constituyen el control positivo del sistema.
Interacción de Erp con el proteoma de
M. tuberculosis
 Se sabe que las proteínas Erp son reconocidas por sueros de pacientes
tuberculosos, por lo que son antigénicas.
 Se demostró que estas proteínas están asociadas a la virulencia de M.
tuberculosis y M. bovis, ya que la inactivación por reemplazo alélico de Erp
genera una importante disminución en la replicación de estas bacterias en
ratones inmunocompetentes y macrófagos murinos.
 El papel que estas proteínas desarrollan durante el proceso de infección es aún
desconocido.
 Con el objetivo de aproximarnos a la función biológica de la familia de proteínas
Erp, se buscaron proteínas capaces de unirse a Erp, mediante el screening de
una genoteca de expresión de M. tuberculosis, utilizando el sistema de doble
híbrido en bacterias.
Erp
Genoteca de M.
tuberculosis en
BTH101
pKT25
pUT18C
Plaqueo en M63
lactosa/Xgal
BTH 101
5 días de
cultivo a
32° C
Aislamos dos clones cuyos insertos codificaban para proteínas
con capacidad de interactuar con Erp. Los insertos contenían los
ORFs Rv1417 y Rv2617c de M. tuberculosis, los cuales codifican
para proteínas de función desconocida que poseen similitud a
proteínas de membrana y transmembrana de otras especies
bacterianas.
 Medio M63 con lactosa como única fuente de carbono y X-Gal. A:
control negativo; B: interacción de Rv1417 con Erp.
 Observamos que Rv1417 y Rv2617c también son capaces de
interactuar entre sí, lo que indica que éstas proteínas podrían formar una
macroestructura de superficie junto con Erp.
TP de doble híbrido en bacterias
Tubo
1
2
3
4
5
Plásmidos
(6 ng de cada
uno)
pKT25-Zip
+ pUT18c-Zip
pKT25-Rv1417
+ pUT18cRv1417
pKT25
+ pUT18c- Rv1417
pKT25- Rv1417
+ pUT18c
pKT25 +
pUT18c