Teórica CSK Prim Parte blanco y negro.pdf

Arquitectura celular:
El citoesqueleto
Graciela L. Boccaccio
QBIIA 2016
-composición
-dinámica
-modificadores
Tubulina
NIH 3T3
Actina
El citoesqueleto: Red dinámica de filamentos proteicos:
(POLIMEROS NO COVALENTES)
Microfilamentos (8 nm): polímeros
bicatenarios de actina que forman cordones
lineales y arreglos “geles” bi- o tri
dimensionales.
Define morfología superficie celular (filopodios,
lamelipodios)
Pueden estar anclados a la membrana
plasmática.
Microtúbulos (25 nm): cilindros de a y b
tubulina. Más rígidos que los microfilamentos con un extremo asociado a un
centrosoma (MTOC: centro organizador
de microtúbulos)
Filamentos intermedios (10 nm):
proteínas fibrosas que proporcionan
resistencia mecánica a la célula. Suelen
estar anclados a la membrana plasmática.
Tilney and Porter
J.Cell Biol (1967)
25 nm
Microscopía
electrónica
MICROTUBULOS
Modelo de
plastilina
EM de Cono de crecimiento axonal
1 um
Burnette et al Nat Cell Biol 2007
F-Actina
Tubulina
Con los mismos componentes, las células elaboran distintos CSK y presentan distintas morfologías
Notar grosor de F-actin en fibroblastos (fibras de estrés) vs microtubulos
Filamentos
intermedios
Los tres tipos de filamentos interactúan
Tambièn: interacción de microfilamentos (citosol), vía nestin, con
filamentos nucleares de laminas
Cardiomiocitos:
“ondulado” periódico de los MT
acoplado a las contracciones
Microfilamentos : polímeros lineales y polares
de actina
+
extremo “+” crece
extremo “-” depolimeriza
Actina
alfa-actina (4 genes distintos): células musculares
beta-actina (lamelipodios) y gama-actina (stress fibers) : ubicuas (5 aa dif).
actividad ATPasa !!! (hexokinasa del ciclo glucólisis)
universal entre eucariotas (ancestro procariota?)
-altísima homología (374-375 aa: 80 % identidad entre amebas y humanos)
-muy abundantes:
actina (y miosina) entre las TOP 5 en abundancia entre las proteínas naturales
actina en células musculares: 10 % (60 % actina-miosin)
células no musculares: 5 % (0.1-5 mM, 100 millones moléculas/célula!!!)
Presenta NES
(señales de exportación nuclear)
Microtúbulos : polímeros lineales y polares
de tubulina
beta
Tubulina: (GTPasa flia Ras;
procariotas: FtsZ)
alfa, beta, gama, delta tubulina
y variantes de éstas
Subunidad: dímero
alfa
mamíferos (ratón): 7 genes alfa-tubulina
8 genes beta-tubulina
-muy homólogas (90% alfa-tub; 78-90 %
beta-tub)
-diferencias en C-terminal (15 aa) (zona
expuesta del MT)
-alta heterogeneidad de dímeros y de MT.
-MT muy regulados por diversas
modificaciones post-traduccionales
(PTMs)
Microtúbulos
Polímeros tubulares constituidos por heterodímeros de a- y b-tubulina
• Polìmero lineal y polar: el extremo “+”
(tub beta) polimeriza 3 veces más rápido
que el extremo “-” (tub alfa)
• En general, se originan en el
centrosoma, ubicado en la cercanía del
núcleo, y crecen hacia la periferia celular
Beta-tubulina
Gamma tubulina
Actina
M. Loschi,
Nucleación de los microtúbulos
Gama-tubulina: capaz de reclutar subunidades
Anillos: gama-Tubulin Ring Complex (gama-TuRC)
centrosoma
-Crecen hasta que se “chocan” con algo (ej
membrana plasmática)?
-Dejan de crecer “porque sí”?
Microtúbulos
Inestabilidad dinámica :
Rescate
Catástrofe
(varias veces por min)
Esta es la forma mas importante de controlar la longitud de los
microtúbulos, cuyo extremo - está en gral. capturado en el centrososma.
En microtúbulos libres, también se observa treadmilling
-1984: se lo observó in vitro
-posteriormente se lo confirmó en vivo
En general, los microtúbulos están anclados al MTOC ubicado en el centrosoma, y
presentan los extremos + en la periferia celular. En esta región se observa inestabilidad
dinámica.
Si un microtúbulo se desprenden del MTOC, expone sus extremos – y puede
experimentar “treadmilling” o depolimerización completa.
Células altamente polarizadas presentan arreglos especiales de microtúbulos, con
polaridad mixta. Ej: dendritas neuronales; microtúbulos corticales de células
epiteliales (polaridad basolateral-apical). Estas presentan numerosos MTOCs en la
zona apical, donde se concentra gamma-tubulina.
Polaridad de los microtúbulos
CCW
-
-
+
CW
Scale bar, 0.2 µm.
Microfilamentos : dinámica
Treadmilling (movimiento de noria) en F-actina
+
-
• Extremo (+) o barbado: rápida
polimerización
• Extremo (-) o punta es de
polimerización lenta
La polimerización requiere de ATP
unido al monómero de actina
La hidrólisis de ATP a ADP debilita
la afinidad entre monómeros
• Pequeñas proteínas controlan la
polimerización
Polaridad de los microfilamentos
Orientación de F-actin in
cono de crecimiento axonal:
Largos + end hacia el
leading edge,
Cortos: orientacion mixta
JCB Lewis, 1999
100 nm
Filamentos intermedios : proteínas fibrosas
2
N TERMINAL: (6-1200 AA),
POLIMERIZACIÓN: NO NUCLEACIÓN, FOSFORILACIÓN
4
8
32
8-10 nm
Cabezas globulares=entrecrutamiento (covalente)
Filamentos intermedios (no polares) : proteínas fibrosas
2 (polar)
N TERMINAL: (6-1200 AA),
POLIMERIZACIÓN: NO NUCLEACIÓN, FOSFORILACIÓN
4 (apolar)
8
32
8-10 nm
Cabezas globulares=entrecrutamiento (covalente)
Filamentos intermedios:
Existen cientos de proteínas fibrosas distintas, agrupadas en familias
PROTEINA
LOCALIZACION
Lamins A, B, C
lamina nuclear (lado interno envoltura nuclear)
Vimentina
mas o menos ubicua
Desmina
músculo
GFAP (glial fibrillary acidic protein)
astrocitos
Periferin
ciertas neuronas
Keratinas tipo I (acídicas)
Keratinas tipo II (básicas)
celulas epiteliales y apéndices (pelos, uñas)
(variedad: 10-20)
Neurofilamento (NF L, H, M)
axones
NFL + NFH o NFM, densamente empaquetados Neurofilamentos controlan calibre axonal = transmisión impulso
-Estables quimicamente (purificacion diferencial)
Polimerizacion no requiere ATP/GTP
Regulacion por fosforilacion (mitosis)
IFAPs
El citoesqueleto es dinámico
1970s: estable
microtúbulos
cromosomas
actual: remodelamiento es crucial para muchas funciones
celulares:
-mitosis
-cambios en forma celular (extravasado de linfocitos)
-movilidad
-extensión de lamelipodios, filopodios y prolongaciones en
general
-plasticidad sináptica
-activación de TCR linfocitos T (y otras vías de señalización)
Interés farmacológico:
Robotización y Screening automatizado de fenotipos
($$$$$$$$$$)
-CANCER: antimitóticos (1980) (taxanos (TAXOL), alcoloides de vinca, criptofisinas, estramestina)
-afectan también células sistema inmune (médula), folículos pilosos, células intestinales
-Resistencia a taxol (Goncalves et al., PNAS 2001)
-neurotóxicos (transporte axonal dependientes de microtúbulos)
-Fibrosis quística: viscosidad del esputo disminuye con agentes depolimerizantes de actina (gelsolina)
-Infecciones por hongos
-Enfermedades cardiovasculares
Drogas que afectan microtúbulos
Taxol:
colchicina,
colcemida:
se une lateralmenrte a los microtúbulos y los estabiliza.
Microtúbulos supernumerarios, ondulados, engrosados.
Compite con tau (MAP). Antineoplásico.
se une con distinta afinidad a dímeros y a microtubulos.Cambia conformación, hidroliza GTP, Impide polimerización
vinca alcaloides:
vinblastina
vincristina
unen subunidades y al extremo + e impiden polimerización
(afectan recambio GDP.Pi en el cap (50% normal))
nocodazole
unen subunidades e impiden polimerización
Colchicina: une a dímeros de
tubulina, activando la actividad
GTPasa. Previene polimerización.
de microtúbulos.
Antimitótico (huso mitótico),
neurotóxico, teratogénico.
Drogas que afectan microfilamentos
falloidina (19..)
une y estabiliza filamentos
citocalasinas (1950)
bloquea extremo +: no permite polimerización
swinholide (1995)
se une a dímeros de actina y a microfilamentos,
fracturándolos. (Similar a gelsolina)
Latrunculina
y tolytoxina
secuestran subunidades
Citocalasina B: Inhibe polimerización
de actina por bloqueo del extremo en
crecimiento. Inhibe el anillo contráctil.
Afecta LTP, transporte de glucosa,
apoptosis y movilidad celular.
Tratamiento con nocodazol
Prolongaciones
celulares
El equilibrio dinámico o estabilidad
varía en distintas regiones
subcelulares.
Cuerpo celular
Tiempo de exposición a nocodazole
ACTINA TIAR
(cytochalysin B)
M. Loschi,
1 um
250 nm
EM de Cono de crecimiento axonal
Los “bundles” desaparecen rapidamente con Cytochalasin B (baja concentración, 7 min)
Burnette et al Nat Cell Biol 2007
Los microfilamentos se reorganizan durante
la migración celular
polimerización
De-polimerización
Microfilamentos : dinámica
Treadmilling (movimiento de noria) en F-actina
+
-
El filamento de actina es una
estructura polar
• Extremo (+) o barbado de rápida
polimerización
• Extremo (-) o punta es de
polimerización lenta
La polimerización requiere de
ATP unido al monómero de
actina
La hidrólisis de ATP a ADP
debilita la afinidad entre
monómeros
Pequeñas proteínas controlan la
polimerización
Tres Grupos de Nucleadores de Actina.
Todos tienen dominio WH2 de unión a actina
ARP2/3 : ramificaciones sobre filamentos preexistentes, pobre nucleador de novo
.
Forminas: dímeros ensamblan filamentos lineales
Tercer grupo: Cordon-Bleu (Cobl), Spire y
Leiomodin. Unen monómeros y facilitan su
agregación
Remodelación de microfilamentos: ejemplo en extensión de lamelipodios y migración celular
indicando “formación de lamelipodia”
Thymosin (secuestra monomeros)
0
indicando “formación de lamelipodia”
Thymosin
1
Thymosin
2
WASP: Wiskott-Aldrich Sindrome protein
Thymosin
2
Thymosin
3
Thymosin
4
Thymosin
5
Thymosin
6
50 % actina es g-actina (50-200 uM)
Como se regula la polimerización de actina (cortex) ?
1. Profilina: interviene en la polimerización
une G-actina,
secuencia: 1. intercambia ADP-ATP,
2. actina ATP-profilina se une a extremo +
3. se libera profilina
-se une a membranas fosfolipídicas
-Regulada por fosforilación (conecta signaling con el CSK de
actina):
Thymosina beta-4: inhibe la polimerización
Secuestra g-actina,
ARP 2/3 complex
contiene
Arp 2
Arp 3
p40
p35
p18
p14
Es estrictamente regulada (proteínas de la flia WASP)
ADF/ cofilin: (15-19 kD)
Se une lateralmente (1:1),
preferentemente a actina-ADP, cambia conformación === depolimeriza
dónde?
-en regiones subcelulares con remodelamiento microfilamentos:
(movilidad celular y citokinesis)
cómo?
Regulada por:
-LIMK 1 (responde a diversas kinasas)
-fosfatasas (dependientes y no dependientes de Ca)La forma desfosforilada tiene localización nuclear (lleva actina)
Caping (CP): heterodímero alfa/beta,
une a extremo + === estabiliza e impide polimerización,
inhibida por PIP2.
Gelsolina: caping y depolimeriza, regulada por polifosfoinosítidos (PIP2)
Vitriol and Zheng, Neuron 2012
Vitriol and Zheng, Neuron 2012
Maduración de espina dendrítica
Endosomas y Movimiento de Listeria monocytogenes
ActA: en la superficie
de la bacteria
(activador de Arp2/3)
La bacteria es un puntito
azul en la cabeza del
cometa
A diferencia de los microtúbulos, la nucleación de microfilamentos puede ocurrir en
muchos sitios dentro del citoplasma. Por ejemplo, asociado a las membranas de
ciertas organelas que utilizan “cometas de actina” para desplazarse.
Las organelas y membrana plasmática son “impulsadas” por el crecimiento de Factina. (Modelo favorito: efecto de látigo o “mov browniano elástico”).
Los microfilamentos tienen polaridad muy heterogénea. Sus extremos + y – libres
están expuestos a polimerización y depolimerización, lo que se conoce como
treadmilling.
A diferencia de microtubulos y microfilamentos, los filamentos intermedios no
requieren un paso de nucleación para iniciar su polimerización.
En que funciones celulares es relevante
el citoesqueleto?
-morfología y movilidad celular
-organizaciòn intracelular: andamiaje y
transporte intracelular
Cómo se regula el CSK?
proximamente...