Teorica 1 DAlessio.pdf

Compartimentalización celular (II):
vía secretoria y transporte vesicular
Cecilia D’Alessio
2016
[email protected]
Destino de proteínas codificadas por el
núcleo en la célula eucariota
Vía
secretoria
La señal para la localización subcelular está en la
secuencia de la proteína
Las señales de direccionamiento a organelas están en la secuencia
proteica, son reconocidas por receptores específicos de las organelas y
muchas veces clivadas por peptidasas de señal específicas
Compartimentalización celular y sorting de
proteínas según tipo de transporte
Transporte por compuertas:
transporte entre espacios
diferentes funcionalmente pero
equivalentes topológicamente
(poro nuclear)
Transporte transmembrana:
desde el citosol a espacio
distinto topológicamente
(translocador)
Transporte vesicular: no se
atraviesan membranas. Los
compartimientos son iguales
topológicamente (vesículas
que se escinden y fusionan)
Transporte vesicular
En las células eucariotas el transporte de proteínas (solubles y de
membrana) y de lípidos, de y hacia el exterior y entre compartimentos
subcelulares se hace por transporte vesicular.
Topología en el transporte vesicular
Proteínas luminales o de
membrana: durante todo el
transporte se mantiene la
topología
Vía secretoria
El retículo endoplásmico (RE) es el sitio de entrada
de las proteínas de la vía secretoria
Plegamiento
Oligomerización
Modificaciones Posttraduccionales
Las modificaciones postraduccionales que pueden
sufrir las proteínas en el RE son muy variadas
Maduración del polipéptido naciente en la vía secretoria
Proteólisis del
péptido señal
N-Glicosilación
S
S
70% de las
proteínas de la
vía secretoria
están Nglicosiladas
Formación de
puentes disulfuro
GPI
Pro
Agregado de
ancla de
glicofofatidil
inositol (GPI)
Isomerización
de prolinas
El aparato de Golgi es el sitio de remodelación de
glicanos y de sorting de la vía secretoria
(Entrada)
(Salida)
6-7 cisternas achatadas como pan árabe:
cis, medial y trans. Las caras cis y trans
están asociadas a una red de vesículas
llamadas CGN y TGN (Cis o Trans-Golgi
Network)
http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation1002.html
Aparato de Golgi
•
•
•
•
Formado por cisternas que maduran (cis, medial y trans, cada una con funciones
específicas). Las proteínas sufren modificaciones sucesivas y cuando llegan a la
cara trans son seleccionadas y enviadas a su destino final.
Síntesis de glicolípidos como glicoesfingolípidos (cerebrósidos, gangliósidos,
etc): tienen gran asimetría en su distribución en las bicapas lipídicas.
O-glicosilación
Remodelación de N-oligosacáridos en las glicoproteínas
Función de N-glicanos
Control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en el RE
Golgi
GIIα
GIIβ
Folded species
MRH
UGGT
CNX /CRT
GI
G3M9
GII
G2M9
CNX /CRT
GII
G1M9
M9
Mannosidases
ERAD
Cytosol
OS-9
MRH
Irreversibly
misfolded species
Función de N-glicanos
Funciones en el reconocimiento célula-célula y respuesta inmune
Los oligosacáridos unidos a proteínas son modificados en forma
secuencial y ordenada a medida que transitan el aparato de Golgi
alta manosa
híbridos
complejos
Remodelación de azúcares en la vía secretoria
Golgi
RE
N-Glicosilación
de proteínas y
remoción de
Glc. Control de
calidad.
Remodelación de
glicanos para formar
diversas estructuras.
Manosidasas y
glicosiltransferasas
Dadores: Nucleótido-azúcares
(GDP-Man, UDP-Gal, UDPGlcNAc, GDP-Fuc, etc)
CNX /CRT
Dador: Dolicol-PP
GI
GII
GII
citosol
Golgi
lumen
glicosiltransferasa
NDP-azúcar
NDP-azúcar + aceptor
NST
NMP
NDP
NMP
Pi
NDPasa
aceptor-azúcar + NDP
Los glicanos están expuestos al exterior celular
Glicocálix: Los glicanos son “lo primero que
ve” de la célula un anticuerpo, un ligando
(hormona, factor de crecimiento, toxina, etc)
o un patógeno (virus, bacterias, parásitos)
Función de N-glicanos
Funciones en el destino de proteínas dentro de la célula:
generación de señal de Man6P
Se agrega una GlcNAc-P a una Man, luego se remueve la GlcNAc,
dejando un residuo de Man-6-P que es reconocido por los receptores
específicos (MPR= mannose 6 P receptor) que forman vesículas con
destino a lisosomas.
MRH
Transporte vesicular
Vesícula de
transporte
cargo
Hipótesis del transporte vesicular: las vesículas geman del compartimiento
dador después de un proceso que permite la incorporación selectiva del
cargo. Las vesículas se direccionan específicamente a un compartimiento
target o receptor en el que descargan su contenido luego de la fusión.
¿Cómo se cargan las vesículas?¿Cómo
saben a dónde tienen que ir? ¿Cómo se
mantiene la identidad de cada
compartimiento?
El transporte es
altamente regulado
Señales en las proteínas (cargo) para
su localización en la vía secretoria
+
Receptores de las señales específicos
en las membranas
Signal
Sequence*
Lys-Asp-GluLeu (KDEL)
Lys-Lys-X-X
(KKXX)
Type of
Protein
Transport Step
Vesicle
Type
Signal Receptor
Golgi to ER
COP I
KDEL receptor (ERD2
protein) in Golgi membrane
Membrane Golgi to ER
COP I
COP  and  subunits
COP II
Not known
Secreted
Di-acidic (e.g., Membrane ER to Golgi
Asp-X-Glu)
Mannose 6phosphate
(M6P)
Secreted
Trans-Golgi and
Clathrin M6P receptor in Golgi and
plasma membrane to
plasma membrane; AP1 and
late endosome
AP2 adapter proteins
Tyr-X-X-ø
(YXXø)
Membrane Plasma membrane to Clathrin AP2 adapter proteins
endosome
Leu-Leu (LL)
Membrane Plasma membrane to Clathrin AP2 adapter proteins
endosome
*
X = any amino acid; ø = bulky hydrophobic residues. Single-letter abbreviations are
shown in parentheses.
Signal sequences are located in the cytosolic domains of membrane proteins.
Mecanismo molecular del transporte vesicular
Basado en:
1) Señales en las proteínas cargo
2) Receptores de señales del cargo en la membrana de
salida
3) Vesículas recubiertas
4) Proteínas adaptadoras (Adaptinas)
5) Factores citosólicos (GTP binding proteins)
6) Receptores en la membrana destino
Cubierta
Factores
citosólicos
Receptor de señal
Proteina
adaptadora
Cargo
Receptores en
membrana
destino
Mecanismo molecular del transporte vesicular
Basado en:
1) Señales en las proteínas cargo
2) Receptores de señales del cargo en la membrana de
salida
3) Vesículas recubiertas
4) Proteínas adaptadoras (Adaptinas)
5) Factores citosólicos (GTP binding proteins)
6) Receptores en la membrana destino
•
La interacción entre los dominios citosólicos de los receptores
transmembranas y las proteínas específicas de la cobertura de las
vesículas a través de proteínas adaptadoras asegura que sólo las
proteínas adecuadas sean incorporadas en una determinada vesícula.
• Una vez que deja la membrana de salida, la vesícula pierde las
proteínas de la cobertura y adaptadoras, y expone otras proteínas que
interaccionan con receptores en la membrana target, lo que asegura
que se fusione con el compartimiento adecuado.
Tipos de vesículas recubiertas
La formación de vesículas está dirigida por la polimerización de
proteínas citosólicas solubles que generan la curvatura de la
membrana.
Se describieron 3 tipos de vesículas de acuerdo a la cobertura, cada una
lleva componentes (cargo) desde un compartimiento a un destino específico
Figure 13-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Uso de diferentes cubiertas en el tránsito vesicular
Camino secretorio biosintético
Camino de recuperación
Camino endocítico
Figure 13-5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Vesículas recubiertas involucradas en el
transporte vesicular
Clatrina, COPI y COPII
Las secuencias señal en las proteínas que van a ser transportadas hacen
contacto molecular con receptores del cargo que forman parte de las
membranas de salida, que a su vez hacen contacto con proteínas
adaptadoras, que a su vez interaccionan con proteínas de cubierta específica
Vesículas recubiertas de clatrina (camino endocítico)
Tanto las vesículas provenientes de endocitosis mediada por receptor
como las que llevan hidrolasas ácidas a los lisosomas se forman con
recubrimientos de clatrina
Cada subunidad de
clatrina es un hexámero
con 3 cadenas pesadas y
3 livianas llamado
TRISKELION
Figure 13-7a, b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Armado y desarmado de la recubierta de clatrina
Especificidad: interacción cargo-receptoradaptina-cobertura
Adaptinas: capa de proteínas entre clatrina
y la membrana que une los receptores de
cargo y la clatrina. Hay muchos tipos, uno
para cada tipo de receptor
Tamaño: definido y
constante
Estructura de una vesícula recubierta de clatrina
Formación de la cubierta de clatrina
Endocitosis de vesículas revestidas por clatrina
Los fosfoinositidos (PIPs) marcan organelas y dominios de membranas:
regulación de formación y desensamblado de cubiertas de vesículas
Fosfatidilinositol
(PI): 10% de las
membranas
PI se fosforilan en
distintas
posiciones y
forman diferentes
fosfoinositidos
(PIPs)
La interconversión de
PIPs está
compartimentalizada:
en distintas organelas y
dominios de membrana
existen distintos sets
de kinasas y fosfatasas
que a su vez forman
distintos PIPs.
Muchas proteínas del
trafico vesicular unen
PIPs: se reclutan a
diferentes regiones
• El control local de fosfatasas y kinasas puede regular el binding de proteínas a
membranas
• La modificación de PIPs por fosfatasas co-empaquetadas en las vesículas
recubiertas de clatrina regula el desensamblado de la cobertura por disrupción
de la unión Adaptina-PIPs
Vesículas recubiertas involucradas en el
transporte vesicular
Clatrina, COPI y COPII
La formación y desarmado de vesículas COPI y
COPII está regulada por GTP binding proteins
(actividad GTPasa)
Sar1
GAPs
ARF
GTP
binding
proteins
GEFs
GDP
GTP
GAPs: GTPAse-activating proteins
GEFs: Guanine-nucleotide exchange factor
Las GTP binding proteins regulan aspectos
espaciales y temporales del transporte
Vesículas COPII: transporte anterógrado RE-Golgi
Las vesículas que brotan de la membrana del RE se forman con
recubrimientos COPII
3) Se curva la membrana del RE
1) Sar1-GDP se recluta a la membrana del
RE, encuentra Sar1-GEF e intercambia
GDP por GTP
2) Sar1-GTP descubre una α-hélice
anfipática que se inserta en la cara
citosólica de la membrana del RE
4) Sec23/24 son reclutadas (forman
parte de la cubierta). Sec24
interacciona con receptores de cargo
que se concentran en una región de
la membrana (especificidad)
Sec13/31 forman la estructura más
externa de las vesículas COPII
(forma jaulas que contienen la
vesícula COPII)
5) Sec13/31 son reclutadas y
la vesícula se escinde
6) Cuando Sar1-GTP se hidroliza
a Sar1-GDP, se desnuda la
vesícula y se exponen
marcadores reconocidos por
membrana target
Las vesículas COPI se forman de forma similar pero con
ARF en vez de Sar1como GTP binding protein
¿Encuentro de la membrana blanco correcta por las
vesículas?
Vesículas: marcadores de superficie que identifican origen,
cargamento y destino
Membrana blanco (target): receptores complementarios que
reconocen marcadores en vesículas
La fusión correcta depende de dos tipos de proteínas:
1) Proteínas RAB que dirigen vesículas
2) Proteínas SNARE que median la fusión (v-SNAREs y t-SNAREs)
Hay muchas RABs (también GTP binding proteins!) que funcionan como
markers de organelas y que también ciclan entre citosol y membrana
La especificidad de la unión de vesículas de
transporte está determinada por GTP binding
proteins y por v-SNAREs y t-SNAREs
¿Cómo ocurre la fusión de la vesícula con la
membrana target?
La interacción de las
proteínas SNARE (v-t) ancla
la vesícula a la membrana
target, excluye agua y
cataliza la fusión de las
bicapas lipídicas cuando
están a menos de 1,5 nm
Pares v-SNARE / T-SNARE
forman una hélice
cuaternaria (especificidad)
Toxina del tétano
(neurotoxina proteolítica):
cliva SNARES y se bloquea
la transmisión sináptica
Figure 13-17 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
El complejo v-SNARE / t-SNARE se disocia
luego de la fusión
V-SNARES vuelven a membrana dadora y pueden participar de nuevas rondas de
empaquetamiento de vesículas
Figure 13-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Enfoques para estudiar factores involucrados en el
transporte vesicular
Enfoque Genético: La acumulación intracelular de proteínas destinadas a
secreción resulta en levaduras mas densas posibles de ser separadas en
gradiente de densidad
Levadura
saccharomyces
cerevisiae
wt
Mutagénesis
Temperatura
restrictiva
centrifugación
Cruzamiento a T permisiva
MATa
MATα
cruza
1
a
2
b
3
c
4
d
5
e
6
f
Analisis a T
restrictiva
mutantes
SEC
Clases de mutantes de levaduras, según el punto en que se
encuentra interrumpida la maduración de las proteínas
Observación al microscopio electrónico
23 grupos, 23 genes!
Randy W. Schekman
Enfoque Bioquímico:
El transporte vesicular se puede reconstituir en sistemas libres de células.
• Golgi purificado de células
infectadas con proteína viral
• Sin GlcNAc transferasa
• Golgi purificado de células
sin Infectar con proteína viral
• Con GlcNAc transferasa
Purificación de diferentes sistemas de
membrana y factores citosólicos
James E. Rothman
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013
James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof
"for their discoveries of machinery regulating vesicle
traffic, a major transport system in our cells"
Camino secretorio biosintético
Camino de recuperación
Transporte anterógrado RE-Golgi
La carga de proteínas en
vesículas que salen del RE es
un proceso selectivo:
-
-
Proteínas tienen que estar
plegadas y oligomerizadas
Proteínas de membrana con
señales citosólicas son
reconocidas por componentes
COPII (que funcionan como
receptores de cargo)
Proteínas solubles tienen
señales que son reconocidas por
los receptores de cargo, a su vez
con señales citosólicas
reconcidas por componentes
COPII
Algunas proteínas residentes del RE se quedan formando agregados que no se
empaquetan en vesículas pero otras escapan junto con vesículas COPII
Steps of Vesicle Budding and Fusion
Las v-SNAREs se reciclan luego de la fusión
Transporte retrógrado Golgi-RE
Transporte retrógrado Golgi-RE
Las proteínas residentes del RE que escaparon, las vSNARES y los receptores de cargo se recuperan por
transporte retrógrado en vesículas COPI
Camino secretorio biosintético
Camino de recuperación
Transporte retrógrado Golgi-RE
La recuperación de proteínas que escapan del RE usa señales
específicas:
-Proteínas de membrana: –KKXX en el C-terminal citosólico que se une a
coberturas COPI
-Proteínas solubles: -KDEL en el C-terminal que se une al Receptor de KDEL que
las empaqueta en vesículas COPI
La afinidad del receptor de KDEL es mayor en Golgi que en el RE!
El transporte es guiado por microtúbulos
Exocitosis
Camino secretorio biosintético
Camino de recuperación
Page 799 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
La exocitosis puede seguir un camino constitutivo o regulado
La superficie de la membrana se mantiene por la relación endocitocis/exocitosis
La composición lipídica de la membrana se mantiene por la accion de
scramblasas y flipasas
Figure 12-58 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Transcitosis
Transcitosis de las Ig maternas en el
intestino de un ratón recién nacido.
Sorting en el trans-Golgi: formación
de lisosomas y endocitoscis
Camino secretorio biosintético
Camino de recuperación
Camino endocítico
Endocitosis: Fagocitosis y Pinocitosis
Endocitosis: adquisición de material extracelular en vesículas formadas de la
membrana plasmática que incluye fagocitocis (cell eating) y pinocitosis (cell drinking).
La endocitosis mediada por receptor es un tipo de pinocitosis selectiva (mas de 20
receptores conocidos usan este mecanismo).
Endocitosis mediada por receptor y
formación de lisosomas
Transport vesicles
carrying acid
hydrolases (Clathrin)
Recycling of Man-6-P
receptor
Las moléculas son incorporadas
desde el exterior celular en
vesículas que son luego
fusionadas a los endosomas
tempranos. Los receptores son
reciclados y los endosomas
maduran a tardíos. A estos se
fusionan vesículas con hidrolasas
lisosomales provenientes del
trans-Golgi. Las enzimas se
disocian de su receptor a pH
ácido y se cliva el fosfato. Los
receptores son reciclados al
Golgi. Los endosomas tardíos
maduran a lisosomas.
Generación de señal de Man6P en el tránsito por el Golgi
1) Las hidrolasas lisosomales tienen un signal patch que es reconocido por la
GlcNAc fosfotransferasa
2) Se transfiere GlcNac-P a partir de UDP-GlcNac
3) Se remueve el GlNac y descubre la señal Man6P
4) Esta señal es reconocida por los receptores de Man6P
a través de su dominio lectina (proteína que une
carbohidratos) llamado MRH
Llenado de vesículas con hidrolasas ácidas en el trans-Golgi
Lysosomal storage diseases: defecto en alguna hidrolasa, que provoca acumulación
de productos sin degradar en lisosomas
Inclusion cell-disease: forma mas grave. Falta la GlcNAc fosfotransferasa y no se
genera la señal Man6P. Todas las enzimas lisosomales son secretadas.
Maduración de lisosomas
Vesículas
recubiertas
de clatrina
Vía secretoria
(Trans Golgi)
Vesículas
con
hidrolasas
Receptores
de Man6P
pH 6.7
Vía endocítica
(Membrana
plasmática)
Endosomas
tempranos
Endosomas
tardíos
Lisosomas
pH 6
pH 5
Disminución del pH hasta 5
Los receptores de Man-6-P y de las proteínas endocitadas
se reciclan a trans-Golgi y membrana plasmática
50% de la membrana plasmática es internalizada por endocitosis mediada por
receptor cada hora!!
Se debe reemplazar a velocidad equivalente: la mayor parte se recicla y sólo el
5% se sintetiza de novo
Algunos receptores sufren “down regulation” por degradación en
lisosomas
El efecto de este proceso es remover complejos ligando-receptor de la
membrana plasmática, terminando así una respuesta a un determinado
estímulo (ej. gowth factor)
Endocitosis de LDL mediada por receptor
Partícula de LDL
Receptor de LDL
Mutaciones en la región de binding o en la cola citoplasmática
provocan hipercolesterolemia
Los lisosomas en la fagocitosis y la autofagia
Turnover de componentes celulares
Captura de partículas de comida
Defensa contra microorganismos
Eliminación de células dañadas
Bibliografía
Libros
•
•
Alberts et al. “Molecular Biology of the cell” fifth edition (2008)
Cooper, G. “The cell. A molecular approach” sixth edition
Review recomendado
•
“The Mechanisms of Vesicle Budding and Fusion” Juan S. Bonifacino and
Benjamin S. Glick. Cell, Vol. 116, 153–166, January 23, 2004
Papers fundacionales recomendados
•
•
“Identification of 23 complementation groups required for post-translational
events in the yeast secretory pathway”. Novick P, Field C, Schekman R.
Cell. 1980 Aug;21(1):205-15
“Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE
proteins.” McNew JA, Parlati F, Fukuda R, Johnston RJ, Paz K, Paumet F,
Söllner TH, Rothman JE. Nature. 2000 Sep 14;407(6801):153-9