verificación de especie por inmunodifusion en agar

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VERIFICACIÓN DE ESPECIE POR
INMUNODIFUSION EN AGAR
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1. OBJETIVO
Determinar la especie en músculo de animales de origen terrestre.
2. ALCANCE
El ámbito de aplicación es en músculo fresco de bovino, porcino y equino. Este ensayo se realiza por
prueba de inmunodifusión en gel de agar.
3. RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD
Analistas Encargados(as) de esta técnica según lo indique el Registro de Distribución de Técnicas
IA-RECAT-PE-004-RE-001. La supervisión la realiza el Jefe de Sección o quien delegue.
4. DEFINICIONES
No Aplica
5. ABREVIATURAS Y/O SIGLAS
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IA: Inocuidad de Alimentos
RECAT: Residuos y Contaminantes en Alimentos de Origen Terrestre
PT: Procedimiento Técnico
PE: Procedimiento Específico
RE: Reportes
6. REFERENCIAS Y/O BIBLIOGRAFÍA

IA-RECAT-PE-004-RE-001 Distribución de Técnicas

IA-RECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis

IA-RECAT-PT-005-RE-001 Hoja de Trabajo y Reporte de Resultados de Verificación de Especie

IA-RECAT-PT-005-RE-002 Controles Intralaboratoriales de Verificación de Especie.

Ingraham, J., C. Ingraham. 1999. Introducción a la microbiología. Primera edición, Editorial Reverté,
Barcelona, España.
7 . DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
Fundamento Teórico
El método consiste en la verificación de especie a partir de una muestra de músculo animal, empleando
el método de inmunodifusión en agar noble.
La prueba de inmunodifusión en agar es un tipo de precipitación que se realiza en una placa petri que
contiene una determinada cantidad de agar noble, en la cual una vez solidificada se le hacen orificios
(uno central y seis laterales).
En los pocillos centrales se colocan las respectivas preparaciones de antisueros y en los laterales las de
las muestras y controles. Las moléculas de proteína de los antisueros y las muestras difunden a través
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del agar hasta que entran en contacto y, si hay reacción, se producen los precipitados. Las zonas donde
se produce el precipitado forman líneas blanquecinas denominadas líneas de precipitación, que destacan
sobre el fondo del agar.
Los antisueros son obtenidos del plasma de la sangre de las especies bovina, suina y equina, las cuales
contienen proteínas de alta pureza que reaccionan con proteínas homólogas, es decir de la misma
especie. Si la muestra posee proteínas homólogas a las del alguno de los antisueros, van a generar la
línea de precipitación, por lo que se dice que son de la misma especie. En el caso contrario, no se
formará la línea de color blanco.
7.1 Materiales, Reactivos y Equipos
7.1.1 Materiales
-
Micropipeta (con capacidad de 100 ul)
Pipeta graduada de 25 ml
Beaker de 100 ml
Placas Petri de 10 x 100 ml
Erlenmeyer 50 ml con tapa
Embudos
Troquel o molde para hacer los pocillos en las placas
Filtros de papel (preferiblemente Whatman # 4)
7.1.2 Reactivos
-
Antisueros:
Bovino (Bovine Whole serum, SIGMA, B8270)
Equino (Horse Whole serum, SIGMA, H8890)
Suino ( Pig Whole serum, SIGMA, P3164)
Otros
Nota: Los antisueros se almacenan en congelación.
Agar noble
NaCl
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)
NaOH 1 M
Disolución salina al 0,85 %
Disolución salina amortiguadora ( NaCl al 0,85% y pH ~7,2)
Disolución base amortiguadora con fosfatos y pH ~7,2
7.1.2.1 Preparación de disoluciones:
-
- Disolución salina 0,85 %: Disolver 8,5 g de NaCl en 1000 ml de agua destilada.
o Disolución base amortiguadora de fosfato: Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 ml de agua
destilada, ajustar el pH a 7,2 aproximadamente con NaOH 1M. Diluir con agua destilada a 1
L y guardar en refrigeración.
Disolución salina amortiguadora: Ajustar el pH de la disolución salina 0,85 % a 7,2
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aproximadamente con la disolución amortiguadora de fosfatos.
Nota: todas las disoluciones anteriores se almacenan en refrigeración
Agar noble al 1 %: Agregar 1 g de agar noble en 99 ml de disolución salina amortiguadora.
Calentar y agitar la mezcla en plantilla hasta disolver el agar y esperar a que la disolución se
vuelva transparente cuando da inicio la ebullición. Apartar del calor y utilizar de inmediato.
-
7.1.3 Equipo
-
Procesador de muestras
pHmetro
Plantilla de calentamiento con agitación
Balanza electrónica
Recipiente metálico
7.2 Equipo de Protección
-
Gabacha
Anteojos
Guantes
7.3 Condiciones de Almacenamiento de Muestras
El músculo debe mantenerse en refrigeración hasta que se analice; una vez analizado la contramuestra
se mantiene en congelación durante 3 meses aproximadamente.
7.4 Preparación de las placas con agar neutro
7.4.1
7.4.2
Colocar las placas Petri en una superficie plana y adicionar aproximadamente 12 ml de la
disolución de agar al 1% (caliente). Dejar las placas destapadas para que se solidifique el agar y
guardarlas en una bolsa en refrigeración. No utilizar las placas si éstas están deshidratadas o con
algún crecimiento microbiano.
Los pocillos de las placas se pueden hacer antes de almacenarlas o cuando se va a realizar el
ensayo. Solamente se deben sacar las placas necesarias según la cantidad de muestras. Con la
ayuda de vacío se extraen los remanentes de agar de los pocillos marcados así como la
humedad contenida en los mismos, dejando los orificios listos para utilizar.
7.5 Preparación de la muestra
7.5.1 Cortar porciones de las orillas y del centro de la muestra, tratando de retirar el tejido adiposo. Los
trozos extraídos se cortan en trozos más pequeños que se homogenizan en un procesador de
muestras.
7.5.2 Medir 10 g de muestra procesada en un beaker de 100 ml y agregar 40 ml de disolución salina al
0,85% y dejar reposar como mínimo 90 minutos. El homogenizado sobrante (contramuestra) se
guarda en congelación por 3 meses.
7.5.3 Finalmente se decanta y filtra el líquido a través de un papel filtro (preferiblemente Whatman # 4)
trasvasando el líquido a un erlenmeyer de 50 ml con tapa.
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7.6 Preparación de las placas con los antisueros y las muestras
7.6.1 Una vez atemperados los antisueros se inicia el montaje de las muestras en las placas de Petri.
7.6.2 Con una micropipeta se llenan los pocitos centrales del troquel con los antisueros que
corresponden..
7.6.3 Alrededor de cada antisuero se debe colocar al menos un control positivo de las matrices
conocidas.
7.6.4 Luego se llenan los demás orificios con las muestras a analizar por duplicado.
7.6.5 Una vez adicionadas todas las muestras, se tapa la placa, y se coloca un papel filtro ligeramente
humedecido en el fondo del recipiente metálico, luego se guarda cuidadosamente (sin mover
bruscamente la placa) dentro de éste. Debe dejarse ahí a temperatura ambiente por un lapso entre
18 a 24 horas.
7.6.6 Una vez transcurrido el tiempo se debe observar la placa en dirección a una fuente de luz. Se
notará la formación de unas líneas de color blanco entre el orificio central y algunos extremos. Si se
producen esas bandas o líneas continuas significa que el antígeno del antisuero y los antígenos de
la muestra son homólogos, o sea son de la misma especie. Si las líneas se entrecruzan o no hay
formación de línea, la especie de la muestra es diferente a la del antisuero.
7.6.7 Los controles intralaboratoriales se montan de la misma manera que se hace con las muestras, a
excepción, que se utilizan solamente los controles positivos de las diferentes especies.
7.7 Resultados
De formarse una línea de precipitación entre el antisuero y la muestra, se concluye que la muestra es
positiva a la especie del antisuero, y se reporta como la matriz correspondiente (o sea, Bovino, Suino,
Equino, etc). Si no se forma la línea, se concluye que la muestra es negativa, y se reporta como la matriz
correspondiente.
7.8 Reporte de Resultados
El reporte de los resultados se hace de acuerdo al formulario IA-RECAT-PT-005-RE-002 Hoja de Trabajo
y Reporte de Resultados de Verificación de Especie. Finalmente, se reportan luego en el formulario IARECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis
Los Controles intralaboratoriales se reportan en el formulario IA-RECAT-PT-005-RE-003 Controles
Intralaboratoriales de Verificación de Especie.
8. ANEXOS: No Aplica.
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